JP2000270857A - ホスホリパーゼｄおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規な特性を有するホスホリパーゼＤ、及び
該ホスホリパーゼＤを産生する新規微生物を提供するこ
と。 【解決手段】 至適ｐＨが約５、至適温度が約４０℃、
分子量が約５.５万（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）、等電点が
ｐＨ約８であるホスホリパーゼＤ、及び該ホスホリパー
ゼＤを産生するストレプトマイセス属のホスホリパーゼ
Ｄ生産菌。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、大豆、卵黄、魚介
類に含まれているホスファチジルコリンやホスファチジ
ルエタノールアミンなどのリン脂質と各種水酸基をもつ
化合物とから、乳化剤、農薬、医薬、食品、工業用試薬
等に有用なリン脂質誘導体を製造するのに用いられるホ
スホリパーゼＤ、その製造方法及びホスホリパーゼＤを
産生する新規微生物に関するものである。

【従来の技術】ホスホリパーゼＤ（ＥＣ３．１．４．
４）は、グリセロリン脂質のホスファチジル基と塩基と
の間のエステル結合を加水分解してホスファチジン酸お
よび塩基を遊離させる酵素である。この酵素は、その起
源によっては加水分解反応以外に、グリセロール、セリ
ン、エタノール、フェノール等のアルコール性およびフ
ェノール性水酸基を有する化合物の共存下でグリセロリ
ン脂質のホスファチジル基を上記水酸基を有する化合物
に転移させ、新たなリン酸エステルを生成する反応（ホ
スファチジル基転移反応）を生起させる作用を有する。

【０００２】この酵素は、キャベツ、ニンジン、ホウレ
ンソウ、綿実等の植物体からの抽出あるいはストレプト
マイセス属、ミクロノスポラ属、ノカルディオプシス
属、アクチノマデューラ属又はノカルディア属等の微生
物を用いた発酵法により製造できることが知られてい
る。例えば、特公昭５２−３９９１８号公報、特公昭５
８−５２６３３号公報、特公平１−１２４７４号公報、
特公平８−８８６６号公報、特開昭５８−６３３８８号
公報、特開昭５８−６７１８３号公報、特開昭６０−１
６４４８３号公報、特開平４−１６６０８３号公報、ア
グリカルチュラル・バイオロジカル・ケミストリー（Ag
ricaltural Biological Chemistry)５１巻、９号、２５
１５−２５２４頁（１９８７年）、アグリカルチュラル
・バイオロジカル・ケミストリー（Agricaltural Biolo
gical Chemistry)５４巻、５号、１１８９−１１９３頁
（１９９０年）、バイオサイエンス・バイオテクノロジ
ー・バイオケミストリー（Bioscience Biotechnology B
iochemistry)５７巻、１１号、１９４６−１９４８頁
（１９９３年）およびバイオキミカ・バイオフィジカ・
アクタ（Biochimica et Biophysica Acta)１２５５巻、
２７３−２７９頁（１９９５年）を参照されたい。しか
しながら、これら従来の製造法により得られるホスホリ
パーゼＤは、それぞれ基質特異性、反応性などが異なっ
ており、新規な特性を有するホスホリパーゼＤの提供が
望まれている。又、従来の製造方法によると、ホスホリ
パーゼＤ産生能を有する菌株を用いた発酵法により作ら
れる培養液中に占める夾雑タンパク質の生成量が多く、
従って培養液中のホスホリパーゼＤの純度が低いといっ
た問題がある。そのため食品等の製造に用いる際には夾
雑タンパク質を取り除き、ホスホリパーゼＤを濃縮する
工程を設ける必要の有る場合があった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、新規な特性
を有するホスホリパーゼＤを提供することを目的とす
る。本発明は、又、ホスホリパーゼＤを高純度で得るこ
とができる製造法を提供することを目的とする。本発明
は、又、上記ホスホリパーゼＤを産生する新規微生物を
提供することを目的とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、ホスファチジ
ル基転移活性を示すホスホリパーゼＤを生産する能力を
有する多数の微生物について、ホスホリパーゼＤの生産
効率が高く、特にその培養物中にホスホリパーゼＤの占
める割合が高く、夾雑タンパク質の生産量が低い菌株を
探索する実験を繰り返した結果、岡山県上房郡賀陽町吉
川地区で採取した土壌から分離した新菌株ストレプトマ
イセス・エスピー（Streptomyces.sp.）ＴＨ−２が優れ
た性能を有し、これにより上記課題を有効に解決できる
との知見に基づいてなされたのである。すなわち、本発
明は、至適ｐＨが約５、至適温度が約４０℃、分子量が
約５.５万（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）、等電点がｐＨ約８
であることを特徴とするホスホリパーゼＤを提供する。
本発明は、又、上記ホスホリパーゼＤを産生するストレ
プトマイセス属のホスホリパーゼＤ生産菌を提供する。
本発明は、又、上記ホスホリパーゼＤ生産菌を培地で培
養し、産生したホスホリパーゼＤを回収することを特徴
とするホスホリパーゼＤの製造法を提供する。

