JPH03123493A - ジアシルグリセロリン脂質の加水分解法 - Google Patents
ジアシルグリセロリン脂質の加水分解法Info
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明は、ジアシルグリセロリン脂質を加水分解する方
法、詳しくはジアシルグリセロリン脂質の脱アシル化に
より、モノアシルグリセロリン脂質を得る方法に関する
。
法、詳しくはジアシルグリセロリン脂質の脱アシル化に
より、モノアシルグリセロリン脂質を得る方法に関する
。
(従来の技術)
ホスホリパーゼA2は、系統名ホスファタイド2−アシ
ルバイトラーゼとも呼ばれ、ジアシルグリセロリン脂質
の5n−2位にエステル結合している脂肪酸を、位置特
異的に加水分解する酵素である。
ルバイトラーゼとも呼ばれ、ジアシルグリセロリン脂質
の5n−2位にエステル結合している脂肪酸を、位置特
異的に加水分解する酵素である。
豚膵臓由来の精製ホスホリパーゼA2活性の測定は、卵
黄1個を蒸留水100m1に懸濁した液1〇−に、酵素
液、塩化カルシウム溶液(最終濃度6×10−’M)お
よびデオキシコール酸(最終濃度2.7XIO−’M)
を加えて全量を3Qm1.とし、pHスタ・ノドを用い
てpH8,0,40℃にて0.IN水酸化ナトリウムで
滴定するCG、H,de Haasら、Biochim
、Biophys。
黄1個を蒸留水100m1に懸濁した液1〇−に、酵素
液、塩化カルシウム溶液(最終濃度6×10−’M)お
よびデオキシコール酸(最終濃度2.7XIO−’M)
を加えて全量を3Qm1.とし、pHスタ・ノドを用い
てpH8,0,40℃にて0.IN水酸化ナトリウムで
滴定するCG、H,de Haasら、Biochim
、Biophys。
Acta、 159.103. (1968)) 、こ
の方法の分解条件は緩衝液でpH8に調整し、塩化カリ
ウム濃度を61に調整する必要がある。そのため、この
方法は乳化系反応であり反応生成物の精製が難しい。
の方法の分解条件は緩衝液でpH8に調整し、塩化カリ
ウム濃度を61に調整する必要がある。そのため、この
方法は乳化系反応であり反応生成物の精製が難しい。
合成されたジアシルグリセロリン脂質に関し、ホスファ
チジルエタノールアミン1100nがホスホリパーゼA
2.5mM塩化カルシウム、0.3%デオキシコール酸
ナトリウム、50mMグリシン−水酸化すトリウム緩衝
液(pH9,0)共存下に30〜120分反応させてい
る(T、Teramotoら、J、Biochem、
(Tokyo) 193、1353. (1983))
。この方法の分解条件も緩衝液でpH9に調整し、塩化
カルシウム濃度を5mMに調整する必要がある。そのた
め、この方法も乳化系反応であり、反応生成物の精製が
難しい。
チジルエタノールアミン1100nがホスホリパーゼA
2.5mM塩化カルシウム、0.3%デオキシコール酸
ナトリウム、50mMグリシン−水酸化すトリウム緩衝
液(pH9,0)共存下に30〜120分反応させてい
る(T、Teramotoら、J、Biochem、
(Tokyo) 193、1353. (1983))
。この方法の分解条件も緩衝液でpH9に調整し、塩化
カルシウム濃度を5mMに調整する必要がある。そのた
め、この方法も乳化系反応であり、反応生成物の精製が
難しい。
天然脂質原料から単離されたジアシルグリセロリン脂質
の加水分解法に関しては、ホスファチジン酸とカルシオ
リピンが検討されている。ヘビ毒ホスホリパーゼA2に
よるホスファチジン酸の加水分解は、ホスファチジン酸
と反応促進のためのレシチンを先ずエチルエーテルに溶
かす。ヘビ毒ホスホリパーゼA2と塩化カルシウムを0
.1Mトリス−塩酸緩衝液(p)17.5)に溶かした
酵素溶液を加え、37℃で1時間反応させている(H,
Okuyamaら、J、Biol、Chem、、 24
7.1414. (1972) ) 、ハブ毒ホスホリ
パーゼA2によるカルシオリピンの加水分解は、カルシ
オリピンをエチルエーテルに溶かし、ハブ毒ホスホリパ
ーゼA2と酢酸カルシウムを0.1Mホウ酸ナトリウム
(pH7,’o)に?容力)したものを加え、激しく撹
拌しながら27℃で8時間反応させている(H,Oku
yamaら、J、Biochem、+ 37+529
(1965))。これらの加水分解条件は緩衝液でpH
を調整し、さらにカルシウム塩濃度を調整する必要があ
る。そのため、これらの方法も乳化系反応であり、反応
生成物の精製が難しい。
の加水分解法に関しては、ホスファチジン酸とカルシオ
リピンが検討されている。ヘビ毒ホスホリパーゼA2に
よるホスファチジン酸の加水分解は、ホスファチジン酸
と反応促進のためのレシチンを先ずエチルエーテルに溶
かす。ヘビ毒ホスホリパーゼA2と塩化カルシウムを0
.1Mトリス−塩酸緩衝液(p)17.5)に溶かした
酵素溶液を加え、37℃で1時間反応させている(H,
Okuyamaら、J、Biol、Chem、、 24
7.1414. (1972) ) 、ハブ毒ホスホリ
パーゼA2によるカルシオリピンの加水分解は、カルシ
オリピンをエチルエーテルに溶かし、ハブ毒ホスホリパ
ーゼA2と酢酸カルシウムを0.1Mホウ酸ナトリウム
(pH7,’o)に?容力)したものを加え、激しく撹
