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Verfahren zur Reinigung von Desmethylchlortetracyclin
Die Erfindung betrifft die Reinigung von Desmethylchlortetracyclin, insbesondere ein verbessertes Verfahren zur Extraktion von Desmethylchlortetracyclin aus dasselbe enthaltenden Gärmaischen.
Die Desmethyltetracycline, Desmethyltetracyclin selbst und Desmethylchlortetracyclin (7-Chlor- - 6-dexmethyltetracyclin) gehören einer neuen Reihe von Tetracyclinantiblotica an, die in der USA-PatentschriftNr. 2, 878, 289 beschrieben sind. Die darin beschriebenen Desmethyltetracycline werden durch bestimmte Mutanten von Streptomyces aureofaciens erzeugt, die von dem aus dem Boden isolierten Stamm S. aureofaciens A-377 abgeleitet sind, welcher in der USA-PatentschriftNr. 2. 482, : J55beschrie- ben und im Northern Regional Research Laboratory. Peoria, Illinois, unter der Nummer NRRL 2209 hinterlegt wurde. Die neuen, Desmethyltetracyclin erzeugenden Stämme wurden durch Behandlung des Stammes A-377 mit mutagenen Mitteln gewonnen.
Kulturen der neuen, Desmethyltetracyclin erzeugenden Stämme von S. aureofaciens sind in der American Type Culture Collection, Washington, D. C. unter den ATCC-Nummern 12. 551, 12. 552, 12. 553 und 12. 554 hinterlegt.
Desmethylchlortetracyclin hat im Vergleich zu dem bekannten, mit einem breiten Wirkungsspektrum ausgestatteten Antibiotikum Tetracyclin wesentlich stärkere antibiotische Wirksamkeit gegen empfindliche Organismen ; es zeigt erheblich grössere Stabilität in Körperflüssigkeiten ; es weist verbesserte Widerstandsfähigkeit gegen Abbau und eine geringe Nierenclearence-Geschwindigkeit auf, so dass lange Zeit eine starke antibiotische Wirksamkeit vorhanden ist.
Es verursachte erhebliche Schwierigkeiten, ein technisch günstiges Reinigungsverfahren zur Gewinnung von Desmethylchlortetracyclin aus Gärmaischen zu entwickeln. Man könnte auf Grund der Strukturähnlichkeiten zwischen Chlortetracyclin und Desmethylchlortetracyclin annehmen, dass die bei der Reinigung von Chlortetracyclin zufriedenstellenden Reinigungsverfahren auch zur Reinigung von Desmethylchlortetracyclin geeignet sind. Es wurde jedoch entgegen den Erwartungen nachgewiesen, dass dies nicht der Fall ist. Wenn versucht wurde, Desmethylchlortetracyclin nach einem der für die Gewinnung von Chlortetracyclin entwickelten günstigeren, z.
B. dem in der USA-Patentschrift Nr. 2, 655, 535 entwik- kelten Verfahren zu gewinnen, wobei man Chlortetracyclin mit n-Butanol bei einem pH-Wert von etwa 1, 5 aus der Gärmaische extrahiert, anschliessend den Butanolextrakt einengt und das Chlortetracyclin als saures Salz gewinnt, wurde festgestellt, dass man sehr geringe Ausbeuten von etwa 351o unreinem Dexme-
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Butanolextraktmethylchlortetracyclin gewonnen werden. Das in der USA-Patentschrift Nr. 2, 655, 535 beschriebene Verfahren kann daher nicht in zufriedenstellender Weise zur Reinigung von Desmethylchlortetracyclin verwendet werden.
