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Verfahren zur Gewinnung von reinem Erythromycin Die Erfindung betrifft
ein Verfahren zur Gewinnung von Erythromycin in reiner Form, insbesondere ein Verfahren
zur Gewinnung der Erythromycinbase aus der Fermentationsflüssigkeit in hoch gereinigtem
Zustand.
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Erythromycin ist ein Antibioticum, das bei der Kultivierung eines
Streptomyces-erythreus-Stammes in einem Kulturmedium, welches einen assimilierbaren
Lieferanten für Kohlenwasserstoffe, Stickstoff und anorganische Salze enthält, mit
anschließender Isolierung aus dem Kulturmedium erhalten wird.
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Die Erythromycinbase und ihre Additionssalze zeichnen sich durch ein
relativ weites bakterielles Spektrum aus. Sie weisen gegenüber zahlreichen Mikroorganismen,
sowohl grampositiven wie auch gramnegativen, eine antibiotische Wirksamkeit auf.
Eine weitere bedeutende Eigenschaft stellt ihre Fähigkeit dar, das Wachstum und
die Entwicklung von gewissen Rickettsia- (Rickettsail-) Körpern und großer Viren,
beispielsweise des epidemischen Typhus und der. Meningopneumonitis, und außerdem
einiger Spirochäten zu hindern. Auf Grund dieser antibiotischen Eigenschaften in
Verbindung mit ihrer niedrigen Toxizität haben sich diese Verbindungen bei der Behandlung
vieler Krankheiten außerordentlich bewährt.
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Es besteht daher ein starkes Interesse, Erythromycinbase enthaltende
Präparate nach normalen, für die Industrie annehmbaren Verfahren, bei denen die
Verluste an Erythromycinaktivität auf ein Minimum herabgesetzt sind, herzustellen
und Erythromycinpräparate zu produzieren, deren Reinheitsgrad so hoch ist, daß die
Produkte durch die normalen industriellen Kanäle verteilt werden können, ohne, daß
die anfängliche Wirksamkeit herabgemindert wird. Zu diesem Zwecke muß das Isolierungsverfahren
von Erythromycin so einfach
und direkt wie möglich sein und Produkte
mit hoher Erythromycinaktivität liefern. Die bisher bekannten und angewandten Erythromycinisolierungsverfahren
waren weder einfach, noch hatte das dabei erhaltene Erythromycinprodukt den gewünschten
Reinheitsgrad.
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Die Erfindung betrifft allgemein ein leistungsfähiges und einfaches
Verfahren, Erythromycin in hoch gereinigtem Zustand aus Lösungen, insbesondere aus
der Fermentierungsflüssigkeit, vorzugsweise in Form der freien Base zu isolieren.
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Bislang wurde die Erythromycinbase aus der Fermentationsflüssigkeit
in der Weise gewonnen, daß man das Kulturmedium filtrierte, auf einen pH Wert zwischen
9 und io, vorzugsweise etwa 9,5 einstellte und mit Alkylacetat, z. B. Amylacetat,
die Lösung extrahierte. Aus -der- Amylacetatlösung wurde die Erythromycinbase dann
in Wasser extrahiert, indem man den pH-Wert unterhalb von 6,5, vorzugsweise auf
etwa 5 einstellte und anschließend den wäßrigen Extrakt bei PH 7 im Vakuum einengte,
um die Kristallisation einzuleiten. Danach stellte man die Mischung auf einen pH-Wert
von etwa 9,5 ein, wobei die Erythromycinbase in fester, gewöhnlich kristalliner
Form ausfiel. Die rohe Base wurde abfiltriert oder abzentrifugiert und durch Umkristallisieren
gereinigt.
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Es wurde gefunden, daß man das Erythromycinprod.ukt verbessern kann,
wenn, mah- eine wäßrige Erythromycinsalzlösung von geeignetem alkalischem pH-Wert
mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, in welchem das Erythromycin
giit'löslich ist und das ein aussalzend wirkendes Mittel in geeigneter Konzentration
enthält, behandelt, danach die gesamte Mischung erhitzt, um eine Phasentrennung
zu bewirken, wobei das Erythromycinprodukt etwa quantitativ in die organische Lösungsmittelphase
extrahiert wird und man anschließend aus der Läsungsmittellösung die Erythromycinbase
durch Wasserzusatz zur Kristallisation bringt.