拌しながら27℃で8時間反応させている(H,Oku
yamaら、J、Biochem、+ 37+529
(1965))。これらの加水分解条件は緩衝液でpH
を調整し、さらにカルシウム塩濃度を調整する必要があ
る。そのため、これらの方法も乳化系反応であり、反応
生成物の精製が難しい。
(発明が解決しようとする課題)
前記のような従来から知られている加水分解法では処理
できる基質量が少ない。また、入手の難しい高価な加水
分解酵素を使用したり、pHやカルシウム塩濃度を厳密
にコントロールしながら反応させなければならず、反応
生成物も純粋なものが得難く大量生産出来ないという難
点があった。
できる基質量が少ない。また、入手の難しい高価な加水
分解酵素を使用したり、pHやカルシウム塩濃度を厳密
にコントロールしながら反応させなければならず、反応
生成物も純粋なものが得難く大量生産出来ないという難
点があった。
従って現在、入手が容易で安価で、しかも加水分解能の
高い天然起源の酵素を利用し、工業的に大量生産が可能
で、しかも反応生成物の分取が容易なモノアシルグリセ
ロリン脂質の製造法が求められている。
高い天然起源の酵素を利用し、工業的に大量生産が可能
で、しかも反応生成物の分取が容易なモノアシルグリセ
ロリン脂質の製造法が求められている。
本発明は、加水分解能を有する天然起源の安価な酵素を
用いることにより、化学合成又は天然脂質原料から単離
して得たジアシルグリセロリン脂質を加水分解して、モ
ノアシルグリセロリン脂質を工業的に大量生産する新規
な方法を提供しようとするものである。
用いることにより、化学合成又は天然脂質原料から単離
して得たジアシルグリセロリン脂質を加水分解して、モ
ノアシルグリセロリン脂質を工業的に大量生産する新規
な方法を提供しようとするものである。
(課題を解決するための手段)
本発明は、化学合成又は天然脂質原料から単離したホス
ファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、
ホスファチジルイノシトールまたはホスファチジルグリ
セロールを加水分解する際に、豚膵臓由来のホスホリパ
ーゼA2酵素を用いて、非イオン性無極性有機溶媒に0
.01〜2容量%の水を添加した反応液中で反応させ、
モノアシルグリセロリン脂質を得ることを特徴とする。
ファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、
ホスファチジルイノシトールまたはホスファチジルグリ
セロールを加水分解する際に、豚膵臓由来のホスホリパ
ーゼA2酵素を用いて、非イオン性無極性有機溶媒に0
.01〜2容量%の水を添加した反応液中で反応させ、
モノアシルグリセロリン脂質を得ることを特徴とする。
本発明に用いられるホスホリパーゼA!酵素は、基質と
するジアシルグリセロリン脂質の範囲の広さ、上記の有
機溶媒系反応によるホスホリパーゼA2活性の強さと条
件の簡易さ、酵素の価格および除去の簡便さから豚膵臓
由来のものである。ホスホリパーゼAt活性を示す酵素
はホスホリパーゼA!、パンクレアチン、微生物起源の
リパーゼが知られているが、ホスファチジルコリン以外
の酸性ジアシルグリセロリン脂質に対する加水分解能が
著しく低い。また、ホスホリパーゼA2は踊乳動物の各
組織、肝、赤血球、血小板、多形核白血球、腸水肝癌細
胞などのほか、大腸菌、真菌などの微生物、蛇毒に存在
している。
するジアシルグリセロリン脂質の範囲の広さ、上記の有
機溶媒系反応によるホスホリパーゼA2活性の強さと条
件の簡易さ、酵素の価格および除去の簡便さから豚膵臓
由来のものである。ホスホリパーゼAt活性を示す酵素
はホスホリパーゼA!、パンクレアチン、微生物起源の
リパーゼが知られているが、ホスファチジルコリン以外
の酸性ジアシルグリセロリン脂質に対する加水分解能が
著しく低い。また、ホスホリパーゼA2は踊乳動物の各
組織、肝、赤血球、血小板、多形核白血球、腸水肝癌細
胞などのほか、大腸菌、真菌などの微生物、蛇毒に存在
している。
本発明に用いられる豚膵臓を酵素源とするホスホリパー
ゼA2は、精製法がハースら(Biochim。
ゼA2は、精製法がハースら(Biochim。
Biophys、Acta、 159.103. (1
968))によって確立された活性の高い安価な市販品
もあり、これらを利用することが出来る。市販品のホス
ホリパーゼA2にはヘビ毒由来、ハチ毒由来および細菌
由来のものがあるが、非常に高価である。しかも本発明
の加水分解条件では、微量の基質を処理出来るが、大量
の基質では高い分解率は得られない。−方、豚膵臓由来
のホスホリパーゼA2は曙ないしg単位までの同一条件
で分解が出来、酵素から混入してくる不純物もなく、あ
っても節単な処理法によって反応生成物から除去出来る
。
968))によって確立された活性の高い安価な市販品
もあり、これらを利用することが出来る。市販品のホス
ホリパーゼA2にはヘビ毒由来、ハチ毒由来および細菌
由来のものがあるが、非常に高価である。しかも本発明
の加水分解条件では、微量の基質を処理出来るが、大量
の基質では高い分解率は得られない。−方、豚膵臓由来
のホスホリパーゼA2は曙ないしg単位までの同一条件
で分解が出来、酵素から混入してくる不純物もなく、あ
