WO2005068644A1 - Verfahren zur herstellung von phosphatidylserin und dessen reinigung durch extraktion - Google Patents
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- C07F9/103—Extraction or purification by physical or chemical treatment of natural phosphatides; Preparation of compositions containing phosphatides of unknown structure
Definitions
- the present invention relates to an enzymatic process for the preparation of phosphatidylsenn.
- Enzymatic processes for the production of phosphatidylsenn are well known from the prior art. Enzymes with phospholipase D (PLD) activity are mainly used.
- the European patent EP 776 976 protects a process in which phosphatides are reacted with serine in a two-phase water / organic solvent system in the presence of raw phospholipase D.
- the phospholipase D comes from a centrifuged fermentation broth of defined microorganism strains that are able to form extracellular PLD.
- phospholipids and also phosphatidylsenn are produced by an enzymatic method in such a way that the starting phospholipid with an acceptor carrying a hydroxyl group with a phospholipase adsorbed on a carrier D is reacted in an organic solvent, the total water content of the reaction system not exceeding 1% by weight.
- JP 5-42917 Japanese Patent 2,130,088 (published as JP 5-42917) protects a process in which phosphatidylcholine as a substrate is reacted in the course of a base exchange reaction with an alcohol, such as, for example, serine, in the presence of PLD from Streptomyces.
- Japanese Patent No. 1 997 470 encompasses a process for producing a phospholipid by mixing its basic variant with an aqueous one PLD preparation is reacted in the presence of a receptor with a hydroxyl group in an organic solvent so that the aqueous phase is enclosed in a reverse micelle.
- the phospholipid itself is said to serve as a surface-active agent.
- JP 61-8888 Another example from the prior art, which relates to special solvent systems or the influence of divalent metal ions on the PLD activity, is JP 61-8888, according to which alcohols, such as e.g. Ethanol or methanol, can be used as acceptors for the head group exchange.
- alcohols such as e.g. Ethanol or methanol
- the process described is carried out in the presence of divalent metal ions and water, buffer systems or organic solvents are used as solvents.
- JP 63-091090 alcohols are also used as acceptors. Suitable solvents in this case are ether, benzene, chloroform and water, the process again being carried out in the presence of a divalent metal ion.
- JP 63-091089 describes calcium ions as particularly suitable, the PLD being used with an alcohol such as ethanol, hexanol or sorbitol as the acceptor.
- an alcohol such as ethanol, hexanol or sorbitol
- a special process variant in which alcohol is used not as a solvent but as a reactant is described in JP 01-144986; this method uses a PLD which develops its specific activity in the presence of divalent metal ions.
- JP 07-184673 is used in a purely organic solvent system, chloroform, toluene or ethyl acetate being used as the anhydrous monophase as the reaction medium for the PLD.
- JP 08-000276 works without alcohol as a solvent, but with methanol as an acceptor for the head group transfer.
- a process according to JP 08-009896 works entirely without divalent metal ions, but in a reaction mixture consisting of alcohol and water and a non-polar solvent.
- An aqueous system consisting of water or a buffer, but completely without organic solvents, but only using surface-active esters, uses the method according to JP 2002-218991.
- a two-phase system consisting of saturated hydrocarbons, aromatics, ketones, esters, alcohols and water, but without the presence of divalent metal ions, is suitable according to JP 2-113891 as a reaction medium for the production of phospholipids with the aid of PLD.
- PLD PLD
- immobilize the PLD for example in the form of adsorption on activated carbon and subsequent activation by the ethyl ether; this is known from JP 63-36791.
- a disadvantage of all of the methods described above is the fact that the PLD either has to be used in a particularly pure form or that it first has to be adsorbed, i.e. immobilized, on carrier materials in a complex manner, and has to be separated off again for the purpose of recovery after the reaction has taken place, also in It is bought that the enzyme is largely consumed.
- the object of the present invention was to provide a method by which phosphatidylsenn from a phospholipid (mixture) and serine in an aqueous system by transphosphatidylation in the presence of a protein with phospholipase D (PLD) -Activity and in the presence of divalent metal ions in a simple and economical way in good Yields can be obtained.
- PLD phospholipase D
- the organic solvents used in particular should not have a negative influence on the enzyme activity.
- the enzyme first had to be applied to a carrier material and then finally recovered from it.
- the main goal was to obtain the phosphatidylsenn in high yields and in pure product quality.
- the invention provides phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol and phosphatidic acid, which can also be used in any mixtures.
