AT205674B - Verfahren zur Herstellung eines N-Glykosides von 5-Flour-uracil - Google Patents

Description

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  Verfahren zur Herstellung eines N-Glykosides von 5-Fluor-uracil 
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen N-Glykosides von 5Fluor-uracil, u. zw. eines N-Desoxyribosides von 5-Fluor-uracil, wie   z. B. 2'-Desoxy-5-fluor-uridin,     d. h.   von l'-   (ss-D-2-Desoxyribofuranosyl)-5-fluor-uracil.   



   Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man 2-Desoxy-ribose von einem 2-Desoxy-ribosid mittels Streptococcus fecalis (ATCC 8043) enzymatisch auf 5-Fluor-uracil überträgt und das erhaltene 2'-Desoxy-5-fluor-uridin gewünschtenfalls mit einer Base in ein Salz    überführt.   



   Als 2-Desoxy-ribosid, das die 2-Desoxy-ribose liefern kann, verwendet man vorzugsweise Thymidin. 



   Die N-Glykoside von 5-Fluor-uracil und ihre Salze sind nützlich als antiseptische Mittel,   z.     B.   gegen gram-positive Bakterien, wie Staphylococcus aureus und gegen Pilze, wie Scopulariopsis   brevicaulis.   Sie sind auch verwendbar als Antimetaboliten im Nucleinsäureaufbau und verhindern so das Wachstum der Zellen,   z. B.   beim Lactobacillus leichmannii. 



   Das als Ausgangsmaterial verwendete 5-Fluor-uracil kann wie folgt hergestellt werden :
Eine Mischung von 103, 6 g frisch hergestelltem Kaliumsalz des Hydroxymethylen-fluoressigsäure- äthylesters, hergestellt durch Umsetzung von Fluoressigsäureäthylester mit Ameisensäureäthylester in Gegenwart von   Kaliumalkoholat, 83. 4   g (0, 3 Mol) des Sulfates von S-Methyl-isothioharnstoff und 32. 5 g (0, 6 Mol) Natriummethanolat wird unter Rühren in 1500   cms   absolutem Methanol unter Rückfluss erhitzt. 



  Nach vorübergehender Lösung wird eine Fällung beobachtet. Nach zweistündigem Erhitzen unter Rückfluss wird das Reaktionsgemisch im Vakuum zur Trockne eingedampft und der Rückstand mit 280   cms   Wasser behandelt. Das entstandene Gemisch wird durch Kohle filtriert und das entfärbte Filtrat durch Zusatz von 48   cm 37 % iger   Chlorwasserstoffsäure schwach kongosauer gestellt. Die gebildeten Kristalle werden abfiltriert, mit Wasser sulfatfrei gewaschen und bei 1000 getrocknet. Man erhält den rohen S-Methyläther von 2-Thio-5-fluor-uracil vom Schmelzbereich   202 - 2210.   Nach dem Lösen in 2035   cms   siedendem Äthylacetat und Abkühlen auf-200 schmilzt das Produkt bei 230 - 2370. Nach weiterem Umkristallisieren aus Wasser (oder aus Äthylacetat) steigt der Schmelzpunkt auf 241 - 243. 



   Eine Lösung von 10 g S-Methyläther von 2-Thio-5-fluor-uracil vom Schmelzpunkt   239 - 2370   in 150   cms   37   %iger   wässeriger Chlorwasserstoffsäure wird unter Stickstoff vier Stunden unter Rückfluss erhitzt. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum abgedampft und der bräunliche kristalline Rückstand aus Wasser umkristallisiert. Das Produkt wird durch Sublimation im Vakuum   (0, 1 mm, 190-200 Badtem-   peratur) weitergereinigt. Man erhält farblose oder rötliche Kristalle vom Schmelzpunkt    282 - 2830   (unter Zersetzung). 



     Beispiel l :   Zellen von Streptococcus fecalis (ATCC 8043) werden auf einem AOAC-FolsäureNährboden gezüchtet (Lepper, Official and Tentative Methods of the Association of Official Agricultural   Chemists, Washington, D. C., 7. Auflage (1950),   Seite 784), dem 2 mg/l Thymin zugesetzt wurden ; entsprechend den Angaben von Prusoff, Proc. Soc. Exp. Biol. & Med. 85 (1954), Seite 564. Nach 20-stündigem Brüten bei 37  werden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen.

   Die erhaltenen Zellen werden' dreimal mit dem 4-fachen Volumen einer Kaliumphosphat-Pufferlösung gewaschen (n/15 wässerige Monokaliumorthophosphatlösung, die durch Zugabe von 2 n Kalilauge   auf PH 8. 0   gebracht wurde), gewogen 

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 und schliesslich in der obigen Kaliumphosphat-Pufferlösung suspendiert und in einem Clashomogenisator nach Potter verrieben. 