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Nach der bevorzugten Durchführungsform der Erfindung wird eine Erythromycinsalzlösung,
wie Erythromycinacetat oder Erythromycinsulfat, von dem Erythromycinfermentierungsmedium
mit einer Konzentration von etwa 40 000 Einheiten Erythromycin pro ccm bei
einem pH von mindestens etwa 8,5 mit einem organischen Lösungsmittel, in welchem
Erythromycin löslich ist, wie Aceton, Äthylalkohol und Isopropylalkohol, und einem
sehr wasserlöslichen anorganischen Salz, wie Natriumchlorid zum Aussalzen, das in
einer Konzentration von mindestens etwa Zoo g pro Liter der ursprünglichen Erythromycinsalzlösung
vorliegt, verrührt. Die dabei erhaltene Lösung wird entweder vor oder nach dem Erhitzen
auf ein pH zwischen 9,5. und i i eingestellt und auf etwa 35 bis 45°' erhitzt, wobei
die Phasentrennung eintritt, bei der etwa die gesamte Erythromycinaktivität in die
Acetonphase geht und die Salze in die wäßrige Phase gehen. Es hat sich als vorteilhaft
erwiesen, zunächst den pH-Wert der Erythromycinsalzlösung von etwa 8 bis 8,5 einzustellen,
dann auf eine Temperatur zwischen 35 und 45° zu erhitzen, das organische Lösungsmittel
und das für das Aussalzen bestimmte Salz hinzuzufügen und dann den pH-Wert der Mischung
auf etwa io bis io,8 einzustellen. Danach wird die Acetonphase abgetrennt, die im
ccm Zoo ooo bis 3oo ooo Einheiten Erythromycin enthält, bei einer Temperatur von
etwa 35 bis 45'°' so viel Wasser zugefügt, daß die Acetonlösung bei etwa 45`°' trüb
wird, dann die Lösung auf 15 bis 2o° abgekühlt und die Mischung bei Raumtemperatur
oder auch niedriger ohne Rühren 12 Stunden zur Kristallisation stehen gelassen.
Man filtriert die abgeschiedenen Kristalle ab, wäscht sie mit etwa 4oo/oigem wäßrigem
Aceton bei io bis 15° und trocknet sie im Vakuum bei etwa 7o'°'. Die so erhaltene
Erythromycinbase hat eine Biowirksamkeit von mindestens goo Einheiten Erythromycinpro
mg.
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An den folgenden Beispielen soll die bevorzugte Durchführungsform
der Erfindung näher erläutert werden. Beispiel i Eine Lösung von ungeklärtem Erythromycin-Acetatsalz
(i22o 1) mit einer Konzentration von 44 200 Einheiten Erythromycin pro ccm nach
der polarimetrischen Methode, einem pH von 7,5 und einer Temperatur von 6° wird
unter Rühren mit den folgenden Ingredienzien in der angegebenen Reihenfolge vermischt:
55o 1 Aceton, 141 ioo/oige Natriumhydroxydlösung, 368 kg Natriunichlorid, :231 ioo/oige
Natriumhydroxydlösung.
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Nach Zugabe der gesamten Natriumhydroxydlösung beträgt der pH-Wert
der Lösung etwa io,5. Die Mischung wird unter Rühren auf 35'°' erhitzt, wobei sich
die die Erythromycinbase enthaltende Acetonlösung von der wäßrigen Phase mit dem
Natriumchlorid abtrennt. Es werden 263 1 Aceton erhalten, die mehr als 991/o -der
Erythromycinaktivität der ursprünglichen Erythromycinsalzlösung aufweisen. Diese
Lösung wird bei 40° steril filtriert, danach unter ständigem Rühren steriles Wasser
zugefügt, bis die Lösung leicht trüb wird. Dann. hört man mit dem Rühren auf, kühlt
die Lösung auf 5 ° ab, filtriert die Kristalle ab, wäscht sie mit kaltem 4o9/oigem
Aceton, trocknet sie 24 Stunden lang im Vakuum bei 65°, mahlt sie und verpackt sie.
Aus der ursprünglichen Erythromycinacetatlösung erhält man eine Ausbeute von 8o,5
% Erythromycinbase mit einer Biowirksamkeit von 89z Erythromycineinheiten pro mg:
Beispiel 2 Eine Erythromycinacetatsalzlösung (113o 1) mit einer Biowirksamkeit von
37 00o Einheiten Erythromycin pro ccm wird bei PH 7,5 mit 6,8 kg einer Filterhilfe
und 2,72 kg einer Aktivkohle aufgeschlämmt, um ein klares Filtrat herzustellen.
Der so erhaltenen klaren Erythromycinlösung werden die folgenden Ingredienzien in
der Reihenfolge, in der sie aufgeführt sind, zugemischt: 595 1 Aceton (ioo/oige
Natriumhydroxydlösung bis auf PH 8,5), 40o kg Natriumchlorid (ioo/oige Natriumhydroxydlösung
bis zu pH io,,8).