- the present method is not restricted to a special phospholipase D, such as is isolated, for example, from specific microorganisms or is also present in raw fermentation broths, but, according to the claimed method, can be any proteins which have a phospholipase D activity.
- the present invention preferably provides for a phospholipase D to be used as the protein with PLD activity.
- purified proteins partially purified or crude proteins
- protein fractions and extracts can also be used in the process according to the invention.
- Essential to the invention for the success of the method according to the invention is i.a. the presence of divalent metal ions, calcium, magnesium and / or zinc ions being preferred.
- divalent metal ions calcium, magnesium and / or zinc ions being preferred.
- all other suitable divalent metal ions can also be used, depending on the reaction medium used according to the invention.
- the present invention provides concentrations of preferably at most 100 mM, concentrations between 0.1 and 20 mM being regarded as particularly preferred, because this can suppress the formation of calcium salts which are sparingly or insoluble in water or buffered aqueous systems ,
- the solvent system can also be varied over a wide range.
- the present invention takes into account a preferred variant System which contains 60 to 95% by weight of the aqueous component (a), portions between 75 and 90% by weight being particularly preferred.
- a solvent system which contains only water as component (a) is particularly suitable for the process according to the invention, although it is of course also possible to use a process variant in which the reaction is carried out only in water, i.e. without the aid of a buffer component or certain amounts of organic solvent.
- the present invention also encompasses a solvent system which, as aqueous component (a), contains an acetate, citrate or phosphate buffer and particularly preferably a sodium acetate buffer, the buffers mentioned being present in amounts of between 50 and 100 mM.
- a solvent system has proven to be particularly suitable which, as aqueous component (a), has a buffer with a pH of about 5.6.
- component (b) a solvent system should be used which contains this organic component in proportions between 5 and 40% by weight and particularly preferably between 12 and 17% by weight.
- component (b) secondary or tertiary alcohols and in particular isopropanol are regarded as particularly preferred component (b).
- the method according to the invention is not limited to a specific PLD, but it has proven to be highly recommended for special method variants if the protein used with PLD activity is used in immobilized form.
- reaction temperatures between 25 ° C and 50 ° C are recommended, with a range between 40 ° C and 45 ° C being particularly preferred. If the process according to the invention is to be carried out in an unbuffered solvent system with a defined pH, it is recommended that the pH of the reaction solution be kept constant during the reaction by titration with a base, for example sodium hydroxide solution.
- a base for example sodium hydroxide solution.
- the present invention provides for the pH value to be reduced to 3.0 after the end of the reaction, a solid being obtained after this pH reduction, which is then preferably from the Solution is separated.
- This can usually be done by known decantation methods, since the solid usually floats on the reaction medium after the pH has been lowered, which is of course particularly advantageous in particular at higher temperatures in the range from 35 ° C. to 40 ° C.
- the present invention claims the fractional purification of the phosphatidylserine obtained.
- the precipitate obtained using the preferred concentration step can be obtained in a form which contains salts of serine and phosphatidylsenn, that is to say the starting material and the product.
- reaction is carried out at altogether elevated temperatures, such as those between 30 ° C. and 50 ° C. excess serine can be separated from the reaction solution in a simple manner with the aid of a lowering of the temperature as a precipitate, the lower temperature limit being 0 ° C.
- the present invention takes into account a variant in which the fractionation of the phospholipids by extraction with ethanol with a water content of between 5 and 15% by weight and particularly preferably between 8 and 12 % By weight is carried out. It can be particularly advantageous if this fractionation step is preceded by at least one washing step with water, as a result of which serine, which may still be present in the phospholipid product, is removed. Two to three washing steps have proven to be advantageous.
- This fractionation variant has a particular advantage because it can be used to obtain a phosphatidylsenn with particularly high purity.
- the remaining residue according to the present invention generally contains phosphatidylsenn with a purity> 80% by weight and in particular with a purity> 95% by weight.
- the starting materials serine, CaCl 2 and Epikuron 145V (phospholipid mixture from Degussa Food Ingredients GmbH) were dissolved or dispersed in 100 ml of water at 45 ° C. A reaction mixture containing 3% by weight of lecithin, 12 mM CaCl 2 and 1.9 M serine was obtained. After adjusting the pH to 5.6, 500 units of a phospholipase D were added and the reaction started. The pH was kept constant during the reaction period of 6 hours by titration with 100 mM sodium hydroxide solution. After the reaction was completed, the pH was adjusted to 3.0 by adding concentrated acid (HCl), whereby the lipid phase was aggregated and separated from the aqueous phase.
- HCl concentrated acid
- aqueous phase was removed and the lipid phase was washed 2 to 3 times with the same volume of deionized water in a mashing wash.