っても節単な処理法によって反応生成物から除去出来る
。
本発明における加水分解は、例えば化学合成又は天然脂
質原料から単離したジアシルグリセロリン脂質1部を、
後述する有機溶媒10〜500部に溶解し、これにホス
ホリパーゼAzを加えて行われる。酵素量は通常ジアシ
ルグリセロリン脂質1gに対して0.01〜5.0g程
度でよい。反応温度は、10℃から使用する有機溶媒の
沸点の範囲で任意に選択できるが、反応効率を考えると
、室温から50℃までの温度が望ましい。また、この方
法は豚膵臓由来のホスホリパーゼA2の熱安定性が良<
、70℃でも活性を示す。
質原料から単離したジアシルグリセロリン脂質1部を、
後述する有機溶媒10〜500部に溶解し、これにホス
ホリパーゼAzを加えて行われる。酵素量は通常ジアシ
ルグリセロリン脂質1gに対して0.01〜5.0g程
度でよい。反応温度は、10℃から使用する有機溶媒の
沸点の範囲で任意に選択できるが、反応効率を考えると
、室温から50℃までの温度が望ましい。また、この方
法は豚膵臓由来のホスホリパーゼA2の熱安定性が良<
、70℃でも活性を示す。
反応時間は酵素量や反応温度によって異なるが、通常1
〜10時間程度である。また、従来のホスホリパーゼA
2を用いるジアシルグリセロリン脂質の有機溶媒と大量
の緩衝液やカルシウム塩溶液を使用する界面反応におい
ては、撹拌速度が反応進行率に大きな影響を与えたが、
本発明では通常60〜150rpmの低速撹拌で充分に
反応が進行する。また、従来のホスホリパーゼA2の反
応では、反応進行にカルシウム塩溶液やpH調整用の緩
衝液の添加が必要であったが、本発明では、これらの溶
液を必要としないため反応終了後の精製も容易である。
〜10時間程度である。また、従来のホスホリパーゼA
2を用いるジアシルグリセロリン脂質の有機溶媒と大量
の緩衝液やカルシウム塩溶液を使用する界面反応におい
ては、撹拌速度が反応進行率に大きな影響を与えたが、
本発明では通常60〜150rpmの低速撹拌で充分に
反応が進行する。また、従来のホスホリパーゼA2の反
応では、反応進行にカルシウム塩溶液やpH調整用の緩
衝液の添加が必要であったが、本発明では、これらの溶
液を必要としないため反応終了後の精製も容易である。
本発明における酵素反応は加水分解反応であるため、加
水分解に必要な最少量の水の添加が望ましい。水は有機
溶媒中に0.01〜2容量%になるように添加する。こ
の範囲の水量では、反応終了後の溶媒による再沈、乾燥
濃縮、濾過剤処理等の精製手段により容易に脱水され、
特別な脱水工程を必要としない。水の添加が0.01容
量%未満では充分に加水分解が行われず、2容量%を超
えると、水除去に伴う反応液の発泡現象、反応生成物の
損失等を生じ、また、余分な脱水工程が必要になり、コ
ストと時間がかかってしまう。
水分解に必要な最少量の水の添加が望ましい。水は有機
溶媒中に0.01〜2容量%になるように添加する。こ
の範囲の水量では、反応終了後の溶媒による再沈、乾燥
濃縮、濾過剤処理等の精製手段により容易に脱水され、
特別な脱水工程を必要としない。水の添加が0.01容
量%未満では充分に加水分解が行われず、2容量%を超
えると、水除去に伴う反応液の発泡現象、反応生成物の
損失等を生じ、また、余分な脱水工程が必要になり、コ
ストと時間がかかってしまう。
本発明に用いられる非イオン性無極性有機溶媒は、エー
テル、炭化水素、エステルの群から選ばれる。具体例と
しては、エーテルとしてジエチルエーテル、イソプロピ
ルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン等、炭化
水素としてn−ヘキサン、n−へブタン、石油エーテル
、シクロヘキサン等、エステルとして酢酸メチル、酢酸
エチル等が挙げられる。これらの有機溶媒は非イオン性
無極性溶媒であり、酵素は、これら溶媒との接触によっ
ても活性が低下しない。また基質であるジアシルグリセ
ロリン脂質に対してもある程度溶解することが出来る。
テル、炭化水素、エステルの群から選ばれる。具体例と
しては、エーテルとしてジエチルエーテル、イソプロピ
ルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン等、炭化
水素としてn−ヘキサン、n−へブタン、石油エーテル
、シクロヘキサン等、エステルとして酢酸メチル、酢酸
エチル等が挙げられる。これらの有機溶媒は非イオン性
無極性溶媒であり、酵素は、これら溶媒との接触によっ
ても活性が低下しない。また基質であるジアシルグリセ
ロリン脂質に対してもある程度溶解することが出来る。
この溶媒中で反応物の親水性の強いモノアシルグリセロ
リン脂質は微少の水層に移行し、恰もこの水は相間移動
触媒の役割を果たすことが出来る。
リン脂質は微少の水層に移行し、恰もこの水は相間移動
触媒の役割を果たすことが出来る。
これら以外の有機溶媒では、例えば、ハロゲン化炭化水
素やアプロチックな非イオン性極性溶媒では酵素の活性
が発揮出来ない。ジクロロエタン、クロロホルム等のハ
ロゲン化炭化水素中では酵素が失活する。メタノール、
エタノール等は酵素の阻害剤であり、アセトン、アセト
ニトリル、ジメチルスルホキサイド、ジメチルホルムア
ミド等の非イオン性極性溶媒は蛋白質である酵素を一部