Erfindungsgemäss wird ein Verfahren zur Gewinnung von gereinigtem Desmethylchlortetracyclin aus einer dasselbe in Form eines Erdalkalimetallniederschlages enthaltenden Gärmaische entwickelt, wobei man die Maische auf einen sauren pH-Wert einstellt, um das Desmethylchlortetracyclin löslich zu machen, die Maische filtriert, die freien Erdalkalimetallionen des Filtrats auf eine vorher bestimmte Menge vermindert, eine quaternäre Ammoniumverbindung und ein mit Wasser nicht mischbares organisches Lösungsmittel zugibt, die Mischung auf einen alkalischen pH-Wert einstellt und das Desmethylchlortetracyclin aus der Phase des organischen Lösungsmittels extrahiert.
Das Antibiotikum kann aus der Lösungs-
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dem Stickstoffatom verbundenen langketrigen Alkylgruppen variieren. Nachfolgend sind einige typische Arquads erwähnt, die im Handel erhältlich sind und vorteilhaft bei der Ausführung des erfindungsgemässen Verfahrens verwendet werden können.
Arquad Verbindungen
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<tb>
<tb> Substituierte <SEP> Kohlenstoffkette <SEP> 0 <SEP> 2HT <SEP> 12 <SEP> 16 <SEP> 18 <SEP>
<tb> Gruppen <SEP> Länge <SEP> z <SEP> % <SEP> % <SEP> % <SEP> % <SEP> % <SEP> % <SEP>
<tb> Octyl <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP>
<tb> Decyl <SEP> 10 <SEP> 9-9
<tb> Dodecyl <SEP> 12 <SEP> 47 <SEP> 47 <SEP> 90 <SEP>
<tb> Tetradecyl <SEP> 14 <SEP> 18--M--9
<tb> Hexadecyl <SEP> 16 <SEP> 8 <SEP> 30 <SEP> 8 <SEP> 10 <SEP> -- <SEP> 90 <SEP> 6
<tb> Octadecyl <SEP> 18 <SEP> 10 <SEP> 70 <SEP> 5 <SEP> 10--6 <SEP> 93
<tb> Octadecenyl <SEP> 18 <SEP> -- <SEP> -- <SEP> 5 <SEP> 35 <SEP> 1 <SEP> 4 <SEP> 1
<tb> Octadecadienyl <SEP> 18------45
<tb>
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Arquadchlorid wiedergewonnen we-den.
Dieses Isolierungsverfahren ist dadurch besonders vorteilhaft, dass hoch- gereinigtes von den epimeren Formen freies Desmethylchlortetracyclin erhalten wird.
Die folgenden-Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.
Bei s piel l : Gewinnung von 7-Chlor-6-Desmethyltetracyclin neutral.
2 kg einer Desmethylchlortetracyclin enthaltenden Gärmaische wurden durch Zugabe von Schwefel- säure auf den PH-Wert 1, 8 eingestellt. 150 g Hyflo Super-Cel (ein Diatomeenerdefiltrierhilfsmittel) wurden zugegeben und die Mischung 30 min vor dem Filtrieren gerührt. Der Filterkuchen wurde bei einem pH-Wert von 1, 7 mit heissem Wasser erneut extrahiert und filtriert. Diese beiden sauren Filtrate wurden vereinigt und das vereinigte saure Filtrat mit 31, 9 g Ammoniumoxalat behandelt, 30 min gerührt und filtriert. 2660 ml dieses wässerigen Filtrats wurden mit 319 ml Methyl-isobutyl-keton und 12 ml 50% Ce- tyltrimethylammoniumchlorid (Arquad 16) in Isopropanol versetzt. Die Mischung wurde mit Natrium- hydroxyd auf den PH-Wert 10, 0 eingestellt, 30 min gerührt und dann die wässerigen und organischen
Phasen zur Trennung stehen gelassen.
Der grösste Teil der Wasserphase wurde entfernt. Die restliche
2-Phasen-Mischung wurde unter Verwendung vonHyfloSuper-Cel filtriert und das Filtrat aufbewahrt. Der
Filterkuchen wurde mit 70 ml Methyl-isobutyl-keton gewaschen und dann die Waschflüssigkeit und das aufbewahrte Filtrat vereinigt. Die Lösungsmittelphase wurde entfernt und mit 45 ml Wasser beim pH-Wert
10 gewaschen. Das Waschwasser wurde abgetrennt und verworfen. Die Lösungsmittelphase wurde zweimal extrahiert ; zunächst mit 70 ml Wasser beim pH-Wert 2 und dann mit 35 ml Wasser bei einem ähnlichen
PH-Wert.
