DE4027334A1 - Verfahren zur herstellung von phosphatidylinosit hoher reinheit - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Her­ stellung von Phosphatidylinosit hoher Reinheit und in hoher Ausbeute, ausgehend von einem Phospholipidgemisch. Der er­ findungsgemäß erhaltene hochreine Phosphatidylinosit eignet sich als Emulgator auf verschiedenen technischen Gebieten, wie der Herstellung von Lebensmitteln, Kosmetika, Agrochemi­ kalien und in der Fischverarbeitung sowie als Ausgangs­ material zur Herstellung von Liposomen zur Umhüllung von Arzneistoffen.

Phospholipide kommen in großem Umfang in Lebewesen vor, wie Tieren, Pflanzen, Mikroorganismen und Algen. Sie sind haupt­ sächlich Bausteine von Zellmembranen derartiger Lebewesen und haben verschiedene wichtige Funktionen. Phospholipide aus natürlichen Quellen umfassen normalerweise ein Gemisch von z.B. Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phos­ phatidylinosit, Phosphatidylserin, Phosphatidsäure und Sphingomyerin. Zur Isolierung eines speziellen Phospholipids aus dem Gemisch sind verschiedene Fraktionierverfahren ange­ wendet worden, z.B. Lösungsmittelfraktionierungstechniken, wie Extrahierungsfraktionierung mit einem einzigen Lösungs­ mittel, wie Methanol, Ethanol, Isopropanol, Hexan oder Chlo­ roform, und Umkristallisation aus einem Lösungsmittel­ gemisch; säulenchromatographische Fraktionierungstechniken, bei denen ein Adsorptionsmittel, wie Kieselgel, Aluminium­ oxid oder ein Ionenaustauscherharz verwendet wird; und Frak­ tionierungstechniken ausgezeichnet durch die Bildung einer Verbindung mit CdCl₂ oder eines acetylierten Derivats.

Die Lösungsmittelfraktionierungstechniken und die Fraktio­ nierungstechniken ausgezeichnet durch Bildung von Derivaten können jedoch das Phospholipid nicht in der gewünschten hohen Reinheit konzentrieren. Die Kombination dieser Metho­ den mit den säulenchromatographischen Fraktionierungstechni­ ken ermöglicht es, die Reinheit des gewonnenen Phospholipids zu erhöhen, die Ausbeute ist jedoch sehr gering. Deshalb ist das so erhaltene Produkt sehr teuer, und die Benutzung im industriellen Rahmen stark eingeschränkt. Es ist besonders schwierig, Phosphatidylinosit von anderen Verbindungen wie Phosphatidylethanolamin und Phosphatidsäure durch die her­ kömmlichen Lösungsmittelextraktionsmethoden zu trennen. Hochgereinigtes Phosphatidylinosit kann nur durch eine Lö­ sungsmittelextraktionsmethode erhalten werden, bei der eine Vielzahl von Lösungsmitteln verwendet wird, und/oder durch Säulenfraktionierungstechniken, bei denen eine Vielzahl von Lösungsmitteln benutzt werden. In diesem Fall ist die Aus­ beute ebenfalls sehr schlecht.

Andererseits ist es auch möglich, hochreine Phospholipide auf chemischem Wege herzustellen, und gegenwärtig werden viele Produkte industriell genutzt, die auf diesem Wege her­ gestellt worden sind. Obwohl die chemischen Methoden es er­ möglichen, einzelne Phospholipide herzustellen, haben sie mehrere Nachteile. Beispielweise erfolgt beim Erhitzen wäh­ rend der Synthese dieser Verbindungen eine Verschlechterung und/oder eine Verfärbung der sie aufbauenden ungesättigten Fettsäuren oder ungesättigten Phosphorsäureester. Es ist deshalb in diesen Verfahren unvermeidlich, unwirtschaftliche und komplizierte Verfahren zur Reinigung der Reaktionspro­ dukte anzuwenden.