溶解し、酵素の構造を変化させ活性を失わせる恐れがあ
る。
素やアプロチックな非イオン性極性溶媒では酵素の活性
が発揮出来ない。ジクロロエタン、クロロホルム等のハ
ロゲン化炭化水素中では酵素が失活する。メタノール、
エタノール等は酵素の阻害剤であり、アセトン、アセト
ニトリル、ジメチルスルホキサイド、ジメチルホルムア
ミド等の非イオン性極性溶媒は蛋白質である酵素を一部
溶解し、酵素の構造を変化させ活性を失わせる恐れがあ
る。
本発明において用いるホスファチジルエタノールアミン
、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール
、ホスファチジルグリセロールは化学合成、天然脂質原
料がら単離したもの及び市販の純粋な試薬が使われる。
、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール
、ホスファチジルグリセロールは化学合成、天然脂質原
料がら単離したもの及び市販の純粋な試薬が使われる。
これらの原料は脂質化学上、グリセロリン脂質に属し、
特にアシル基を2個有するジアシルグリセロリン脂質が
対象となる。
特にアシル基を2個有するジアシルグリセロリン脂質が
対象となる。
ホスファチジルエタノールアミンは卵黄脂質、ラット肝
脂質、大豆粗リン脂質からケイ酸カラムクロマトグラフ
ィーを用いてコリン含有リン脂質溶出後に単離できる。
脂質、大豆粗リン脂質からケイ酸カラムクロマトグラフ
ィーを用いてコリン含有リン脂質溶出後に単離できる。
〔例えばR,Aneja ら、Bio−chin+、B
iophys、Acta、 ■7.439 (196
9)) 、また、無水フタル酸処理する半合成法CA、
J、SIotboomら、Chem、Phys、Lip
ids+ 5.301 (1970) )や、トリチル
化誘導体を用いる全合成法(A、Hermetterら
、Chem、Phys、Lipids、 43.69
(1987) )によっても合成品が得られる。
iophys、Acta、 ■7.439 (196
9)) 、また、無水フタル酸処理する半合成法CA、
J、SIotboomら、Chem、Phys、Lip
ids+ 5.301 (1970) )や、トリチル
化誘導体を用いる全合成法(A、Hermetterら
、Chem、Phys、Lipids、 43.69
(1987) )によっても合成品が得られる。
ホスファチジルセリンは牛脳脂質の粗ケファリン分画か
ら重ソウ処理ケイ酸カラムクロマトグラフィーやDEA
E−セルロースカラムクロマトグラフィーでカリウム塩
として単離出来る〔例えば、特開昭63−229783
号、ホスファチジルセリンの製造方法〕。また、アミノ
酸誘導体を用いる化学的合成法(A、J、Slotbo
omら、Chem、Phys、Lipids、 5゜3
01 (1970))によっても合成品が得られる。
ら重ソウ処理ケイ酸カラムクロマトグラフィーやDEA
E−セルロースカラムクロマトグラフィーでカリウム塩
として単離出来る〔例えば、特開昭63−229783
号、ホスファチジルセリンの製造方法〕。また、アミノ
酸誘導体を用いる化学的合成法(A、J、Slotbo
omら、Chem、Phys、Lipids、 5゜3
01 (1970))によっても合成品が得られる。
ホスファチジルイノシトールは、乾燥パン酵母にトルエ
ンとイソプロパツールで処理した後の抽出物をケイ酸カ
ラムクロマトグラフィーにかけ、グラジェント溶出で単
離出来る。同様の方法を用いて、麦芽、牛脳、肝臓、大
豆等からも単離出来る。また、ミオイノシトールの水酸
基をベンジル基で保護する半合成法〔特開昭63−33
388号、ホスファチジルイノシトール類の製造方法〕
によっても合成品が得られる。
ンとイソプロパツールで処理した後の抽出物をケイ酸カ
ラムクロマトグラフィーにかけ、グラジェント溶出で単
離出来る。同様の方法を用いて、麦芽、牛脳、肝臓、大
豆等からも単離出来る。また、ミオイノシトールの水酸
基をベンジル基で保護する半合成法〔特開昭63−33
388号、ホスファチジルイノシトール類の製造方法〕
によっても合成品が得られる。
ホスファチジルグリセロールは大豆、卵黄、ダラム陽性
菌等から抽出した脂質を、DEAE−セルロースカラム
クロマトグラフィーにかけたり、さらにケイ酸カラムク
ロマトグラフィーを併用することで単離出来る。また、
グリセロールの存在下で、ホスファチジルコリン、ホス
ファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリンな
どを基質として、ホスホリパーゼDを働かせ、アルコー
リシスさせる生合成法CD、M、Michaelson
ら、Bio−chemistry、 12.2637
(1973))によっても合成品が得られる。
菌等から抽出した脂質を、DEAE−セルロースカラム
クロマトグラフィーにかけたり、さらにケイ酸カラムク
ロマトグラフィーを併用することで単離出来る。また、
グリセロールの存在下で、ホスファチジルコリン、ホス
ファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリンな
どを基質として、ホスホリパーゼDを働かせ、アルコー
リシスさせる生合成法CD、M、Michaelson