Diese beiden Wasser-Rückextrakte wurden vereinigt, mit 3 g Tetranatriumsalz von Äthylen-di- amin-tetraessigsäure (Versene) versetzt und der PH-Wert mit verdünnter Natronlauge zur Ausfällung von
Neutral-Desmethylchlortetracyclin in kristalliner Form auf 6 eingestellt. Die Ausbeute aus der Desme- thylchlortetracyclin-Maische betrug 40%.
Beispiel 2 : Gewinnung von 7-Chlor-6-Desmethyltetracyclinhydrochlorid.
13 1 Desmethylchlortetracyclin-haltige Maische wurden mit 1500 g Hyflo Super-Cel versetzt. Die
Mischung wurde mit Schwefelsäure auf den pH-Wert 1, 3 eingestellt, gerührt und filtriert. Das Filtrat wurde aufbewahrt und der Filterkuchen mit heissem Wasser beim PH-Wert 1, 3 rückextrahiert, dann fil- triert und das Filtrat aufbewahrt. Die beiden sauren Filtrate wurden vereinigt und zu den 22 1 vereinigtem saurem Filtrat wurden 300 g Ammoniumoxalat zugegeben. Der pH-Wert der Mischung wurde auf 1, 8 eingestellt und die Mischung wurde anschliessend gerührt und filtriert. Zum wässerigen Filtrat wurden
1600 ml Methyl-isobutyl-keton und 51 ml 50% Cetyltrimethylammoniumchlorid (Arquad 16) zugegeben ; dann wurde der PH-Wert mit 375 ml18 n-Natriumhydroxydlösung auf 9, 3 eingestellt.
Die Mischung wurde gerührt und filtriert und das Filtrat aufbewahrt. Der Filterkuchen wurde mit
100 ml Methylisobutyl-keton gewaschen, das dann mit dem Filtrat vereinigt wurde. 1260 ml der Phase des Lösungsmittels wurden mit 150 ml Wasser versetzt. Die Mischung wurde mit 5, 5 ml 12 n-Salzsäure angesäuert und gerührt. Der wässerige Extrakt wurde von der Phase des Lösungsmittels abgetrennt. Die
173 ml Wasserrückextrakt wurden mit 82ml n-Butanol und 17, 4 g Natriumchlorid versetzt. Die Mischung wurde gerührt, bevor die wässerige und die Phase des organischen Lösungsmittels getrennt wurden. Die
99 ml n-Butanolextrakt wurden im Vakuum bei 30-35 C auf 60 ml eingeengt. Ein Anteil von 15 ml
2-Äthoxyäthanol wurde zugegeben, der pH-Wert mit 2, 1 ml konzentrierter Salzsäure auf 1, 0 eingestellt, die Mischung geimpft und gealtert.
Die sich bildenden Kristalle wurden abfiltriert und zunächst mit 15 ml einer Mischung von 2-Äthoxyäthanol und n-Butanol im Verhältnis 1 : 3 und dann mit 15 ml Äther gewa- schen. Die gewaschenen Kristalle wurden bei 400C im Vakuum getrocknet ; es wurden 6, 21 g mit einer
Aktivität von 921 y/mg, entsprechend einer Ausbeute von 31, 20/0 aus der Maische erhalten.
Beispiel 3 : Gewinnung von 7-Chlor-6-Desmethyltetracyclinhydrochlorid.