- ethanol was added to the still moist cake, so that a water content of 10% by weight was achieved in the resulting solution. This mixture was mixed thoroughly for 8 hours at 45 ° C. and the precipitate was then filtered off. The ethanol-moist filter cake obtained was dried primarily in vacuo.
- the phosphatidylsenn thus obtained had a purity of greater than 90% by weight and was free from enzyme activity.
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Abstract
Beansprucht wird ein Verfahren zur Herstellung von Phosphatidylserin aus einem Phospholipid(-Gemisch) und Serin in einem wässrigen System durch Transphosphatidylierung in Gegenwart eines Proteins mit Phospholipase D-Aktivität und in Anwesenheit zweiwertiger Metallionen. Dieses Verfahren wird in einem Lösemittelsystem durchgeführt, das aus (a) 100 bis 60 Gew.-% Wasser oder eines wässrigen Puffers mit pH 5,0 bis 6,5 und (b) 0 bis 40 Gew.-% eines wassermischbaren organischen Lösemittels mit PLD-aktivierender Wirkung besteht, wobei das erhaltene Phosphatidylserin durch eine fraktionierende Reinigung abgetrennt wird. Dieses Verfahren, das insbesondere in reinem Wasser durchgeführt werden kann, besitzt seinen Hauptvorteil in den abschließenden Abtrennungsschritten der eventuell verbliebenen Ausgangsmaterialien bzw. des Produktes Phosphatidylserin, wodurch dieses in Reinheiten >95 Gew.-% und in guten Ausbeuten erhalten wird.
Description
Verfahren zur Herstellung von Phosphatidylsenn und dessen Reinigung durch Extraktion
Beschreibung
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein enzymatisches Verfahren zur Herstellung von Phosphatidylsenn.
Enzymatische Verfahren zur Herstellung von Phosphatidylsenn (PS) sind aus dem Stand der Technik hinlänglich bekannt. Dabei werden vornehmlich Enzyme mit Phospholipase D (PLD)-Aktivität eingesetzt.
So ist bspw. mit dem europäischen Patent EP 776 976 ein Verfahren geschützt, bei dem Phosphatide mit Serin in einem zweiphasigen Wasser-/ organischen Lösemittel-System in Gegenwart von roher Phospholipase D umgesetzt wird. Die Phospholipase D stammt dabei aus einer zentrifugierten Fermentationsbrühe definierten Mikroorganismusstämme, die in der Lage sind, extrazelluläre PLD zu bilden.
Gemäß japanischem Patent Nr. 1 696 687 (veröffentlicht als JP 3-67676) werden Phospholipide und auch Phosphatidylsenn mit einem enzymatischen Verfahren in der Art hergestellt, indem das Ausgangsphospholipid mit einem Akzeptor, der eine Hydroxyl-Gruppe trägt, mit einer an einem Trägeradsorbierten Phospholipase D in einem organischen Lösemittel umgesetzt wird, wobei der Gesamtwassergehalt des Reaktionssystems nicht mehr als 1 Gew.-% aufweist.
Das japanische Patent 2 130 088 (veröffentlicht als JP 5-42917) schützt ein Verfahren, bei dem Phosphatidylcholin als Substrat im Rahmen einer Basenaustauschreaktion mit einem Alkohol, wie beispielsweise Serin, in Gegenwart von PLD aus Streptomyces umgesetzt wird.
Das japanische Patent Nr. 1 997 470 umfasst ein Verfahren zur Herstellung eines Phospholipids, indem dessen basische Variante mit einer wässrigen
PLD-Zubereitung in Gegenwart eines Rezeptors mit einer Hydroxyl-Gruppe in einem organischen Lösemittel so umgesetzt wird, dass die wässrige Phase in einer reversen Mizelle eingeschlossen ist. Das Phospholipid selbst soll dabei als oberflächenaktives Mittel dienen.
Hinsichtlich der jeweils eingesetzten Phospholipase D ist bekannt, dass sie ihre spezifische Aktivität in Abhängigkeit vom jeweiligen Lösemittelsystem entweder in Gegenwart oder in Abwesenheit zweiwertiger Metallionen entwickelt.
So sind zahlreiche Verfahrensvarianten vorbeschrieben, die beispielsweise empfehlen, Phospholipase D z.B. zum Zwecke der Herstellung von Phosphatidsäure in Gegenwart von Wasser, aber in Abwesenheit divalenter Metallionen einzusetzen. Diesbezüglich wird auf die europäische Anmeldung EP 285 421 verwiesen, in der ein Verfahren zur Herstellung von Phosphatidsäure beschrieben ist, bei dem anstelle von zweiwertigen Metallionen ein organisches Lösemittel eingesetzt wird, welches aktivierend auf die Enzymaktivität von Phospholipase D wirken soll.