【０００５】

【発明の実施の形態】本発明の至適ｐＨが約５、至適温
度が約４０℃、分子量が約５.５万（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
法）、等電点がｐＨ約８で、カルシウム又はマグネシウ
ムイオン要求性のホスホリパーゼＤを産生するストレプ
トマイセス属のホスホリパーゼＤ生産菌としては、スト
レプトマイセス・エスピーＴＨ−２株を用いるのが好ま
しい。この株は、工業技術院微生物工業技術研究所に平
成１１年３月２４日付けで寄託されており、その寄託番
号はＦＥＲＭ Ｐ−１７３２９号である。その菌学的特
徴を次に示す。 形態学的特徴 基性菌糸の存在 ＋ 気菌糸の存在 ＋ 輪生岐の有無 ＋ 胞子連鎖の形状 Verticilli（輪生状） 胞子の表面構造 判定不可^*1 集落表面の色調 Gray series メラニン色素の生成 微弱 集落裏面の色調 特徴なし yellowish brown, grayish yellow,grayish yellow−ol
ive brown,olive brown

【０００６】細胞壁のアミノ酸組成および糖組成 胞子壁タイプ Ｉ型 ＬＬ−ジアミノピメリン酸 ＋ meso−ジアミノピメリン酸 − ジアミノ酪酸 − グリシン ＋ アスパラギン酸 − オルニチン − リジン − アラビノース^*2 − ガラクトース^*2 − 主要キノン系 ＭＫ−９（Ｈ８）、−９（Ｈ６）、−
９（Ｈ４）

【０００７】 *1 胞子形成能の低下のため判定不可 *2 全菌体の硫酸加水分解物を用いて推定した。

【０００８】この菌株が、ストレプトマイセス属のStre
ptomyces septatus に属し、新菌株であることは、Nono
mura,H.: J.Ferment.Technol., 52, 78-92(1974)及びSh
irling.E.B. and Gotilleb.D.: Int.J.Syst.Bacterio
l., 22, 265-394(1972) に基づいて決定した。本発明の
ホスホリパーゼＤを製造するための、上記ストレプトマ
イセス・エスピーＴＨ−２の培養は、放線菌一般の培養
に通常採用される方法に従って行うことができるが、特
に好ましくは培地には炭素源として、例えばクエン酸、
コハク酸、ブドウ糖、果糖等を単独で、または組み合わ
せて適宜行うことができる。また窒素源として、例えば
硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素、硝酸ナト
リウム、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステ
ィープリカー、カザミノ酸、脱脂大豆粉、大豆タンパク
等を用いることができる。培地には、他に食塩、塩化カ
リウム、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、カ
リウム塩、鉄塩、マンガン塩、各種ビタミン、その他、
菌の生育やホスホリパーゼＤの生産促進に有効な物質を
適宜添加することができる。好ましい培地ｐＨは５〜
９、特に好ましくは６〜７である。培養法としては深部
培養法が好ましいが、固体培養法を採用することもでき
る。培養は約２０〜４０℃で行うことができるが、好ま
しい培養温度は３３〜３５℃である。好ましい培養期間
は温度、ｐＨ、培地によって異なるが、通常１〜６日程
度であり、目的物であるホスホリパーゼＤの生産量が最
大に達した頃に培養を停止する。