Zusätzlich zu den vorgenannten Methoden wurden mehrere Ver­ suche unternommen, die Phospholipide enzymatisch umzuwan­ deln. Zum Beispiel ist in der JP-A-48 390/87 (im folgenden J.P. KOKAI genannt) ein Verfahren zur Herstellung von hoch­ reinem Phosphatidylinosit aus einem Phospholipidgemisch durch Umsetzung mit Phospholipase D beschrieben, die aus Kohl oder Reiskleie gewonnen wird. Alle Phospholipidverbin­ dungen in dem Gemisch, außer Phosphatidylinosit werden dabei hydrolysiert. Das Reaktionsprodukt wird mit Hexan extra­ hiert. Der Hexanextrakt wird mit 5% Essigsäure enthaltendem Ethanol gewaschen. Dieses Verfahren nutzt die Eigenschaften des Enzyms am besten. Dennoch besteht ein Bedarf zur Ent­ wicklung von Verfahren, die es ermöglichen, Phosphatidylino­ sit in höherer Reinheit herzustellen.

Somit liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein einfaches Verfahren zur Gewinnung von hochreinem Phos­ phatidylinosit aus Phospholipidgemischen bereitzustellen, das die vorgenannten Nachteile vermeidet. Diese Aufgabe und weitere Aufgaben der vorliegenden Erfin­ dung und ihre Lösungen werden durch die folgende Beschrei­ bung weiter erläutert.

Die Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe beruht auf einer überraschenden Erkenntnis. Wenn man das Verfahren nach der J.P. Kokai so abwandelt, daß man die bei der Hydrolyse mit einer Phospholipase D enstan­ dene Phosphatidsäure mit einer speziellen Phosphatase behan­ delt, dann läßt sich Phosphatidylinosit mit großer Effizienz sehr hoch reinigen.

Somit betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Phosphatidylinosit hoher Reinheit, das die folgenden Schritte umfaßt: Behandlung eines Phospholipidgemisches mit einer Phospholipase D, Behandlung des erhaltenen Produkts mit einer alkalischen oder sauren Phosphatase und Abtrennen des nicht umgesetzten Phosphatidylinosits aus dem Reaktions­ gemisch.

Das im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Phospholipid­ gemisch ist nicht auf ein spezielles Phospholipid be­ schränkt, solange es das gewünschte Phospholipid, nämlich Phosphatidylinosit enthält. Deshalb können Phospholipidgemi­ sche z.B. aus Tieren, Pflanzen, Mikroorganismen oder Algen gewonnen werden und auch auf chemischem Wege hergestellt werden. Außerdem enthalten einige der Phospholipidgemische manchmal Phospholipide vom Diacyl- und Monoacyl-Typ (Lysoisomere). Sie können ebenso verwendet werden, unabhän­ gig von der Länge der Acylgruppen, der Gegenwart oder Abwe­ senheit von ungesättigten Bindungen und der Anzahl der unge­ sättigten Bindungen. Allgemein enthalten Phospholipidgemi­ sche aus natürlichen Quellen oft andere Verbindungen als Phospholipide, wie neutrale Fette (z. B. Glyceride), Zucker und Glykolipide. Sie können in den Ausgangsphospholipidgemi­ schen vorhanden sein. Vorzugsweise werden sie aber vor An­ wendung des erfindungsgemäßen Verfahrens durch Extraktion mit einem Lösungsmittel, wie einem Lösungsmittelgemisch aus Chloroform und Methanol, entfernt. Die Extraktion mit einem derartigen Lösungsmittel ermöglicht gleichzeitig die Abtren­ nung von Phosphatidylcholin.

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird zuerst das Aus­ gangsphospholipidgemisch mit einer Phospholipase D behan­ delt. Die Phospholipase D reagiert nicht mit Phosphatidylinosit, mit anderen Worten, sie hydrolysiert Phosphatidylinosit nur in geringem Umfang dagegen selektiv andere Phospholipidverbindungen, wie Phosphatidylcholin und Phosphatidylethanolamin. Das Enzym beschleunigt selektiv die Hydrolyse von Phosphatidylethanolamin zu Phosphatidsäure.