Ein weiteres Beispiel aus dem Stand der Technik, das spezielle Lösemittelsysteme bzw. den Einfluss von zweiwertigen Metallionen auf die PLD-Aktivität zum Gegenstand hat, ist JP 61-8888, gemäß dem Alkohole, wie z.B. Ethanol oder Methanol, als Akzeptoren für den Kopfgruppenaustausch verwendet werden. Das beschriebene Verfahren wird in Gegenwart zweiwertiger Metallionen durchgeführt und als Lösemittel werden Wasser, Puffersysteme oder organische Lösemittel verwendet.
Gemäß JP 63-091090 werden ebenfalls Alkohole als Akzeptoren eingesetzt. Geeignete Lösemittel sind in diesem Fall Ether, Benzol, Chloroform und Wasser, wobei das Verfahren wieder in Gegenwart eines zweiwertigen Metallions durchgeführt wird. Als besonders geeignete Metallionen beschreibt JP 63-091089 Calciumionen, wobei die PLD mit einem Alkohol wie Ethanol, Hexanol oder Sorbitol als Akzeptor eingesetzt wird.
Eine spezielle Verfahrensvariante, bei der Alkohol nicht als Lösemittel sondern als Reaktand eingesetzt wird, beschreibt JP 01-144986; dieses Verfahren bedient sich einer PLD, die in Gegenwart von zweiwertigen Metallionen ihre spezifische Aktivität entfaltet.
Spezielle Ester werden gemäß JP 03-004795 als Lösemittelsysteme im Gemisch mit einem Halogen-haltigen organischen Lösemittel eingesetzt. Die Reaktion der PLD wird hierbei in Gegenwart von Calcium- und Magnesiumsalzen durchgeführt.
Gemäß JP 03-098590 wird vom Einsatz von Alkoholen als Lösemittel abgeraten, weil dadurch die PLD-Aktivität generell gestört und damit das Umsatzergebnis bei der Herstellung von Phospholipiden signifikant verschlechtert wird.
In einem rein organischen Lösemittelsystem wird gemäß JP 07-184673 gearbeitet, wobei als wasserfreie Monophase Chloroform, Toluol oder Essigsäureethylester als Reaktionsmedium für die PLD verwendet werden. Ohne Alkohol als Lösemittel, jedoch mit Methanol als Akzeptor für den Kopfgruppentransfer, wird entsprechend JP 08-000276 gearbeitet. Gänzlich ohne zweiwertige Metallionen, jedoch in einem Reaktionsgemisch bestehend aus Alkohol und Wasser sowie einem unpolaren Lösemittel, arbeitet ein Verfahren gemäß JP 08-009896. Ein wässriges System bestehend aus Wasser oder einem Puffer, jedoch vollkommen ohne organische Lösemittel, sondern lediglich unter Verwendung von oberflächenaktiven Estern, benutzt das Verfahren gemäß JP 2002-218991. Ein Zweiphasensystem bestehend aus gesättigten Kohlenwasserstoffen, Aromaten, Ketonen, Estern, Alkoholen und Wasser, jedoch ohne die Gegenwart zweiwertiger Metallionen, ist gemäß JP 2-113891 als Reaktionsmedium für die Herstellung von Phospholipiden unter Zuhilfenahme von PLD geeignet.
Schließlich wird auch noch empfohlen, die PLD zu immobilisieren, beispielsweise in Form einer Adsorption auf Aktivkohle und einer anschließenden Aktivierung durch die Ethylether; dies ist aus JP 63-36791 bekannt.
Der bekannte und vielfältig vorbeschriebene Stand der Technik gibt dem Durchschnittsfachmann zahlreiche Verfahrensvarianten an die Hand, wie er beispielsweise in Abhängigkeit des gewählten Reaktionsmediums und unter Zuhilfenahme gewisser Modulatoren für die PLD-Aktivität, wie beispielsweise Metallionen, organische Lösemittel oder Trägermaterialien, spezifische Phospholipide herstellen kann.
Nachteilig bei all den vorbeschriebenen Verfahren ist die Tatsache, dass die PLD entweder in besonders reiner Form eingesetzt werden muss oder aber dass sie erst aufwändig an Trägermaterialien adsorbiert, also immobilisiert, und nach erfolgter Reaktion zum Zwecke der Rückgewinnung wieder abgetrennt werden muss, wobei auch in Kauf genommen wird, dass das Enzym zu einem großen Teil verbraucht wird.