Die dabei erhaltene Mischung wird unter Rühren
auf 4o° erhitzt. Nach Beendigung des Rührens trennt sich die erythromycinhaltige
Acetonschicht von der wäßrigen Natriumchloridschicht ab. Die die Erythromycinbase
enthaltende Acetonschicht wird bei 40° steril filtriert, mit 1741 Wasser verdünnt,
wobei die Lösung trüb wird und die Kristallisation einsetzt. Diese Lösung wird unter
Rühren langsam auf 2o° abgekühlt, die gebildeten Kristalle der Erythromycinbase
abfiltriert, mit kaltem, So%igem Aceton gewaschen, im Vakuum bei 70° getrocknet,
gemahlen und verpackt. Die Ausbeute an Erythromycinbase mit einer wasserfreien Biowirksamkeit
von 914 Einheiten Erythromycin pro mg beträgt 76 %, berechnet auf die nicht geklärte
Erythromycinacetatlösung.
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Beispiel 3 1200 ccm einer Erythromycinacetatsalzlösung mit einer Biowirksamkeit
von 402,00 Einheiten Erythromycin pro ccm wird bei einer Temperatur von 38° mit
den folgenden Ingredienzien in der angegebenen Reihenfolge unter Rühren vermischt:
510 ccm Aceton, 320 g Natriumchlorid (20% Natriumhydroxydlösung bis zu pH 1o,5).
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Nach Zugabe der Ingredienzien wird die Mischung noch 15 Minuten gerührt
und dann. die die Erythromycinaktivität aufweisende Acetonphase von der wäßrigen
Salzphase abgetrennt. Die Acetonphase (30o ccm), die pro ccm 156 25o Einheiten Erythromycin
aufweist, besitzt 97,3 % der ursprünglichen Erythromycinaktivität, die in der Erythromycinacetatsalzlösung
enthalten war. Der Acetonlösung der Erythromycinbase werden bei 30° 200 ccm Wasser
von 40''; zugefügt, wobei eine trübe Lösung erhalten wird, aus der die Erythromycinbase
sofort auszukristallisieren beginnt. Man läßt die Lösung zur Kristallisation ohne
Rühren etwa 12 Stunden bei Raumtemperatur stehen, dann filtriert man die Kristalle
ab, wäscht sie mit 5o%igem Aceton bei 2o° und trocknet sie bei 70°' 24 Stunden lang
im Vakuum. Die Ausbeute, bezogen auf die ursprüngliche Erythromycinacetatsalzlösung
beträgt 83,4% Erythromycinbase mit einer wasserfreien Biowirksamkeit von g18 Einheiten
Erythromycin pro mg. Beispiel 4 Eine Erythromycinacetatlösung (141) mit einer Biowirksamkeit
von 54 000 Erythromycineinheiten pro ccm wird aus einem Erythromycinfermentierungsmedium
erhalten, welches man bei einem PH von etwa 1o mit Amylacetat extrahiert, und hieraus
das Erythromycin mit Wasser, das mit Essigsäure auf einen pH-Wert von etwa 5 eingestellt
ist, wiederum extrahiert. Dieser Salzlösung werden bei 35° die folgenden Ingredienzien
in der angegebenen Reihenfolge unter Rühren zugemischt: 620o ccm Aceton, 440o g
Natriumchlorid (10°/o Natriumhydroxydlösung bis pH 1o,8) .
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Die Mischung wird 15 Minuten bei 35° gerührt. Anschließend trennt
sich die an Erythromycinbase angereicherte Acetonphase von der Natriumchlorid enthaltenden
wäßrigen Phase ab. Die wäßrige Schicht wird ein zweites Mal bei 35° mit 1500 ccm
Aceton extrahiert, um noch weitere Erythromycinbase zu isolieren. Die beiden Acetonextrakte
werden miteinander vereinigt, filtriert und auf 150o ccm Aceton verdünnt. Zu
300 ccm der vereinigten Acetonextrakte werden 300 ccm Wasser bei 40°
zugefügt, um in der Lösung eine Trübung zu erzeugen und die Kristallisation einzuleiten.
Die Lösung wird über Nacht in einen kalten Raum von etwa 5° gestellt, die abgeschiedenen
Kristalle filtriert, mit kaltem 5oo/oigem Aceton gewaschen und im Vakuum bei 70°
getrocknet. Die Ausbeute beträgt 81% Erythromycinbase in kristalliner Form mit einer
wasserfreien Biowirksamkeit von 984 Erythromycineinheiten pro mg. Beispiel 5 Eine
Erythromycinacetatlösung (250o ccm) mit einer Biowirksamkeit von 29 Soo Einheiten
Erythromycin pro ccm bei 35° wird mit den folgenden Ingredienzien in der angegebenen
Reihenfolge unter Rühren vermischt: 375 ccm Isopropylalkohol, 950 g Natriumchlorid
(1oQ/oige Natriumhydroxydlösung bis pH 1o,5).