Beispiele für Phospholipasen, die eine derartige Sub­ stratspezifität haben, sind Phospholipasen D, die in Pflan­ zen vorkommen, wie Kohl, Reiskleie, Sojabohnen, Rapssamen, Sonnenblumensamen, Sesam, Karotten, Erdnüssen, Spinat, Baum­ wollsamen; Phospholipasen D, die aus Tieren gewonnen werden, wie Rattenhirnmikrosomen und Rattenleber; Phospholipasen D, die aus Mikroorganismen gewonnen werden, wie Mikroorganis­ men, die zu den Gattungen Streptomyces gehören, z.B. Strep­ tomyces chromofuscus, Streptomyces sp. (FERM Nr. 6100, wie in der JP-A-1 52 481/83 beschrieben), oder die zu der Gattung Actinomadura gehören, z.B. Actinomadura sp. (FERM BP-511, beschrieben in der JP-A-67 183/83), oder die zur Gattung Nocardiopsis gehören, z. B. Nocardiopsis sp. (FERM BP-512, beschrieben in der JP-A-63 388/83); Phospholipasen D, die von Mikroorganismen gebildet werden, die zu der Gattung Micromonospora gehören; und Phospholipasen D, die in roten Algen, wie Porphyridium cruentum und Nemalion vermiculare vorkommen. Diese Phospholipasen können einzeln oder in Kom­ bination verwendet werden. Die Phospholipasen, die im erfin­ dungsgemäßen Verfahren verwendet werden, sind nicht auf die vorgenannten speziellen Beispiele beschränkt.

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird das Hydrolysat oder das mit der Phospholipase D behandelte Phospholipidgemisch wei­ ter mit einer alkalischen oder sauren Phosphatase behandelt. Die Phosphatase hydrolysiert selektiv Phosphatidsäure und ihre Salze, aber keine Phospholipidverbindungen, wie Phos­ phatidylcholin, Phosphatidylethanolamin und Phosphatidylino­ sit.

Beispiele für alkalische Phosphatasen, die eine derartige Substratspezifität haben, sind Phosphatasen, die aus inneren Organen von Lebewesen oder flüssigen Sekreten dieser Organe gewonnen werden, wie Dünndarm, Plazenta oder Leber von Men­ schen, Dünndarm, Niere oder Milch von Rindern, Schweinenie­ ren, Leber und Dünndarm von Ratten, und alkalische Phosphatasen, die aus Mikroorganismen, wie Escherichia coli, gewonnen werden. Beispiele für saure Phosphatasen, die im erfindungsgemäßen Verfahren benutzt werden können, sind Phosphatasen aus der menschlichen Prostata, aus Kuhmilch und aus Bullensamen oder aus Pflanzen wie Weizenkeimen, Kartof­ feln oder süßen Kartoffeln, und aus Mikroorganismen, wie Clostridium acetobutylicum oder Schizosaccharomyces pombe. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf diese spe­ ziellen Beispiele beschränkt. Die Phosphatasen können allein oder in Kombination eingesetzt werden.

Als Phospholipasen D können diejenigen alkalischen und sau­ ren Phosphatasen für das Verfahren der vorliegenden Erfin­ dung verwendet werden, die im Handel erhältlich sind und die eventuell noch weiter gereinigt werden können, oder diejeni­ gen, die aus natürlichen Quellen durch übliche Verfahren isoliert und gereinigt werden.