Auch die Auswahl komplex zusammengesetzter Reaktionsmedien, die entweder ausschließlich aus organischen Lösemitteln bestehen oder aber aus mehrphasigen, wasserhaltigen Systemen, sind deshalb als nachteilig anzusehen, da die als Ausgangsmaterialien eingesetzten Phospholipide bekanntlich überwiegend lipophile Eigenschaften besitzen und dadurch zur Mizellbildung neigen, was deren Umsetzung bzw. Zugänglichkeit durch die PLD deutlich verschlechtern kann.
Aus den geschilderten Nachteilen des Standes der Technik hat sich für die vorliegende Erfindung die Aufgabe gestellt, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem Phosphatidylsenn aus einem Phospholipid(-Gemisch) und Serin in einem wässrigen System durch Transphosphatidylierung in Gegenwart eines Proteins mit Phospholipase D (PLD)-Aktivität und in Anwesenheit zweiwertiger Metallionen auf einfache und wirtschaftliche Weise in guten
Ausbeuten gewonnen werden kann. Dabei sollte insbesondere vermieden werden, dass komplizierte mehrphasige Systeme eingesetzt werden, wobei insbesondere die eingesetzten organischen Lösemittel keinen negativen Einfluss auf die Enzymaktivität ausüben sollten. Zudem war zu vermeiden, dass das Enzym aufwändig erst auf ein Trägermaterial aufgebracht und abschließend von diesem wieder zurückgewonnen werden muss. Schließlich stand auch das Ziel im Vordergrund, das Phosphatidylsenn in hohen Ausbeuten und in reinen Produktqualitäten zu erhalten.
Gelöst wurde diese Aufgabe mit einem entsprechenden Verfahren, welches in einem Lösemittelsystem durchgeführt wird, das aus
(a) 100 bis 60 Gew.-% Wasser oder eines wässrigen Puffers mit pH 5,0 bis 6,5 und (b) 0 bis 40 Gew.-% eines wassermischbaren organischen Lösemittels mit PLD-aktivierender Wirkung besteht,
und bei dem das erhaltene Phosphatidylsenn durch eine fraktionierende Reinigung abgetrennt wird.
Überraschend hat sich beim Einsatz dieses Verfahrens herausgestellt, dass dieses nicht nur gemäß Aufgabenstellung in völlig unkomplizierter Weise wirtschaftlich durchzuführen ist, sondern dass insbesondere die Gesamtreaktion ohne größere Komplikationen auch in einem rein wässrigen System, also in Wasser, ablaufen kann. Insbesondere der abschließende Verfahrensschritt der fraktionierenden Reinigung trägt der beanspruchten Verfahrensbreite insofern Rechnung, als damit in Abhängigkeit vom eingesetzten Lösemittelsystem das jeweils erhaltene Phosphatidylsenn in zufriedenstellenden Ausbeuten bei gleichzeitig großer Reinheit erhalten wird. Die Vorteile dieses Verfahrens waren insbesondere in dieser Ausprägung nicht vorherzusehen.
Bezüglich des Ausgangsmaterials in Form eines Phospholipids oder eines
Gemisches unterschiedlicher Phospholipide ist das vorliegende Verfahren keinerlei Einschränkung unterworfen. Als bevorzugte Phospholipid- Komponente sieht die Erfindung allerdings Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylinositol und Phosphatidsäure vor, die auch in beliebigen Mischungen eingesetzt werden können.
Die Breite des beanspruchten Verfahrens wird auch aus der eingesetzten Enzym-Komponente ersichtlich. So ist das vorliegende Verfahren nicht auf eine spezielle Phospholipase D beschränkt, wie sie beispielsweise aus spezifischen Mikroorganismen isoliert wird oder auch in rohen Fermentationsbrühen vorhanden ist, sondern es kann sich gemäß beanspruchtem Verfahren dabei um jegliche Proteine handeln, die eine Phospholipase D-Aktivität aufweisen. Diesbezüglich sieht die vorliegende Erfindung allerdings vorzugsweise vor, als Protein mit PLD-Aktivität eine Phospholipase D zu verwenden. Neben aufgereinigten Proteinen können im erfindungsgemäßen Verfahren auch teilgereinigte oder rohe Proteine, Proteinfraktionen und Extrakte eingesetzt werden.