【０００９】培養終了後、培溶液から菌体を遠心分離あ
るいはろ別し、その遠心上精あるいはろ液をホスホリパ
ーゼＤ溶液として用いることができる。または、遠心上
精あるいはろ液からさらにホスホリパーゼＤを濃縮、採
取するにあたっては、例えば塩析、有機溶媒沈殿、透
析、限外ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、吸着ク
ロマトグラフィー、ゲルろ過、凍結乾燥、等電点電気泳
動等の方法を、後述するホスホリパーゼＤの理化学的性
質を考慮した条件下で採用すればよい。ストレプトマイ
セス・エスピーＴＨ−２の生産するホスホリパーゼＤは
以下の理化学的性質を有するものである。 （ａ）作用 加水分解反応 一般式（Ｉ）で示されるリン脂質を加水分解し、ホスフ
ァチジン酸と塩基とを遊離させる。

【００１０】

【化１】

【００１１】（式中、Ｒ₁ 及びＲ₂ はアシル基またはア
ルキル基、Ｘは１つ以上の水酸基を含む塩基の水酸基１
個を除いた後に残る有機基を表す。） ホスファチジル基転移反応 上記一般式（Ｉ）で表されるリン脂質のホスファチジル
基を下記一般式（II）で示される水酸基を有する化合物
の共存下、

【化２】 Ｒ₃ −ＯＨ （但し、Ｒ₃ はアルコール性またはフェノール性水酸基
に結合した有機基を表す。） 一般式（II）で表される化合物の水酸基にホスファチジ
ル基を転移させ、下記一般式（III)で示されるリン脂質
誘導体を生成する。

【００１２】

【化３】

【００１３】（但し、Ｒ₁ 、Ｒ₂ 及びＲ₃ は前記と同様
の基を表す。） 本発明の酵素の移転反応における反応性／加水分解にお
ける反応性の比が３倍以上であるのが好ましい。 （ｂ）至適ｐＨ：約5.０ （ｃ）ｐＨ安定性：ｐＨ４〜９で安定 （ｄ）至適温度：約４０℃ （ｅ）熱安定性： ｐＨ5.０およびリン脂質の非共存下において、６０℃、
１０分間の熱処理でも全く失活しない。 （ｆ）分子量： 5.５万（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による。） （ｇ）等電点： ｐＨ8.０（等電点電気泳道法による。） （ｈ）Ｎ末端アミノ酸配列：ＡｓｐＳｅｒＡｌａＡｓｐ
ＧｌｙＡｒｇＧｌｙＡｌａＰｒｏＨｉｓＬｅｕＡｓｐＡ
ｌａＶａｌＧｌｕＧｌｎＧｌｎＬｅｕＡｒｇＧｌｎ（エ
ドマン反応を用いた気相法Ｎ末端アミノ酸配列決定法に
よる。） （ｉ）カルシウム又はマグネシウム要求性 カルシウムイオン（５０マイクロモル／ｍｌ）共存下に
おけるジパルミトイルホスファチジルコリンの加水分解
活性を１００とした時の各種イオン存在下におけるホス
ホリパーゼＤの活性を表−１に示す。

【００１４】

【表１】 表−１ 添加化合物 相対活性 なし ０ ＣａＣｌ₂ １００ ＭｇＣｌ₂ １７３ ＺｎＣｌ₂ ０ ＣｄＣｌ₂ ０ ＭｎＣｌ₂ １１ ＦｅＣｌ₂ ３ ＣｏＣｌ₂ ２８ＥＤＴＡ １