Die spezifischen Verfahren zur Herstellung von Phosphatidylinosit aus einem Phospholipidgemisch werden nachstehend im Detail beschrieben. Das Phospholipidgemisch kann als solches als Ausgangsmaterial verwendet oder es kann auch vor der Verwendung gereinigt werden. Die Vorbehandlung umfaßt die Extraktion eines Teils der Verbindungen, die in dem Phospholipidgemisch vorliegen, außer den gewünschten Verbindungen, mit einem organischen Lösungsmittel, wie Methanol, Ethanol, Isopropanol, Ether, Chloroform, Hexan oder einer Mischung davon. Das Phospholipidgemisch wird als solches oder nach Vorbehandlung mit einer Phospholipase D versetzt, um alle Phospholipidverbindungen außer dem Phos­ phatidylinosit zu hydrolysieren. Die Behandlung kann mit oder ohne Lösungsmittel, und gegebenenfalls mit einem Addi­ tiv, das als Aktivator des Enzyms bekannt ist, und einem Puffermittel unter Schütteln oder unter geeigneten Rührver­ hältnissen durchgeführt werden. Beispiele für Lösungsmittel sind Dimethylether, Diethylether, Ethylacetat, Hexan oder Benzol. Beispiele für die fakultativen Additive sind Natriumdodecylsulfat, Cholsäure, Desoxycholsäure oder Salze davon, Magnesiumsulfat, Magnesiumchlorid, Calciumchlorid oder anionische Tenside. Beispiele für Puffermittel sind Essigsäure, Phosphorsäure, Citronensäure oder Salzsäure. Die Hydrolyse wird in einem pH-Bereich von 3 bis 10, vorzugs­ weise von 4 bis 8, bei Temperaturen von 10 bis 70°C, vor­ zugsweise von 20 bis 40°C, und für 1 bis 48 h ausgeführt. Wenn ein Lösungsmittel verwendet wird, wird die Reaktionslö­ sung wiedergewonnen und das Lösungsmittel in üblicher Weise abdestilliert. Wenn die Hydrolyse ohne Lösungsmittel durch­ geführt wird, werden die Phospholipide mit einem geeigneten Lösungsmittel wie Ether extrahiert, und das Lösungsmittel wird in üblicher Weise entfernt. Das Produkt, das mit der Phospholipase D hydrolysiert worden ist, wird dann in einer Pufferlösung dispergiert, zu der gegebenenfalls die gleichen Additive wie oben hinzugefügt werden, und Phosphatidsäure und ihre Salze werden mit einer alkalischen oder sauren Phosphatase hydrolysiert unter Bedingungen, die für das je­ weilige Enzym optimal oder nahezu optimal sind.

Der optimale pH-Wert für die Hydrolyse liegt für die alkali­ sche Phosphatase im Bereich vom 7 bis 12, vorzugsweise von 7 bis 10, und für die saure Phosphatase im Bereich von 4 bis 7, vorzugsweise von 5 bis 6. In beiden Fällen wird die Hydrolyse für 1 bis 48 h bei Temperaturen von 10 bis 60°C, vorzugsweise von 20 bis 40°C, durchgeführt. Das Produkt wird gewaschen, extrahiert und mit denselben organischen Lösungs­ mitteln wie oben fraktioniert, oder einer Membrantrennung oder einer säulenchromatographischen Trennung unterworfen, um so den gewünschten hochreinen Phosphatidylinosit zu erge­ ben. Das Reaktionsprodukt, das mit alkalischer oder saurer Phosphatase behandelt worden ist, wird besonders bevorzugt mit Aceton nach einem üblichen Verfahren fraktioniert. Als Resultat kann Phosphatidylinosit, d.h. ein Phospholipid, das nicht hydrolysiert ist, leicht in hoher Reinheit erhal­ ten werden, weil es in Aceton unlöslich ist. Die Reaktions­ prozesse, mit denen das gewünschte Phosphatidylinosit in hoher Reinheit hergestellt werden kann, können mit irgend­ welchen Analyseverfahren überwacht werden, wie Dünnschicht­ chromatographie (TLC), Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) und TLC/FID (Iatroscan von IATRON Co., Ltd.), wodurch die Reaktionszeit kontrolliert werden kann.

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird die Phospholipase D und die alkalische oder saure Phosphatase in einer Menge verwen­ det, in der das Enzym in hinreichendem Umfang mit dem Phospholipidgemisch reagiert. Diese Menge liegt normaler­ weise im Bereich von 0,1 bis 500 Einheiten, vorzugsweise im Bereich von 1 bis 100 Einheiten für die Phospholipase D und im Bereich von 1 bis 1000 Einheiten, vorzugsweise von 10 bis 500 Einheiten für die alkalische oder saure Phosphatase pro Gramm des Phospholipidgemischs.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann das Phosphatidylinosit leicht in hoher Reinheit (z.B. 80° bis 99%iger Reinheit) isoliert werden durch Hydrolyse einer Vielzahl von Phospholipidgemischen mit einer Phospholipase D und einer alkalischen oder sauren Phosphatase, die Sub­ stratspezifität haben. Normalerweise erhält man Phosphatidylinosit nur in geringer Ausbeute bei der Fraktio­ nierung mit einer Vielzahl von Lösungsmitteln, mit Säulen­ chromatographie oder mit komplizierten Techniken, die eine Kombination dieser Techniken beinhalten. Auf der anderen Seite ermöglicht es die vorliegende Erfindung, Phosphatidylinosit zu reinigen oder es in hoher Reinheit zu isolieren unter Verwendung von billigen Lösungsmitteln, wie Hexan, Ethanol, Aceton und Chloroform. Die vorliegende Erfindung wird nachstehend genauer durch die folgenden nicht-einschränkenden Beispiele beschrieben. In den folgenden Beispielen wird Phosphatidylcholin mit PC, Phosphatidylethanolamin mit PE, Phosphatidylinosit mit PI, Phosphatidylserin mit PS und Phosphatidsäure mit PA abge­ kürzt.