Erfindungswesentlich für das Gelingen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist u.a. die Anwesenheit zweiwertiger Metallionen, wobei Calcium-, Magnesium- und/oder Zinkionen als bevorzugt anzusehen sind. Selbstverständlich können aber auch alle anderen geeigneten zweiwertigen Metallionen in Abhängigkeit vom erfindungsgemäß verwendeten Reaktionsmedium eingesetzt werden.
Hinsichtlich der Metallionen sieht die vorliegende Erfindung Konzentrationen von vorzugsweise maximal 100 mM vor, wobei Konzentrationen zwischen 0,1 und 20 mM als besonders bevorzugt angesehen werden, weil dadurch die Bildung von in Wasser oder gepufferten wässrigen Systemen schwer- bzw. unlöslichen Calciumsalzen zurückgedrängt werden kann.
Auch das Lösemittelsystem kann in breiten Bereichen variiert werden. Als bevorzugte Variante berücksichtigt die vorliegende Erfindung jedoch ein
System, welches 60 bis 95 Gew.-% der wässrigen Komponente (a) enthält, wobei Anteile zwischen 75 und 90 Gew.-% als besonders bevorzugt gelten. Besonders geeignet für das erfindungsgemäße Verfahren ist ein Lösemittelsystem, welches als Komponente (a) ausschließlich Wasser enthält, wobei selbstverständlich auch eine Verfahrensvariante angewendet werden kann, bei der die Reaktion nur in Wasser durchgeführt wird, also ohne Zuhilfenahme einer Puffer-Komponente oder gewisser Mengen eines organischen Lösemittels.
Von der vorliegenden Erfindung wird auch ein Lösemittelsystem umfasst, welches als wässrige Komponente (a) einen Acetat-, Citrat- oder Phosphat- Puffer und besonders bevorzugt einen Natriumacetat-Puffer enthält, wobei die erwähnten Puffer in Mengen zwischen 50 und 100 mM vorliegen sollten. Als besonders geeignet hat sich ein Lösemittelsystem erwiesen, das als wässrige Komponente (a) einen Puffer mit einem pH-Wert von etwa 5,6 aufweist.
Hinsichtlich der Komponente (b) sollte ein Lösemittelsystem eingesetzt werden, welches diese organische Komponente in Anteilen zwischen 5 und 40 Gew.-% und besonders bevorzugt zwischen 12 und 17 Gew.-% enthält. In diesem Zusammenhang werden sekundäre oder tertiäre Alkohole und insbesondere Isopropanol als besonders bevorzugte Komponente (b) angesehen.
Entgegen dem Stand der Technik ist das erfindungsgemäße Verfahren nicht auf eine spezifische PLD beschränkt, jedoch hat es sich für spezielle Verfahrensvarianten als durchaus empfehlenswert erwiesen, wenn das eingesetzte Protein mit PLD-Aktivität in immobilisierter Form eingesetzt wird.
Auch hinsichtlich der Reaktionstemperaturen beschränkt sich das erfindungsgemäße Verfahren nicht auf spezielle Bereiche. Allerdings werden Reaktionstemperaturen empfohlen, die zwischen 25 °C und 50 °C, wobei ein Bereich zwischen 40 °C und 45 °C als besonders bevorzugt gilt.
Falls das Verfahren gemäß Erfindung in einem ungepufferten Lösemittelsystem mit definiertem pH-Wert durchgeführt werden soll, empfiehlt es sich, dass der pH-Wert der Reaktionslösung durch Titration mit einer Base, z.B. Natronlauge, während der Reaktion konstant gehalten wird.
Um die Produktausbeute, also die Menge an Phosphatidylsenn, möglichst optimal zu gestalten, sieht die vorliegende Erfindung vor, den pH-Wert nach Reaktionsende auf 3,0 zu erniedrigen, wobei nach dieser pH-Erniedrigung ein Feststoff erhalten wird, der anschließend vorzugsweise von der Lösung abgetrennt wird. Dies kann üblicherweise durch bekannte Dekantationsverfahren erfolgen, da der Feststoff nach der pH-Wert- Erniedrigung meist auf dem Reaktionsmedium flotiert, was selbstverständlich insbesondere bei höheren Temperaturen in Bereichen zwischen 35 °C bis 40 °C in vorteilhafter Weise ausgeprägt der Fall ist.
Als zwingenden abschließenden Verfahrensschritt beansprucht die vorliegende Erfindung die fraktionierende Reinigung des erhaltenen Phosphatidylserins. Diesbezüglich empfiehlt es sich, die Reaktionslösung auf 5 bis 15 % ihres ursprünglichen Volumens einzuengen und zusätzlich oder aber alternativ dazu, die Reaktionslösung in das 8- bis 12-fache Volumen eines C1-3-Alkohols, wie z.B. Ethanol, zu geben.