【００１５】なお、ホスホリパーゼＤの加水分解活性は
基質であるリン脂質に作用してリン酸と塩基との間のエ
ステル結合を分解した際に生じる塩基を定量することに
よって求める。一般的には、ホスファチジルコリンを基
質とした場合に生じるコリンをコリンオキシダーゼおよ
びペルオキシダーゼを組み合わせて定量することにより
加水分解活性を決定することが通例である。しかし、本
発明ではより簡便な方法であるホスファチジルパラニト
ロフェノールを基質とした場合に生ずるパラニトロフェ
ノールを直接定量することにより加水分解活性を決め
た。なお、このホスファチジルパラニトロフェノールを
基質とした場合ではカルシウムあるいはマグネシウムを
活性に必要とはしない。この明細書に記載した酵素活性
は、アナリティカ・キミカ・アクタ（Analytica Chimic
a Acta）３０４巻、２４９−２５４項（１９９５年）記
載の方法により合成されるホスファチジルパラニトロフ
ェノールを基質として用いる下記の方法により測定され
たものであって、１分間に１μｍｏｌのパラニトロフェ
ノールを遊離する酵素活性を１ユニット（ｕ）としてい
る。

【００１６】加水分解活性測定法：，ホスファチジルパ
ラニトロフェノール３６０ｍｇに、ジエチルエーテル１
ｍｌ加え溶解した後、１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ7.５），１５ｍｌ、および１０％トリトン×１０
０を含む１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.５），
１５ｍｌを添加し、６０℃で溶液が透明になるまで加温
する。これを減圧下でジエチルエーテルを留去し基質保
存液（１６ｍＭホスファチジルパラニトロフェノール）
とする。基質保存液を、１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ7.５）で２ｍＭホスファチジルパラニトロフェノ
ールとなるように希釈したものを基質溶液とし、あらか
じめ３７℃で加温する。基質溶液９５０μＬに対してあ
らかじめ３７℃で加温した酵素液５０μＬを添加後、混
合しホスホリパーゼＤの加水分解反応によって遊離して
くるパラニトロフェノールを４０５ｎｍの吸光度を測定
することおよびパラニトロフェノールのミリモル分子吸
光係数１8.４５から、１分間あたりのパラニトロフェノ
ール生成量を換算し、酵素活性値を決定する。

【００１７】また、ホスホリパーゼＤの転移活性は、以
下のようにして求めた。ホスファチジルパラニトロフェ
ノールを１ｍｌあたり１６ｍｇの割合で、ベンゼンに溶
解し、基質溶液（２０ｍＭホスファチジルパラニトロフ
ェノール）とする。１サンプルにつき、この基質溶液0.
２ｍｌに２Ｍエタノールを含む２０ｍＭ酢酸バッファー
（ｐＨ5.０）溶液0.１ｍｌおよび２０ｍｇ／ｍｌの牛ア
ルブミン溶液0.０５ｍｌを混合し、１５分間超音波にて
分散し、エマルジョン化する。これを３７℃で５分間加
温した後、酵素溶液0.０５ｍｌを加え、反応を開始す
る。これと平行して、酵素溶液のかわりにパラニトロフ
ェノールを1.０、0.８、0.６、0.４、0.２、0.０μモル
含む溶液を各々添加した系列をつくり検量線用試料とす
る。３７℃、１０分間反応を行った後、１Ｎ塩酸溶液0.
１ｍｌを加え反応を停止した後、１Ｎ水酸化ナトリウム
溶液0.１５ｍｌおよびクロロホルム／メタノール＝３／
１溶液0.４ｍｌを加え混合後、４℃で１０分間遠心分離
する。水相を0.０２ｍｌとり、0.１Ｍトリス−塩酸バッ
ファー（ｐＨ8.０）0.１８ｍｌと混合し、マイクロプレ
ートリーダー等の手段により４０５ｎｍの吸光度を測定
する。別途作成した検量線用試料の吸光度値から検量線
を作成し、転移反応により遊離したパラニトロフェノー
ル量を換算し、転移活性を決定する。なおこの反応での
１ユニットは１分間あたり１マイクロモルのパラニトロ
フェノールを遊離させる酵素量と定義する。