Beispiel 1

5 g eines Sojabohnenphospholipids (PC: 32,9%; PE: 22,4%; PI: 23,6%; PA: 18,7%; und andere Verbindungen: 2,4%) wur­ den in ein Becherglas gegeben und in 50 ml eiskaltem Chloro­ form gelöst. Die erhaltene Lösung wurde unter Rühren mit 60 ml eiskaltem Methanol versetzt. Die entstandenen Nieder­ schläge werden innerhalb von 10 s bei 5000 Upm und bei 2°C abzentrifugiert. Die erhaltenen Niederschläge wurden in 25 ml eiskaltem Chloroform gelöst und dann unter Rühren mit 60 ml eiskaltem Methanol versetzt. Dann wurde die Mischung zen­ trifugiert, um die Niederschläge zu gewinnen. Dieses Verfah­ ren wurde zweimal wiederholt; das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abdestilliert und die erhaltenen Nieder­ schläge wurden getrocknet. Die Zusammensetzung des gewon­ nenen, extrahierten Phospholipids war: PE: 35,9%; PI: 40,5 %; PA: 23,7%. Dann wurden 100 mg des extrahierten Phospholipids, d.h. des PC-freien Phospholipids, in 10 ml Diethylether in einem gläsernen Reaktionsgefäß gelöst. Die Lösung wurde mit 5 ml eines 0,2 M Acetatpuffers (pH 5,6), der 0,06 Einheiten/mg an Phospholipase D aus Kohl enthält (nach einem herkömmlichen Verfahren isoliert und gereinigt,; vgl. LEE S.Y. et al., J. Ferment. Technol., 1985, 63, S. 37) und 0,08 Mol Calciumionen versetzt. Die Reaktion wurde 3 h bei 30°C unter Rühren bei 800 Upm durchgeführt. Nach der Reaktion wurde die Zusammensetzung des Reaktionsprodukts mit HPLC bestimmt. Das Produkt enthielt 56,5% PI und 41,4% PA. Der Ether wurde unter vermindertem Druck abdestilliert. Das erhaltene Gemisch von PI und PA wurde in 0,06 M Maleatpuffer (pH 6,0) mit Ultraschall dispergiert. Zu 20 ml eines 0,06 M Maleatpuffers wurde saure Phosphatase in einer Menge von 12 Einheiten pro ml der Reaktionslösung gegeben. (Die saure Phosphatase wurde aus Kartoffeln gewonnen; erhältlich von der Firma Sigma Co., Ltd.) Die gepufferte Phosphatase wurde zu der Dispersion gegeben und die Reaktion wurde 10 h bei 25°C unter Rühren bei 1000 Upm ausgeführt, d.h. die Reak­ tion wurde in einem Micellensystem ausgeführt. Die Reakti­ onslösung wurde mit TLC/FID analysiert und enthielt 55,5% PI, 1,0% PA und 41,5% Diglyceride. Die Reaktionslösung wurde weiter mit einer Folch-Lösung in der herkömmlichen Weise extrahiert, das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abdestilliert, Aceton wurde zu dem erhaltenen Rück­ stand gegeben, die enstandenen Niederschläge wurden durch Zentrifugation abgetrennt, mit Aceton gewaschen und dann ge­ trocknet und ergaben 35 mg eines weißen Feststoffs (gerei­ nigtes PI). Die Reinheit des PIs betrug 98,5%; Ausbeute an PI lag in einer Größenordnung von 87,5% .

Beispiel 2

65 mg des PC-freien Phospholipids nach Beispiel 1 wurden mit einer Phospholipase D in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 hydrolysiert, wobei anstelle der Kartoffel- Phospholipase D nach Beispiel 1 eine Phospholipase D aus Streptomyces chromofuscus (erhältlich von Toyo Jozo Co., Ltd.) verwendet wurde. Die Hyrolyse wurde 5 h in einem 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) durchgeführt, der 40 mMol an Calciumionen enthielt. Das Reaktionsprodukt enthielt 55,0% PI und 44,5% PA.