Der mit Hilfe des bevorzugten Einengungsschrittes erhaltene Niederschlag kann in einer Form gewonnen werden, die Salze von Serin und Phosphatidylsenn, also des Ausgangsmaterials und des Produkts, enthält.
Möglich ist es aber auch, die ohne Einengungsschritt erhaltene alkoholische Lösung mit Anteilen an Phospholipiden zu gewinnen, wobei es besonders günstig ist, wenn diese Phospholipide in gelöster Form vorliegen.
Falls die Reaktion bei insgesamt erhöhten Temperaturen, wie sie beispielsweise Bereiche zwischen 30 °C und 50 °C darstellen, durchgeführt
wurde, kann überschüssiges Serin aus der Reaktionslösung in einfacher Art und Weise mit Hilfe einer Temperaturerniedrigung als Niederschlag abgetrennt werden, wobei als Temperaturuntergrenze 0 °C anzustreben sind.
Von der vorliegenden Erfindung wird im Hinblick auf die Abtrennung der Ausgangsmaterialien bzw. der Aufreinigung des Produktes eine Variante berücksichtigt, bei der die Fraktionierung der Phospholipide durch Extraktion mit Ethanol mit einem Wasseranteil zwischen 5 und 15 Gew.-% und besonders bevorzugt zwischen 8 und 12 Gew.-% durchgeführt wird. Dabei kann es insbesondere von Vorteil sein, wenn diesem Fraktionierungsschritt mindestens ein Waschschritt mit Wasser vorgeschaltet wird, wodurch Serin, welches noch im Phospholipid-Produkt enthalten sein kann, entfernt wird. Als vorteilhaft haben sich zwei bis drei Waschschritte erwiesen.
Einen besonderen Vorteil besitzt diese Fraktionierungsvariante deshalb, da damit ein Phosphatidylsenn mit besonders großer Reinheit gewonnen werden kann. Der verbleibende Rückstand gemäß vorliegender Erfindung enthält nämlich in der Regel Phosphatidylsenn mit einer Reinheit >80 Gew.- % und insbesondere mit einer Reinheit >95 Gew.-%.
Insgesamt ist es mit diesem erfindungsgemäßen Verfahren möglich, Phosphatidylsenn ausgehend von den bekannten Ausgangsmaterialien und in Anwesenheit üblicher Aktivatoren mit Hilfe von PLD-Aktivität aufweisenden Proteinen in einem äußerst einfachen Reaktionsmedium in wirtschaftlicher Weise und großer Reinheit zu gewinnen. Als besonders wesentlich ist dabei die abschließende fraktionierende Reinigung anzusehen, mit der es möglich ist, den jeweils eingesetzten Reaktionsmedien Rechnung zu tragen und das Phosphatidylsenn aus den daraus erhaltenen Niederschlägen in sehr guten Ausbeuten und Qualitäten zu erhalten.
Das nachfolgende Beispiel verdeutlicht die Vorteile des erfindungsgemäßen
Verfahrens.
Beispiel
Die Ausgangsstoffe Serin, CaCI2 und Epikuron 145V (Phospholipid-Gemisch der Degussa Food Ingredients GmbH) wurden in 100 ml Wasser bei 45 °C gelöst bzw. dispergiert. Es wurde eine Reaktionsmischung mit 3 Gew.-% Lecithin, 12 mM CaCI2 und 1 ,9 M Serin erthalten. Nach Einstellung des pH- Wertes auf 5,6 wurden 500 Units einer Phospholipase D zugegeben und die Reaktion gestartet. Der pH-Wert wurde während der Reaktionsdauer von 6 Stunden durch Titration mit 100 mM Natronlauge konstant gehalten. Nach Beendigung der Reaktion wurde der pH-Wert durch Zugabe von konzentrierter Säure (HCI) auf 3,0 eingestellt, wodurch die Lipidphase aggregiert wurde und sich von der wässrigen Phase getrennt hat. Nach vollendeter Trennung wurde die wässrige Phase entfernt und die Lipidphase 2 bis 3 mal mit dem gleichen Volumen entionisierten Wassers in einer Anmaischwäsche gewaschen. Zur Extraktion von Nebenprodukten wurde der noch feuchte Fiiterkuchen mit Ethanol versetzt, so dass ein Wassergehalt von 10 Gew.-% in der resultierenden Lösung erreicht wurde. Diese Mischung wurde für 8 Stunden bei 45 °C gut durchgemischt und anschließend der Niederschlag abfiltriert. Der erhaltenen Ethanol-feuchte Filterkuchen wurde vornehmlich im Vakuum getrocknet. Das so erhaltene Phosphatidylsenn besaß eine Reinheit von größer 90 Gew.-% und war frei von Enzymaktivität.