ら、Bio−chemistry、 12.2637
(1973))によっても合成品が得られる。
本発明において用いるジアシルグリセロリン脂質の水素
添加物も原料の対象となる。水素添加物はジアシルグリ
セロリン脂質に触媒として5または10%Pd/C1溶
媒としてn−ヘキサン/エタノール(4:1)を用い、
水素圧10kg/a(、温度50〜55℃、反応時間2
〜4時間の反応条件〔原節子ら、日本栄養・食糧学会誌
、共、 391 (1986))により、容易に調製さ
れる。
添加物も原料の対象となる。水素添加物はジアシルグリ
セロリン脂質に触媒として5または10%Pd/C1溶
媒としてn−ヘキサン/エタノール(4:1)を用い、
水素圧10kg/a(、温度50〜55℃、反応時間2
〜4時間の反応条件〔原節子ら、日本栄養・食糧学会誌
、共、 391 (1986))により、容易に調製さ
れる。
(発明の効果)
本発明によれば、下記のような効果が得られる。
+11 温和な反応条件で収率良く目的化合物が製造
できる。
できる。
(2)反応液中に無機物を添加しないため、反応生成物
の精製が容易である。
の精製が容易である。
(3)水添加量が微量なため、特別な脱水工程を必要と
せず、また均一系に近い反応のため、反応時に激しい撹
拌を必要としない。
せず、また均一系に近い反応のため、反応時に激しい撹
拌を必要としない。
(4)本発明で得られるモノアシルグリセロリン脂質の
一つであるリゾホスファチジルセリンは、免疫グロブリ
ンEの関与するヒスタミン遊離作用に特異的な効果を示
す等の報告から、本発明で用いられる目的化合物は、種
々な医薬品への応用が期待される。
一つであるリゾホスファチジルセリンは、免疫グロブリ
ンEの関与するヒスタミン遊離作用に特異的な効果を示
す等の報告から、本発明で用いられる目的化合物は、種
々な医薬品への応用が期待される。
(5)本発明で対象原料としながったアシル化リン脂質
、例えば、プラズマローゲン型リン脂質、カルシオリビ
ン、ホスファチジル−N−メチルエタノールアミン類な
どの加水分解にも応用出来る。
、例えば、プラズマローゲン型リン脂質、カルシオリビ
ン、ホスファチジル−N−メチルエタノールアミン類な
どの加水分解にも応用出来る。
従って、本発明はモノアシルグリセロリン脂質の工業的
製造法として極めて好適である。
製造法として極めて好適である。
(実施例)
以下、実施例に基づき本発明を具体的に説明する。尚、
各例中、%は重量基準である。
各例中、%は重量基準である。
実施例1
卵黄脂質からケイ酸カラムを用いて単離したホスファチ
ジルエタノールアミン(含量99%、イヤトロスキャン
法)10gをエチルエーテル500−及び豚膵臓由来の
ホスホリパーゼA、(ノボインダストリー社製、レシタ
ーゼl0L) 4.5g (ホスホリパーゼAt 45
0mg含有;水の量4.1d)に添加し、撹拌子で緩や
かに撹拌し、室温で6時間おいた。
ジルエタノールアミン(含量99%、イヤトロスキャン
法)10gをエチルエーテル500−及び豚膵臓由来の
ホスホリパーゼA、(ノボインダストリー社製、レシタ
ーゼl0L) 4.5g (ホスホリパーゼAt 45
0mg含有;水の量4.1d)に添加し、撹拌子で緩や
かに撹拌し、室温で6時間おいた。
経時後、エチルエーテルをデカンテーションで除去し、
新しいエチルエーテル300−を加えて撹拌し、再度、
デカンテーションでエチルエーテルを除去した。さらに
冷アセトン300−で3回撹拌洗浄とデカンテーション
を繰り返し、粗生成物を乾燥濃縮した。この濃縮物をク
ロロホルム/メタノール同量混液300rnlに溶解し
、この溶液中に濾過助剤(ダイカライドオリエント社製
、ダイカライド・バーライH5gを添加し、撹拌後、濾
過してその母液を蒸留乾燥して5.2gの黄色のロウ状
物を得た。
新しいエチルエーテル300−を加えて撹拌し、再度、
デカンテーションでエチルエーテルを除去した。さらに
冷アセトン300−で3回撹拌洗浄とデカンテーション
を繰り返し、粗生成物を乾燥濃縮した。この濃縮物をク
ロロホルム/メタノール同量混液300rnlに溶解し
、この溶液中に濾過助剤(ダイカライドオリエント社製
、ダイカライド・バーライH5gを添加し、撹拌後、濾
過してその母液を蒸留乾燥して5.2gの黄色のロウ状
物を得た。
黄色のロウ状物の分析値は下記の通りであった。
■TLC
メルク社製T L C(Plate 5ilica G
el 60)、20X20cm、、厚さ0.25朋、展
開液:クロロホルム/メタノール/水 65/25/4
(v/v/ν)発色剤:ディトマーレスター試薬 Rf値0.55に非常に弱< 、0.22に強く青色に
呈色。
el 60)、20X20cm、、厚さ0.25朋、展
開液:クロロホルム/メタノール/水 65/25/4
(v/v/ν)発色剤:ディトマーレスター試薬 Rf値0.55に非常に弱< 、0.22に強く青色に
呈色。
■TLC−FID (イヤトロスキャン法)展開液:T
LCと同様 薄層棒:クロマロッドー3U型 分析結果: ホスファチジルエタノールアミン 3%リゾホスフ
ァチジルエタノールアミン 94%その他
3%実施例2 卵黄脂質からケイ酸カラムを用いて単離したホスファチ
ジルエタノールアミンを原らの方法(前出)に準拠し、
Pd/C触媒を用い完全水添(1゜v、2)ホスファチ