Das Reaktionsprodukt wurde 5 h bei 37°C in 40 ml eines Tris-HCl-Puffers (pH 8,8) umgesetzt, der 400 mg an Natrium­ desoxycholsäure und 40 Einheiten einer aus der menschlichen Plazenta gewonnenen alkalischen Phosphatase (erhältlich von Sigma Co., Ltd.) enthielt. Sodann wurde wie in Beispiel 1 mit einer Folch-Lösung und Chloroform extrahiert und mit Aceton fraktioniert. Es wurden 12 mg eines weißen Feststoffs (gereinigtes PI) erhalten. Das PI war zu 98,0% rein; Aus­ beute 78,4%.

Vergleichsbeispiel 1

Phosphatidylinosit wurde nach dem in der JP-A-48 390/87 be­ schriebenen Verfahren hergestellt. Gemäß Beispiel 1 wurden 5 g des Sojabohnenphospholipids (PI-Gehalt = 23,6%) während 10 h mit der Phospholipase D aus Kohl (0,5 Einheiten/mg Sojabohnenphospholipid) hydrolysiert. Das Reaktionsprodukt A (4,5 g) umfaßt 26,0% PI, 71,2% PA und 2,8% andere Verbin­ dungen. 2,0 g des Reaktionsprodukts A wurden zweimal mit 20 ml Hexan extrahiert, die Hexanphasen wurden vereinigt, kon­ zentriert, getrocknet und dann mit Ethanol, das 5% Essig­ säure enthält, gewaschen und getrocknet. Es fielen 0,40 g eines weißen Feststoffs an. Der Feststoff enthielt 70,0% PI, 29,0% PA und 1,0% andere Komponenten; Ausbeute an PI: 53,8%.

Beispiel 3

2 g des Reaktionsprodukts A aus dem Vergleichsbeispiel 1 wurden mit der sauren Kartoffel-Phosphatase unter nahezu den gleichen Bedingungen wie im Beispiel 1 hydrolysiert. Das erhaltenene Produkt wurde zweimal mit 20 ml Hexan extra­ hiert, die vereinigte Hexanphase wurde konzentriert und dann mit Ethanol, das 5% Essigsäure enthält, gewaschen und ergab 0,45 g eines weißen Feststoffs. Der weiße Feststoff enthielt 97,5% PI, 0,5% PA und 1,0% andere Verbindungen. Das PI wurde zu 84,4% wiedergewonnen. Im Vergleich zu Ver­ gleichsbeispiel 1 zeigen diese Resultate, daß nach dem Ver­ fahren der Erfindung das gewünschte PI in hoher Reinheit und Ausbeute erhalten wird.

Beispiel 4

Ein Phospholipidgemisch wurde in üblicher Weise aus Färber­ distel gewonnen. Es enthielt 15,8% PC, 9,7% PE, 22,7% PI, 15,8% PA, 3,4% Lyso-PC und 32,6% andere Komponenten. Es wurden im wesentlichen die gleichen Verfahrensschritte wie im Beispiel 1 wiederholt unter Benutzung von 50 g des Phospholipidgemisches aus Färberdistel. Es wurden 23 g eines extrahierten Phospholipids erhalten, das nahezu frei von PC (PE: 25,0%; PI: 48,5%; PA: 26,1% und Lyso-PC: 0,4%) war. Das extrahierte Phospholipid wurde dann mit Phospholipase D, die aus Kohl in derselben Weise wie im Beispiel 1 gewonnen worden war, und danach mit einer alkalischen Phosphatase nach Beispiel 2 behandelt, die aus menschlicher Plazenta ge­ wonnen worden war. Die Reaktionslösung wurde gemäß Beispiel 1 extrahiert. Der Extrakt wurde dann einer Acetonfraktionie­ rung unterworfen und ergab 8,0 g einer weißen Substanz (PI- Reinheit: 98,0%). Das PI wurde zu 70,3% wiedergewonnen.