Claims
1. Verfahren zur Herstellung von Phosphatidylsenn aus einem Phospholipid(-Gemisch) und Serin in einem wässrigen System durch Transphosphatidylierung in Gegenwart eines Proteins mit Phospholipase D (PLD)-Aktivität und in Anwesenheit zweiwertiger Metallionen, dadurch gekennzeichnet, dass es in einem Lösemittelsystem durchgeführt wird, das aus
(a) 100 bis 60 Gew.-% Wasser oder eines wässrigen Puffers mit pH 5,0 bis 6,5 und (b) 0 bis 40 Gew.-% eines wassermischbaren organischen Lösemittels mit PLD-aktivierender Wirkung besteht, und dass das erhaltene Phosphatidylsenn durch eine fraktionierende Reinigung abgetrennt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass als Phospholipid-Komponente Phosphatidylcholin, Phospatidyiethanolamin, Phosphatidylinositol, Phosphatidsäure oder Mischungen daraus eingesetzt werden.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Protein mit PLD-Aktivität Phospholipase D verwendet wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es in Anwesenheit von Calcium-, Magnesium- und/oder Zinkionen durchgeführt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die zweiwertigen Metallionen in Konzentrationen von maximal 100 mM und bevorzugt in Konzentrationen zwischen 0,1 und 20 mM eingesetzt werden.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass ein Lösemittelsystem eingesetzt wird, welches 60 bis 95 Gew.-% und bevorzugt 75 bis 90 Gew.-% der wässrigen Komponente (a) enthält.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass ein Lösemittelsystem verwendet wird, welches als Komponente (a) ausschließlich Wasser enthält.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass ein Lösemittelsystem verwendet wird, welches als wässrige Komponente (a) einen Acetat-, Citrat- oder Phosphat-Puffer und besonders bevorzugt einen Natriumacetat-Puffer zwischen 50 und 100 mM enthält.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösemittelsystem als wässrige Komponente (a) einen Puffer mit einem pH-Wert von 5,6 enthält.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass ein Lösemittelsystem eingesetzt wird, das 5 bis 40 Gew.-% und besonders bevorzugt 12 bis 17 Gew.-% der Komponente (b) enthält.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass als Komponente (b) ein sekundärer oder tertiärer Alkohol und insbesondere Isopropanol eingesetzt wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass das Protein mit PLD-Aktivität immobilisiert eingesetzt wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionstemperatur zwischen 25 °C und 50 °C und bevorzugt zwischen 40 °C und 45 °C liegt.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert einer ungepufferten Reaktionslösung durch Titration mit Base, bevorzugt mit Natronlauge, während der Reaktion konstant gehalten wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis14, dadurch gekennzeichnet, dass nach Reaktionsende der pH-Wert auf 3,0 erniedrigt wird.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass der nach der pH-Erniedrigung erhaltene Feststoff von der Lösung abgetrennt wird.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionslösung im Rahmen der fraktionierenden Reinigung auf 5 bis 15 % ihres ursprünglichen Volumens eingeengt und/oder in das 8- bis 12-fache Volumen eines Cι-3-Alkohols, wie z.B. Ethanol, gegeben wird.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass mit Hilfe des Einengungsschritts ein Niederschlag in Form von Salzen des Serins und Phosphatidylsenn erhalten wird.
19. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass ohne Einengungsschritt eine alkoholische Lösung mit Anteilen an Phospholipiden, vorzugsweise in gelöster Form, erhalten wird.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass überschüssiges Serin aus der Reaktionslösung durch Temperaturerniedrigung, vorzugsweise auf 0 °C, als Niederschlag abgetrennt wird.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Fraktionierung der Phospholipide eine Extraktion mit Ethanol mit einem Wasseranteil zwischen 5 und 15 Gew.-% und bevorzugt zwischen 8 und 12 Gew.-% umfasst.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, dass der Fraktionierung mindestens ein Waschschritt mit Wasser zur Entfernung von Serin aus dem Phospholipid-Produkt vorgeschaltet wird.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass ein verbleibender Rückstand erhalten wird, der Phosphatidylsenn mit einer Reinheit >80 Gew.-% und insbesondere >95 Gew.-% enthält.
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