4 kg Desmethylchlortetracyclin enthaltende Gärmaische mit einer Aktivität von 1540 y/ml wurden mit 130 ml 25% iger Schwefelsäurelösung auf den PH-Wert 1, 3 eingestellt, 30 min gerührt und unter Ver- wendung von 100 gHyflo Super-Cel filtriert. Das Filtrat wurde aufbewahrt. Der Filterkuchen wurde wieder mit 2 l Wasser bei 500C aufgeschlämmt, unter Verwendung von 25% figer Schwefelsäurelösung auf den pH-Wert 1, 5 angesäuert, 30 min gerührt und filtriert.
Die Filtrate wurden vereinigt, so dass sich 5600 ml eines vereinigten sauren Filtrats ergaben. 1870 ml Filtrat (entsprechend ein Drittel des Gesamtansatzes) wurden entfernt und folgendermassen entkalkt : 26, 7 g Oxalsäure wurden zu dem Anteil des sauren Filtrats zugegeben und die Mischung gerührt, bis sich die Oxalsäure vollständig aufgelöst hatte. Dann wurde der
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iger Natriumhydroxydiösungtur (25 5 C) stehen gelassen, damit das Calciumoxalat ausfallen konnte. Der Calciumoxalat-Niederschlag wurde abfiltriert, so dass sich 1980 ml entkalktes vereinigtes, saures Filtrat ergab. 990 ml davon wurden folgendermassen auf Desmethylchlortetracyc1inhydrochlorid verarbeitet : 5, 2 ml Arquad 16 (33%,
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wässerig) wurden zu den 990 ml Filtrat zugegeben. Ausserdem wurden 100 ml Methyl-isobutyl-keton zu dem Filtrat hinzugefügt.
Der pH-Wert der Mischung wurde mit 25% iger Natriumhydroxydiösung auf 9, 5 eingestellt. Die Mischung wurde 30 min gerührt, dann filtriert, das Filtrat 30 min stehen gelassen, um die beiden Phasen zu trennen. Die Phase des Lösungsmittels wurde abdekantiert und mit 7 ml Wasser vermischt. Der pH-Wert dieses Zweiphasensystems wurde mit 1,5 ml konzentrierter Salzsäure auf 0, 5 eingestellt. Nach 19, 5stündiger Alterung auf einer Schüttelmaschine wurden die gebildeten Kristalle abfiltriert und nacheinander mit Methyl-isobutyl-keton und Chloroform gewaschen. Die gewaschenen Kristalle wurden dann 5 h bei 600C im Vakuum getrocknet. 0, 595 g Desmethylchlortetracyclinhydrochlorid mit
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trierhilfsmittel wurde zugegeben.
Die Maische wurde 30 min gerührt und dann auf einem zuvor überzogenen Rotationsvakuumfilter filtriert. Das saure Filtrat der Maische wurde gesammelt und der Filterkuchen bei Zimmertemperatur (25 50C) in 50% (Volumen/Volumen) Wasser wieder aufgeschlämmt. Der pH-Wert des Breis wurde mit 25% luger Schwefelsäure auf 1, 0 eingestellt und es wurde 30 min gemischt. Der Brei wurde auf 600C erhitzt und dann durch das gleiche vorüberzogene Filter filtriert.
Das Filtrat der erneuten Aufschlämmung wurde auf Zimmertemperatur abgekühlt und zur Extraktion mit dem sauren Filtrat der Maische vereinigt. 2% (Gewicht/Volumen) Oxalsäure, bezogen auf die ursprüngliche Maische, wurde zu dem vereinigten sauren Filtrat zugegeben und der pH-Wert mit 50%iger Natronlauge auf 1, 5 eingestellt.
Der Ansatz wurde dann 30 min gerührt, um die Ausfällung von Calciumoxalat zu vervollständigen. 4, 8 ml Arquad 16 (33%igue wässerige Lösung) pro Gramm Desmethylchlortetracyclin In der Maische und 100/0
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trakt wurde von der Extraktionszentrifuge abgetrennt und zur weiteren Verarbeitung gesammelt. Das ausgezogene vereinigte saure Filtrat und der Schlamm wurden verworfen. 10% (Volumen/Volumen) Leitungswasser wurden zu dem Methyl-isobutyl-keton-Extrakt zugegeben und der PH-Wert mit konzentrierter Salzsäure auf 0, 8-1, 0 eingestellt ; dann wurde er etwa 15 h bei diesem pH-Wert unter konstantem Rühren bei Zimmertemperatur gealtert. Nach beendeter Alterung wurden die Kristalle aus der ZweiphasenMutterlauge abfiltriert.