ジルエタノールアミン(含量99%、イヤトロスキャン
法)を調製した。水添ホスファチジルエタノールアミン
10gを酢酸エチル1000dに溶解し、次いで、豚膵
臓由来のホスホリパーゼA2(ノボインダストリー社製
、レシターゼIOLの凍結乾燥品)Igと蒸留水1rd
を添加し、撹拌子で緩やかに撹拌した。40℃で4時間
反応した。後の処理は実施例1に従い、5.4gの白色
粉末を得た。
LCと同様 薄層棒:クロマロッドー3U型 分析結果: ホスファチジルエタノールアミン 3%リゾホスフ
ァチジルエタノールアミン 94%その他
3%実施例2 卵黄脂質からケイ酸カラムを用いて単離したホスファチ
ジルエタノールアミンを原らの方法(前出)に準拠し、
Pd/C触媒を用い完全水添(1゜v、2)ホスファチ
ジルエタノールアミン(含量99%、イヤトロスキャン
法)を調製した。水添ホスファチジルエタノールアミン
10gを酢酸エチル1000dに溶解し、次いで、豚膵
臓由来のホスホリパーゼA2(ノボインダストリー社製
、レシターゼIOLの凍結乾燥品)Igと蒸留水1rd
を添加し、撹拌子で緩やかに撹拌した。40℃で4時間
反応した。後の処理は実施例1に従い、5.4gの白色
粉末を得た。
白色粉末の分析値は下記の通りであった。
■TLC
実施例1と同じ条件
Rf(!0.59に非常に弱< 、0.24に強く青色
に呈色。
に呈色。
■TLC−,FID(イヤトロスキャン法)実施例1と
同じ条件 分析結果 ホスファチジルエタノールアミン 2%リゾホスフ
ァチジルエタノールアミン 95%その他
3%実施例3 牛脳脂質を溶剤分別とケイ酸カラムクロマトグラフィー
を用いて単離したホスファチジルセリン(ナトリウム塩
、カリウム塩、カルシウム塩の混合物、含量98%、イ
ヤトロスキャン法)2gをn−ヘキサン1000−に溶
解し、次いで豚膵臓由来のホスホリパーゼA 2 (ノ
ボインダストリー社製、レシターゼIOLの凍結乾燥品
)Igと蒸留水Q 、 5 mlを添加し、撹拌子で緩
やかに撹拌した。30℃で7時間反応した。後の処理は
実施例1に従い、0.9gの白色粉末を得た。
同じ条件 分析結果 ホスファチジルエタノールアミン 2%リゾホスフ
ァチジルエタノールアミン 95%その他
3%実施例3 牛脳脂質を溶剤分別とケイ酸カラムクロマトグラフィー
を用いて単離したホスファチジルセリン(ナトリウム塩
、カリウム塩、カルシウム塩の混合物、含量98%、イ
ヤトロスキャン法)2gをn−ヘキサン1000−に溶
解し、次いで豚膵臓由来のホスホリパーゼA 2 (ノ
ボインダストリー社製、レシターゼIOLの凍結乾燥品
)Igと蒸留水Q 、 5 mlを添加し、撹拌子で緩
やかに撹拌した。30℃で7時間反応した。後の処理は
実施例1に従い、0.9gの白色粉末を得た。
白色粉末の分析値は下記の通りであった。
■TLC
実施例1と同じ条件
Rf値0.24に非常に弱< 、0.12に強く青色に
呈色。
呈色。
■TLC−FID (イヤトロスキャン法)実施例1と
同じ条件 分析結果 ホスファチジルセリン 4%リゾホスファ
チジルセリン 92%その他
4%実施例4 パン酵母にトルエンとイソプロパツールで自己分解させ
た後に脂質抽出を行い、この抽出物をケイ酸カラムを用
いて単離したホスファチジルイノシトール(含量99%
、イヤトロスキャン法)1gをジオキサン25m1に加
熱溶解し、次いで豚膵臓由来のホスホリパーゼA、(ノ
ボインダストリー社製、レシターゼIOLの凍結乾燥品
)Igと蒸留水0.1iを添加し撹拌子で緩やかに撹拌
した。50’Cで10時間反応した。後の処理は実施例
1に従い、0.7gの黄色のロウ状物を得た。
同じ条件 分析結果 ホスファチジルセリン 4%リゾホスファ
チジルセリン 92%その他
4%実施例4 パン酵母にトルエンとイソプロパツールで自己分解させ
た後に脂質抽出を行い、この抽出物をケイ酸カラムを用
いて単離したホスファチジルイノシトール(含量99%
、イヤトロスキャン法)1gをジオキサン25m1に加
熱溶解し、次いで豚膵臓由来のホスホリパーゼA、(ノ
ボインダストリー社製、レシターゼIOLの凍結乾燥品
)Igと蒸留水0.1iを添加し撹拌子で緩やかに撹拌
した。50’Cで10時間反応した。後の処理は実施例
1に従い、0.7gの黄色のロウ状物を得た。
黄色のロウ状物の分析値は下記の通りであった。
■TLC
実施例1と同じ条件
Rf値0.23と0.18に青く呈色したスポットが認
められる。
められる。
■TLC−FID (イヤトロスキャン法)実施例1と
同じ条件 分析結果 ホスファチジルイノシトール 45%リゾホスフ
ァチジルイノシトール 50%その他
5%実施例5 大豆リン脂質からDEAE−セルロースカラム処理とケ
イ酸カラム処理を用いて単離したホスファチジルグリセ
ロールを原らの方法(前出)に準拠しPd/C触媒を用
いて、完全水添(1,V、5)ホスファチジルグリセロ
ール(ナトリウム塩、含量95%、イヤトロスキャン法
)2gをエチルエーテル400−に溶解し、次いで豚膵
臓由来のホスホリパーゼA!(ノボインダストリー製、
レシターゼ10Lの凍結乾燥品)4gと蒸留水4−を添
加し、撹拌子で緩やかに撹拌した。25℃で5時間反応
した。後の処理は実施例1に従い、1.1gの白色粉末
を得た。