Beispiel 5

10 g Sojabohnenlecithin LP-20 (erhältlich von Nisshin Seiyu Co., Ltd.; PC: 11,0%; PE: 23,5%; PI: 13,5%; PA: 8,5% und andere Verbindungen: 43,5%) wurden mit Phospholipase D von Streptomyces prunicolor (erhältlich von Yacult Honsha Co., Ltd.) in einem Verhältnis von 30 Einheiten/g Ausgangsmate­ rial versetzt. Die Reaktion wurde während 10 h bei 30°C in einem Zweiphasensystem ausgeführt, das 0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,0)-Ethylacetat (100 ml) enthielt. Das Lösungsmittel wurde abdestilliert. Saure Phosphatase aus Bullensamen (er­ hältlich von Sigma Co., Ltd.) wurde zu dem Destillations­ rückstand in einem Verhältnis von 20 Einheiten/ml des Rück­ standes gegeben. Die Reaktion wurde während 24 h bei 25°C in 0,2 M Acetatpuffer (pH 5,5), d.h. in einem mizellaren System ausgeführt. Das Reaktionsprodukt wurde dreimal mit 300 ml eines Chloroform-Methanol-Gemisches extrahiert. Die vereinigten Chloroformphasen wurden eingedampft, getrocknet und mit Aceton versetzt. Es bildet sich ein Niederschlag. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation gesammelt und getrocknet und ergab 1,0 g eines weißen Feststoffs. Der Feststoff besaß eine PI-Reinheit von 97,5%. PI - Ausbeute: 72,2%.

Claims (20)

1. Verfahren zur Herstellung von Phosphatidylinosit hoher Reinheit, umfassend die Behandlung eines Phospholipidge­ mischs mit Phospholipase D, die Behandlung des erhaltenen Produkts mit einer alkalischen oder sauren Phosphatase und Abtrennen des nicht umgesetzten Phosphatidylinosits aus dem Reaktionsgemisch.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Behandlung mit der Phospholipase D ausgeführt wird während 1 bis 48 h in einem pH-Bereich von 3 bis 10 und bei Temperaturen von 10 bis 70°C und mit einer Menge von Phospholipase D im Bereich von 0,1 bis 500 Einheiten pro g des Phospholipidgemisches.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Behandlung mit der Phospholipase D ausgeführt wird in einem pH-Bereich von 4 bis 8 bei Temperaturen von 20 bis 40°C und einer Phospholipasekonzentration im Bereich von 1 bis 100 Einhei­ ten pro g des Phospholipidgemisches.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Behandlung mit der alkalischen oder sauren Phosphatase ausgeführt wird während 1 bis 48 h bei Temperaturen von 10 bis 60°C in Gegenwart einer Menge von Phosphatase im Bereich von 1 bis 1000 Ein­ heiten pro g des Phospholipidgemisches.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Phosphatase eine alkalische Phosphatase ist und die Behandung mit der alkali­ schen Phosphatase ausgeführt wird in einem pH-Bereich von 7 bis 12 und einer Phosphatasekonzentration im Bereich von 10 bis 500 Einheiten pro g des Phospholipidgemisches.

6. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Phosphatase eine saure Phosphatase ist und die Behandlung mit der sauren Phosphatase ausgeführt wird in einem pH-Bereich von 4 bis 7 und einer Phosphatasekonzentration im Bereich von 10 bis 500 Einheiten pro g des Phospholipidgemisches.

7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Phospholipase aus Kohl, Reiskleie, Sojabohnen, Rapssamen, Sonnenblumensamen, Sesam, Karotten, Erdnüssen, Spinat, Baumwollsamen, Rattenhirnmikro­ somen, Rattenleber; Mikroorganismen der Gattung Streptomyces, Actinomadura, Nocardiopsis, Micromonospora oder Algen verwendet wird.

8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei alkalische Phosphatase aus dem Dünndarm, der Plazenta oder der Leber von Menschen, aus dem Dünndarm, der Niere oder der Milch von Rindern, aus Schweinenieren, der Leber oder dem Dünndarm von Ratten, oder aus Mikroorganismen verwendet und die saure Phosphatase aus der Protasta von Menschen, der Milch von Kühen, dem Samen von Bullen, Weizenkeimen, aus Kartoffeln oder süßen Kartof­ feln, oder aus Mikroorganismen verwendet wird.