【００１８】

【発明の効果】本発明によれば、高いホスファチジル基
転移活性を示す新規なホスホリパーゼＤが提供される。
又、本発明の製造法によれば、上述のように従来の製造
法により得られるものと比較して、きわめて高い純度の
ホスホリパーゼＤをきわめて容易に製造することができ
る。すなわち、従来報告されているホスホリパーゼＤの
生産菌株の培養物１Ｌあたりの総タンパク質に対するホ
スホリパーゼＤの含有率は、例えばアグリカルチュラル
・バイオロジカル・ケミストリー（AgricalturalBiolog
ical Chemistry)５１巻、９号、２５１５−２５２４項
（１９８７年）記載の方法によれば、培養物１Ｌあたり
の遠心上精のタンパク濃度が３１５７ｍｇ／Ｌであり、
そのうちホスホリパーゼＤの占める割合は、ホスホリパ
ーゼＤ活性が５０２０ｕ／Ｌであること及び精製された
ホスホリパーゼＤの比活性が６８８ｕ／ｍｇであること
から換算すると、0.２３％と見積もられる。アグリカル
チュラル・バイオロジカル・ケミストリー（Agricaltur
al Biological Chemistry)５４巻、５号、１１８９−１
１９３項（１９９０年）記載の方法によれば、培養物１
Ｌあたりの遠心上精のタンパク濃度が２８２ｍｇ／Ｌで
あり、そのうちホスホリパーゼＤの占める割合は、ホス
ホリパーゼＤ活性が１９６２ｕ／Ｌであること及び精製
されたホスホリパーゼＤの比活性が２３９０ｕ／ｍｇで
あることから換算すると、0.２９％と見積もられる。バ
イオサイエンス・バイオテクノロジー・バイオケミスト
リー（Bioscience Biotechnology Biochemistry)５７
巻、１１号、１９４６−１９４８項（１９９３年）記載
の方法によれば、培養物１Ｌあたりの遠心上精のタンパ
ク濃度が２８６ｍｇ／Ｌであり、そのうちホスホリパー
ゼＤの占める割合は、ホスホリパーゼＤ活性が３２００
ｕ／Ｌであること及び精製されたホスホリパーゼＤの比
活性が１４３6.８ｕ／ｍｇであることから換算すると、
0.７８％と見積もられる。また、バイオキミカ・バイオ
フィジカ・アクタ（Biochimica et Biophysica Acta)１
２５５巻、２７３−２７９項（１９９５年）に記載の２
種の菌株を用いた方法によれば、培養物１Ｌあたりの遠
心上精のタンパク濃度が５２００ｍｇ／Ｌあるいは６６
００ｍｇ／Ｌであり、そのうちホスホリパーゼＤの占め
る割合は、ホスホリパーゼＤ活性が１０６７ｕ／Ｌある
いは１１６８ｕ／Ｌであること及び精製されたホスホリ
パーゼＤの比活性が４1.７２ｕ／ｍｇあるいは４4.９０
ｕ／ｍｌであることから換算すると、0.４９％あるいは
0.３９％となる。このように従来報告されているホスホ
リパーゼＤの製造法は、いずれもその培養物中の総タン
パク質に占めるホスホリパーゼＤの含有率は１％未満と
いった低い水準のものであるから、最大で１３％以上も
の高い含有率を占める本発明の製造法によれば、高いホ
スファチジル基転移活性を示すホスホリパーゼＤの製造
能率の飛躍的な向上が可能になる。次に本発明を実施例
により説明する。