同じ条件 分析結果 ホスファチジルイノシトール 45%リゾホスフ
ァチジルイノシトール 50%その他
5%実施例5 大豆リン脂質からDEAE−セルロースカラム処理とケ
イ酸カラム処理を用いて単離したホスファチジルグリセ
ロールを原らの方法(前出)に準拠しPd/C触媒を用
いて、完全水添(1,V、5)ホスファチジルグリセロ
ール(ナトリウム塩、含量95%、イヤトロスキャン法
)2gをエチルエーテル400−に溶解し、次いで豚膵
臓由来のホスホリパーゼA!(ノボインダストリー製、
レシターゼ10Lの凍結乾燥品)4gと蒸留水4−を添
加し、撹拌子で緩やかに撹拌した。25℃で5時間反応
した。後の処理は実施例1に従い、1.1gの白色粉末
を得た。
白色粉末の分析値は下記の通りであった。
■TLC
実施例1と同じ条件
Rf値0.55に非常に弱<、0.22に強く青色に呈
色したスポットが認められる。
色したスポットが認められる。
■TLC−1’lD(イヤトロスキャン法)実施例1と
同じ条件 分析結果 ホスファチジルグリセロール 5%リゾホスファ
チジルグリセロール 91%その他
4%比較例1 実施例1の反応条件のうちエチルエーテルをメタノール
に換えて同様に反応した。後の処理は実施例1に従い、
8.3gの黄色のロウ状物を得た。
同じ条件 分析結果 ホスファチジルグリセロール 5%リゾホスファ
チジルグリセロール 91%その他
4%比較例1 実施例1の反応条件のうちエチルエーテルをメタノール
に換えて同様に反応した。後の処理は実施例1に従い、
8.3gの黄色のロウ状物を得た。
黄色のロウ状物の分析値は下記の通りであった。
■TLC
実施例1と同じ条件
Rf値0.55に強< 、0.22に弱く青色に呈色し
たスポットが認められる。
たスポットが認められる。
■TLC−FID (イヤトロスキャン法)実施例1と
同じ条件 分析結果 ホスファチジルエタノールアミン 92%リゾホス
ファチジルエタノールアミン 5%その他
3%以上の結果より、本性の豚膵
臓由来のホスホリパーゼA、によるジアシルグリセロリ
ン脂質の加水分解に関し、非イオン性無極性溶媒を使用
しない条件では、分解反応が進行しないことが判明した
。
同じ条件 分析結果 ホスファチジルエタノールアミン 92%リゾホス
ファチジルエタノールアミン 5%その他
3%以上の結果より、本性の豚膵
臓由来のホスホリパーゼA、によるジアシルグリセロリ
ン脂質の加水分解に関し、非イオン性無極性溶媒を使用
しない条件では、分解反応が進行しないことが判明した
。
比較例2
実施例1の反応条件のうち水の添加量を50−に換えて
同様に反応した。低速撹拌ではエーテル層と水層が分離
するので、全体を均一に保つため、撹拌子で激しく撹拌
し乳化状態にした。反応終了後、減圧下に溶媒を留去し
、さらに連続的に脱水を試みたが、反応液に発泡現象が
認められた。そのためベンゼン50dを加えて減圧蒸留
を3回繰り返して脱水した。この蒸留残香を冷アセトン
200m1で2回撹拌とデカンテーションを行い粗生成
物を得た。この粗生成物をクロロホルム/メタノール同
量混液に溶解したが、この溶媒に不溶な物質が出現した
。この物質は脱水前の反応溶媒には認められなかった。
同様に反応した。低速撹拌ではエーテル層と水層が分離
するので、全体を均一に保つため、撹拌子で激しく撹拌
し乳化状態にした。反応終了後、減圧下に溶媒を留去し
、さらに連続的に脱水を試みたが、反応液に発泡現象が
認められた。そのためベンゼン50dを加えて減圧蒸留
を3回繰り返して脱水した。この蒸留残香を冷アセトン
200m1で2回撹拌とデカンテーションを行い粗生成
物を得た。この粗生成物をクロロホルム/メタノール同
量混液に溶解したが、この溶媒に不溶な物質が出現した
。この物質は脱水前の反応溶媒には認められなかった。
以上の結果から、本性に比べて従来法では厳しい反応条
件が要求され、さらに反応生成物の脱水や精製が困難で
あり、特別な工程が必要であった。
件が要求され、さらに反応生成物の脱水や精製が困難で
あり、特別な工程が必要であった。
比較例3
実施例5の反応条件のうち、蒸留水の量は10■(0,
01d)で反応を行った。後の処理は実施例1に従い、
1.7gの白色粉末を得た。
01d)で反応を行った。後の処理は実施例1に従い、
1.7gの白色粉末を得た。
白色粉末の分析値は下記の通りであった。
■TLC
実施例1と同じ条件
Rf値0.56に強(,0,26に非常に弱く青色に呈
色したスポットが認められた。
色したスポットが認められた。
■TLC−FID(イヤトロスキャン法)実施例1と同
じ条件 分析結果 ホスファチジルグリセロール 87%リゾホスフ
ァチジルグリセロール 7%その他
6%以上の結果から、本性の酵素による
ジアシルグリセロリン脂質の加水分解に関し、蒸留水が
0.01容量%以下の条件では、分解率が低下すること
が判明した。
じ条件 分析結果 ホスファチジルグリセロール 87%リゾホスフ
ァチジルグリセロール 7%その他
6%以上の結果から、本性の酵素による
ジアシルグリセロリン脂質の加水分解に関し、蒸留水が
0.01容量%以下の条件では、分解率が低下すること
が判明した。
Claims (1)
- 化学合成又は天然脂質原料から単離したホスファチジ
ルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファ
チジルイノシトールまたはホスファチジルグリセロール
を加水分解する際に、豚膵臓由来のホスホリパーゼA_
2酵素を用い、非イオン性無極性有機溶媒に0.01〜
2容量%の水を添加した反応液中で反応させ、モノアシ
ルグリセロリン脂質を得ることを特徴とするジアシルグ
リセロリン脂質の加水分解法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP25875089A JPH03123493A (ja) | 1989-10-05 | 1989-10-05 | ジアシルグリセロリン脂質の加水分解法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP25875089A JPH03123493A (ja) | 1989-10-05 | 1989-10-05 | ジアシルグリセロリン脂質の加水分解法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH03123493A true JPH03123493A (ja) | 1991-05-27 |
Family
ID=17324568
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP25875089A Pending JPH03123493A (ja) | 1989-10-05 | 1989-10-05 | ジアシルグリセロリン脂質の加水分解法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH03123493A (ja) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1995008621A1 (en) * | 1993-09-22 | 1995-03-30 | Creative Biomolecules, Inc. | Lipid-modified serum free media |
WO2001040496A1 (en) * | 1999-11-30 | 2001-06-07 | Doosan Corporation | A method for preparing lysophosphatidylethanolamine |
WO2003091263A1 (en) * | 2002-04-25 | 2003-11-06 | Doosan Corporation | Method for producing phosphatidylethanolamine and lysophosphatidylethanolamine using non-organic solvent system |
EP1434593A2 (en) * | 2001-10-11 | 2004-07-07 | Biomolecular Products, Inc. | MODIFICATIONS OF SOLID 3-sn-PHOSPHOGLYCERIDES |
-
1989
- 1989-10-05 JP JP25875089A patent/JPH03123493A/ja active Pending
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1995008621A1 (en) * | 1993-09-22 | 1995-03-30 | Creative Biomolecules, Inc. | Lipid-modified serum free media |
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KR100331932B1 (ko) * | 1999-11-30 | 2002-04-09 | 최승철 | 리소포스파티딜에탄올아민의 제조방법 |
US6773902B1 (en) | 1999-11-30 | 2004-08-10 | Doosan Corporation | Method for preparing lysophosphatidylethanolamine |
EP1434593A2 (en) * | 2001-10-11 | 2004-07-07 | Biomolecular Products, Inc. | MODIFICATIONS OF SOLID 3-sn-PHOSPHOGLYCERIDES |
EP1434593A4 (en) * | 2001-10-11 | 2010-05-12 | Biomolecular Products Inc | MODIFICATIONS OF SOLID 3-sn-PHOSPHOGLYCERIDES |
WO2003091263A1 (en) * | 2002-04-25 | 2003-11-06 | Doosan Corporation | Method for producing phosphatidylethanolamine and lysophosphatidylethanolamine using non-organic solvent system |
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