9. Verfahren zur Herstellung von Phosphatidylinosit hoher Reinheit, umfassend die Behandlung eines Phospholipidgemi­ sches mit einer Phospholipase D während 1 bis 48 h in einem pH-Bereich von 3 bis 10 und bei Temperaturen von 10 bis 70°C in Gegenwart einer Menge von Phospholipase D im Bereich von 0,1 bis 500 Einheiten pro g des Phospholipidgemisches, um Phospholipidkomponenten bis auf Phosphatylinosit zu hydroly­ sieren, weiter die Behandlung des hydrolysierten Produkts mit einer alkalischen oder sauren Phosphatase unter optima­ len oder nahezu optimalen Bedingungen für jedes Enzym in Ge­ genwart einer Menge von Phosphatase im Bereich von 1 bis 1000 Einheiten pro g des Phospholipidgemisches und Abtren­ nung des Phosphatidylinosits.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Phospholipidgemisch vorbehandelt wird durch Extraktion mit einem organischen Lö­ sungsmittel, wie Methanol, Ethanol, Isopropanol, Ether, Chloroform, Hexan oder einer Mischung davon.

11. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Behandlung mit dem Enzym ausgeführt wird in der Gegenwart eines Aktivators für die Enzyme und/oder eines Puffermittels.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Aktivator Natrium­ dodecylsulfat, Cholsäure, Desoxycholsäure und deren Salze, Magnesiumsulfat, Magnesiumchlorid, Calciumchlorid oder ein anionisches Tensid ist, und das Puffermittel Essigsäure, Phosphorsäure, Citronensäure oder Salzsäure ist.

13. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Produkt, das nach der Behandlung mit der alkalischen oder sauren Phosphatase erhalten worden ist, einer Acetonfraktionierung unterworfen wird.

14. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Behandlung mit der Phospholipase D in einem pH-Bereich von 4 bis 8 bei Tempe­ raturen von 20 bis 40°C und einer Konzentration der Phospho­ lipase im Bereich von 1 bis 100 Einheiten pro g des Phospho­ lipidgemisches ausgeführt wird.

15. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Behandlung mit der alkalischen oder sauren Phosphatase ausgeführt wird während 1 bis 48 h bei Temperaturen von 10 bis 60°C .

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei als Phosphatase eine alkalische Phosphatase verwendet und die Behandlung mit der alkalischen Phosphatase ausgeführt wird in einem pH-Bereich von 7 bis 12 und bei einer Konzentration der Phosphatase im Bereich von 10 bis 500 Einheiten pro g des Phospholipidgemi­ sches.

17. Verfahren nach Anspruch 15, wobei als Phosphatase eine saure Phosphatase verwendet und die Behandlung mit der sau­ ren Phosphatase ausgeführt wird in einem pH-Bereich von 4 bis 7 und einer Konzentration der Phosphatase im Bereich von 10 bis 500 Einheiten pro g des Phospholipidgemisches.

18. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Behandlung mit Phospholipase D ausgeführt wird in einem pH-Bereich von 4 bis 8 und bei Temperaturen von 20 bis 40°C und die Behand­ lung mit der alkalischen oder sauren Phosphatase ausgeführt wird in einem pH-Bereich von 7 bis 10 oder 5 bis 6 und bei Temperaturen von 20 bis 40°C.

19. Verfahren nach Anspruch 9, wobei Phospholipase aus Kohl, Reiskleie, Sojabohnen, Rapssamen, Sonnenblumensamen, Sesam, Karotten, Erdnüssen, Spinat, Baumwollsamen, Rattenhirnmikro­ somen, Rattenleber, Mikroorganismen der Gattung Streptomyces, Actinomadura, Nocardiopsis, Micromonospora oder Algen verwendet wird.

20. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die alkalische Phosphatase aus Dünndarm, Plazenta oder Leber von Menschen, Dünndarm, Niere oder Milch von Rindern, Schweinenieren, Le­ ber oder Dünndarm von Ratten, oder aus Mikroorganismen und die saure Phosphatase aus der menschlichen Prostata, aus der Milch von Kühen, aus Bullensamen, aus Weizenkeimen, aus Kar­ toffeln oder süßen Kartoffeln oder aus Mikroorganismen ver­ wendet wird.