【００１９】

【実施例】実施例１ 培地として0.５％ブドウ糖、0.２％ＫＨ₂ ＰＯ₄ 、0.０
５％ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ ₂ Ｏ、0.５％ペプトン、0.５％酵
母エキスを含むｐＨ7.０のものを用意し、その１００ｍ
ｌを５００ｍｌ容の三角フラスコに入れ、１２０℃、１
５分滅菌後ＴＨ−２株前培養液３ｍｌ（上記組成の培地
にて３７℃１２５ｒｐｍで３ないし４日間培養したも
の）をフラスコ１本につき殖菌し、計１０本分をロータ
リーシェーカーにて３４℃、１２５ｒｐｍ、で通気攪拌
培養を２４時間行った。菌体外に分泌されたホスホリパ
ーゼＤの加水分解活性を測定したところ、１８０ｕ／Ｌ
であり、その際のタンパク質濃度は１２０ｍｇ／Ｌであ
った。その培養物を遠心（６０００ｒｐｍ、３０分、４
℃）し、その上精を７０％飽和硫酸アンモニウムにより
ホスホリパーゼＤ活性を含む画分を濃縮した。生成した
沈殿を５ｍＭトリス−マレイン酸−水酸化ナトリウム緩
衝液（ｐＨ6.５）に溶解し、同緩衝液に対して透析し
た。その後、同じ緩衝液で平衡化したハイロードＳＰ−
セファロースＨＰ２６／１０カラム（アマシャムファル
マシアバイオテク社製）に通し、不純物であるタンパク
質および色素の大半を素通りさせた。吸着したホスホリ
パーゼＤは塩化ナトリウム濃度を０Ｍから0.２Ｍまで変
化させる直線濃度勾配法によりホスホリパーゼＤ画分を
溶出した。得られたホスホリパーゼＤは、電気泳動的に
単一まで精製され、精製品の加水分解活性の比活性は１
1.１４ｕ／ｍｇであった。上記精製工程におけるホスホ
リパーゼＤの収量は3.３ｍｇであり、その回収率は約２
０％であった。上記精製工程で用いた培養物のタンパク
濃度は１２０ｍｇ／Ｌであり、培養物中に含まれるホス
ホリパーゼＤ加水分解活性は１８０ｕ／Ｌであることか
ら、精製ホスホリパーゼＤの比活性から換算すれば、培
養物には１6.１５ｍｇ／Ｌの濃度でホスホリパーゼＤが
含まれ、培養物中の総タンパク質に占めるホスホリパー
ゼＤは約１3.４６％と見積もられた。

【００２０】実施例２ 培地として、0.５％ブドウ糖、0.５％クエン酸２ナトリ
ウム、0.２％ＫＨ₂ ＰＯ₄ 、0.０５％ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ
₂ Ｏ、0.５％ペプトン、0.５％酵母エキスを含むｐＨ7.
０のものを用意し、その１００ｍｌを５００ｍｌ容の三
角フラスコに入れ、１２０℃、１５分滅菌後ＴＨ−２株
前培養液３ｍｌを殖菌し、ロータリーシェーカーにて３
４℃、１２５ｒｐｍ、で通気攪拌培養を行った。経時的
に菌体外に分泌されたホスホリパーゼＤ加水分解活性を
測定したところ、９６時間目に最大活性を示し、その値
は３８０ｕ／Ｌであった。また、その際のタンパク質濃
度は４５０ｍｇ／Ｌであった。ホスホリパーゼＤの加水
分解の比活性が１1.１４ｕ／ｍｇであることから、培養
物には３4.１ｍｇ／Ｌの濃度でホスホリパーゼＤが含ま
れ、培養物中の総タンパク質に占めるホスホリパーゼＤ
は約7.６％と見積もられた。また、炭素源を0.５％ブド
ウ糖のみを用い、それ以外の組成は上記のもので同様な
条件で培養した場合、経時的に菌体外に分泌されたホス
ホリパーゼＤ活性を測定したところ、４８時間目に最大
活性を示し、そのホスホリパーゼＤ加水分解活性は２４
０ｕ／Ｌであり、その際のタンパク質濃度は４６０ｍｇ
／Ｌであった。ホスホリパーゼＤの加水分解の比活性が
１1.１４ｕ／ｍｇであることから、培養物には２1.６ｍ
ｇ／Ｌの濃度でホスホリパーゼＤが含まれ、培養物中の
総タンパク質に占めるホスホリパーゼＤは約4.７％と見
積もられた。