Das rohe Desmethylchlortetracyclinhydrochlorid wurde zweimal mit 1% Methyl- - isobutyl-keton, bezogen auf das Maischenvolumen, zur Verdrängung gewaschen. Aus allen Filtraten wurde das Lösungsmittel zurückgewonnen und die Kristalle bei 500C etwa 16 h getrocknet, bevor sie gewoben und zur Prüfung in Proben eingeteilt wurden. Die Testergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 gezeigt.
Vier weitere getrennte 1400 l-Ansätze (Nr. 5, 6, 7 und 8) von Desmethylchlortetracyclin enthaltender Maische wurden, wie oben beschrieben, verarbeitet, jedoch mit der Abänderung, dass 28% ige NH OH-Lö- sung als Extraktionsbase an Stelle von 500/piger Natronlauge verwendet wurde. Die Textergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 gezeigt.
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Tabelle 1 NHOHbzw. NaOH
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<tb>
<tb> - <SEP> --- <SEP> Prüfung
<tb> Ansatz <SEP> Maischen-Roh-Desmethyl-Desmethyl-Photo-MikroNr. <SEP> aktivität <SEP> produkt <SEP> chlortetra-tetracyclin <SEP> spectro-biologisch <SEP> E <SEP> 10/0 <SEP> bei
<tb> y/ml <SEP> % <SEP> cyclin <SEP> y/mg <SEP> metrisch <SEP> % <SEP> 460 <SEP> mil <SEP>
<tb> γ
/mg <SEP> % <SEP> 460 <SEP> m
<tb> 1 <SEP> 1270 <SEP> 44,8 <SEP> 979 <SEP> 58 <SEP> 1010 <SEP> 1053 <SEP> , <SEP> 28
<tb> 2 <SEP> 1340 <SEP> 41, <SEP> 4 <SEP> 890 <SEP> 139 <SEP> 1014 <SEP> 861 <SEP> 0, <SEP> 41 <SEP>
<tb> 3 <SEP> 1230 <SEP> 41, <SEP> 6 <SEP> 835 <SEP> 102 <SEP> 911 <SEP> 855 <SEP> 0, <SEP> 60 <SEP>
<tb> 4 <SEP> 1790 <SEP> 43, <SEP> 5 <SEP> 889 <SEP> 52 <SEP> 942 <SEP> 895 <SEP> 0, <SEP> 34 <SEP>
<tb> 0 <SEP> 1407 <SEP> 42, <SEP> 8 <SEP> 898 <SEP> 88 <SEP> 969 <SEP> 916 <SEP> 0, <SEP> 41 <SEP>
<tb> 5 <SEP> 1310 <SEP> 58, <SEP> 0 <SEP> 910 <SEP> 90 <SEP> 977 <SEP> 891 <SEP> 0, <SEP> 26 <SEP>
<tb> 6 <SEP> 1200 <SEP> 61, <SEP> 8 <SEP> 900 <SEP> 120 <SEP> 983 <SEP> 1001 <SEP> 0, <SEP> 24 <SEP>
<tb> 7 <SEP> 820 <SEP> 71, <SEP> 7 <SEP> 914 <SEP> 125 <SEP> 1007 <SEP> 1039 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP>
<tb> 8 <SEP> 790 <SEP> 65,
<SEP> 5 <SEP> 909 <SEP> 82 <SEP> 1039 <SEP> 981 <SEP> 0, <SEP> 23 <SEP>
<tb> 1030 <SEP> 64, <SEP> 3 <SEP> 908 <SEP> 104 <SEP> 1002 <SEP> 978 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP>
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