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Die Mischung wird 15 Minuten bei 35° gerührt. Anschließend trennt
sich die an Erythromycin angereicherte Isopropylalkoholphase von der wäßrigen Natriumchloridphase
ab. Der Erythromycin enthaltenden Isopropylalkoholphase wird so viel Wasser - zugemischt,
daß die Lösung trüb wird. Dann stellt man die Lösung in einen kalten Raum, um die
Kristallisation zu vervollständigen. Man filtriert dann die Lösung ab, wäscht die
Kristalle mit 5oo/oigem Isopropanol bei 70° im Vakuum. Die erhaltenen Kristalle
der Erythromycinbase haben eine Biowirksamkeit von 90o Einheiten Erythromycin pro
mg. Beispiel 6 120o ccm einer Erythromycinacetatlösung mit einer Biowirksamkeit
von 4o 20o Einheiten Erythromycin pro ccm bei 35° wird unter Rühren mit den folgenden
Ingredienzien in der angegebenen Reihenfolge vermischt: 51o ccm Aceton,
320 g Natriumchlorid (2o%ige Natriumhydroxydlösung bis pH 1o,5).
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Die Mischung wird 15 Minuten bei 35° gerührt. Nach Beendigung des
Rührens trennt sie sich in eine an Erythromycin angereicherte Acetonphase und eine
Natriumchlorid enthaltende wäßri_ge Phase. Die Acntonphase wird isoliert, in einem
kalten Raum auf etwa 2° abgekühlt, wobei im wesentlichen die gesamte Erythromycinbase
aus dem Acetonlösungsmittel auskristallisiert. Dann filtriert man die Lösung, wäscht
die Kristalle mit wasserfreiem Aceton bei etwa o° und trocknet die kristalline Erythromycinbase
bei etwa 70° im Vakuum, wobei eine Erythromycinbase mit einer Biowirksamkeit von
895 Einheiten Erythromycin pro mg in einer Ausbeute von 71%, auf das Gewicht
der
Ausgangs-Erythromycinacetatlösung bezogen, erhalten wird.
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In den vorhergehenden Beispielen, an denen die bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung veranschaulicht werden sollte, wird das Erythromycin aus der Lösung
in einem organischen Lösungsmittel durch Wasser ausgefällt, da hierdurch das Erythromycin
in einer kristallinen Form anfällt, die sich gut filtrieren läßt. Das-Erythromycin
kann aber auch aus der organischen Lösungsmittellösung auf verschiedenen anderen
Wegen gewonnen werden. So ist es z. B. möglich, durch Zusatz eines organischen Kohlenwasserstoffs,
wie eines industriellen Petroleumnaphthalösungsmittels, das Erythromycin aus der
organischen Lösung zu fällen. Nach einer- Alternativmöglichkeit kann die Erythrornycinaktivität
aus der Lösungsmittellösung in Form eines Erythromycinsalzes gewonnen werden, indem
man der Lösung eine. Säure, wie die Palmitinsäure, zufügt, mit der das Erythromycin
ein in dem organischen Lösungsmittel verhältnismäßig schwer lösliches Salz bildet.
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Es ist weiterhin möglich, die Erythromycinbase einfach dadurch aus
.der organischen Lösungsmittellösung zu isolieren, daß man die organische Lösung
kühlt und so lange stehenläßt, bis die Erythromycinbase ausfällt.
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In den Beispielen ist zwar hauptsächlich Aceton als Lösungsmittel
für die Erythromycinbase genannt. Statt dessen können mit gleichem Erfolg auch andere
übliche mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel, in denen die Erythromycinbase
löslich ist, sowie: die alkoholischen Lösungsmittel, z. B. Äthylalkohol, Isopropanol-
und tertiärer Butylalkohol, verwendet werden.. Außer den weiter oben angeführten
Lösungsmitteln können noch andere bekannte organische Lösungsmittel verwendet werden.
Desgleichen können auch andere Stoffe -zum Aussalzen, z. B. anorganische Salze,
mit einer verhältnismäßig hohen Wasserlöslichkeit, z. B. Calciumchlorid und Ammoniumsulfat,
in dem Verfahreri gemäß der Erfindung verwendet werden. Es soll weiterhin darauf
hingewiesen werden, daß der pH-Wert der Erythromycinlösungebensogut wie mit Natriumhydroxyd
auch mit Kaliumhydroxyd oder anderen alkalischen Reagenzien, die gewöhnlich benutzt
werden, um ein pg zwischen etwa 8,5 und i i,o einzustellen, verwendet werden.