【００２１】実施例３ 実施例１で得た精製ホスホリパーゼＤを用いて、至適ｐ
Ｈにおける、本酵素の加水分解反応および転移反応にお
ける１秒あたりのターンオーバーナンバー（ｋｃａｔ）
およびＫｍを測定した。その結果、加水分解反応におい
て、ｋｃａｔは９7.０ｓｅｃ^-1であり、ホスファチジル
パラニトロフェノールに対するＫｍは1.０２ｍＭであっ
た。この値から加水分解反応における酵素の反応性を示
す指標であるｋｃａｔ／Ｋｍ値は、９5.４ｍＭ^-1・ｓｅ
ｃ^-1となった。一方、転移反応において、ｋｃａｔは２
４4.０ｓｅｃ^-1であり、ホスファチジルパラニトロフェ
ノールに対するＫｍは0.６８ｍＭであった。この値から
転移反応における酵素の反応性を示す指標であるｋｃａ
ｔ／Ｋｍ値は、３６1.０ｍＭ^-1・ｓｅｃ^-1となった。ま
た、この転移反応におけるエタノールに対するＫｍは１
４1.２ｍＭであった。加水分解および転移反応における
ｋｃａｔ／Ｋｍ値を比較すると、ＴＨ−２株由来の精製
ホスホリパーゼＤは加水分解における反応性と比べ約3.
８倍転移における反応性が高いことが判明した。

【００２２】比較例１ 電気泳動的に単一な純度をもつ、旭化成工業社製ＰＬＤ
Ｐ（ホスホリパーゼＤＰ）を用いて、至適ｐＨにおけ
る、実施例３と同様な試験を行った。加水分解反応およ
び転移反応における１秒あたりのターンオーバーナンバ
ー（ｋｃａｔ）およびＫｍを測定した。その結果、加水
分解反応において、ｋｃａｔは６0.９ｓｅｃ^-1であり、
ホスファチジルパラニトロフェノールに対するＫｍは0.
４２ｍＭであった。この値から加水分解反応における酵
素の反応性を示す指標であるｋｃａｔ／Ｋｍ値は、１４
5.０ｍＭ^-1・ｓｅｃ^-1となった。一方、転移反応におい
て、ｋｃａｔは２５4.５ｓｅｃ^-1であり、ホスファチジ
ルパラニトロフェノールに対するＫｍは2.１７ｍＭであ
った。この値から転移反応における酵素の反応性を示す
指標であるｋｃａｔ／Ｋｍ値は、１１7.５ｍＭ^-1・ｓｅ
ｃ^-1となった。また、この転移反応におけるエタノール
に対するＫｍは２８7.５ｍＭであった。加水分解および
転移反応におけるｋｃａｔ／Ｋｍ値を比較すると、ＰＬ
ＤＰは転移における反応性が、加水分解における反応性
の約0.８倍となることが判明した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者 萩下 大郎 岡山県上房郡賀陽町吉川7549−１ 岡山県 生物科学総合研究所内 (72)発明者 金田 輝之 岡山県赤磐郡熊山町徳富363番地 備前化 成株式会社内 (72)発明者 井上 良計 岡山県赤磐郡熊山町徳富363番地 備前化 成株式会社内 Ｆターム(参考） 4B050 CC01 DD02 FF03E FF04E FF05E FF12E FF13E LL01 LL02 LL10 4B065 AA50X AC14 AC15 CA31 CA41 CA44 CA47 CA60

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 至適ｐＨが約５、至適温度が約４０℃、
   分子量が約5.５万（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）、等電点がｐ
   Ｈ約８であることを特徴とするホスホリパーゼＤ。
2. 【請求項２】 請求項１記載のホスホリパーゼＤを産生
   するストレプトマイセス属のホスホリパーゼＤ生産菌。
3. 【請求項３】 請求項１記載のホスホリパーゼＤ生産菌
   を培地で培養し、産生したホスホリパーゼＤを回収する
   ことを特徴とするホスホリパーゼＤの製造法。