   900 mg nasse Zellen werden mit der obigen   Kaliumphosphat-Pufferlösung   zu 25 cm3 eines Enzympräparates zubereitet. 150 mg   (1, 15 Millimol) 5-Fluor-uracil   und 1, 0 g   (4, 12 Millimol) Thymidin   werden in 15 cmS der obigen Kaliumphosphat-Pufferlösung gelöst. Die zwei Lösungen werden vereinigt und während 18 Stunden bei 370 bebrütet. Nach dieser Zeit wird die Enzymwirkung durch Zusatz von 4 Volumen Azeton und 1 Volumen peroxydfreiem Diäthyläther gehemmt. Die ausgefallenen festen Teile werden abfiltriert ; das Filtrat wird unter Stickstoff und vermindertem Druck eingedampft, bis die flüchtigen organischen Lösungsmittel im wesentlichen entfernt sind. Es verbleiben ungefähr 20 cm einer wässerigen Lösung, welche in 100   cm   destilliertem Wasser aufgenommen wird. 



   0, 01 cms dieser Lösung werden auf einem mit 0, 2 n Monokaliumorthophosphat (PH 7, 8) gepuffertem Papier der absteigenden Chromatographie unterworfen, wobei als Lösungsmittel eine Mischung von Alko-   hol/Wasser/n-Butyläther   (80 : 13 : 7) verwendet wird. Eine unter ultraviolettem Licht ersichtliche Stelle vom Wert Rf   =   0, 55 wird mit 0, 1 n Salzsäure ausgelaugt und auf Desoxyribose geprüft (nach Stumpf, J. Biol. Chem. 169 (1947), Seite 367). Diese Analyse zeigt die Anwesenheit von mindestens 85, 5 mg   (0, 35 Millimol)   2'-Desoxy-5-fluor-uridin in dem proteinfreien Reaktionsgemisch. 



   2'-Desoxy-5-fluor-uridin hat saure Eigenschaften und bildet Salze mit Basen. Durch Reaktion von 2'-Desoxy-5-fluor-uridin mit pharmazeutisch brauchbaren Basen,   z. B. Alkali- und Erdalkalihydroxyde,   Ammoniak, nicht-toxische organische Basen,   z. B. Äthanolamin, usw.,   bilden sich Salze. 



   2'-Desoxy-5-fluor-uridin und seine pharmazeutisch brauchbaren Salze sind wertvoll als antibak- 
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B.usw. 



   Beispiel 2 : Zellen von Streptococcus fecalis (ATCC 8043) werden gemäss Beispiel 1 gezüchtet und aufgearbeitet. 
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 Enzympräparates zubereitet. 200 mg (1, 54 Millimol) 5-Fluor-uracil und 1, 50 g (6, 16 Millimol) Thymidin werden in 15 cm3 der obigen Kaliumphosphat-Pufferlösung gelöst. Die zwei Lösungen werden vereinigt und während 18 Stunden bei    370   bebrütet. Nach dieser Zeit wird die Enzymwirkung durch Zusatz von 4 Volumen Azeton und 1 Volumen peroxydfreiem   Diäthyläther   gehemmt. Die ausgefallenen festen Teile werden abfiltriert ; das Filtrat wird wie gemäss Beispiel 1 weiterverarbeitet und liefert etwa 20 cm3 einer wässerigen Lösung, welche in 100   eins   destilliertem Wasser aufgenommen wird. 



   Die Lösung wird nochmals im Vakuum auf 5 cms eingeengt, und dann durch Zusatz von 20 cm3   1   n wässeriger Natronlauge alkalisch gestellt, wobei eine Mischung erhalten wird, welche Natriumsalze der folgenden Verbindungen enthält   : N-Desoxyribosid   von 5-Fluor-uracil, Thymin, Thymidin und 5-Fluoruracil. Diese Mischung wird durch Adsorption an ein Ionenaustauscherharz und nachfolgender Elution mittels einer Pufferlösung von allmählich wachsendem Säuregrad gereinigt. Die Pyrimidinverbindungen der Mischung werden in folgender   Reihenfolge eluiert : Thymidin, Thymin,   5-Fluor-uracil und   2'-Desoxy-   5-fluor-uridin.

   Zur Reinigung wird die alkalische Mischung durch eine Säule von 2, 2 cm Durchmesser und 27 cm Länge, die mit "Dowex 1-X4" in der Formiat-Form beschickt ist, geleitet (Anionenaustauscherharz der Dow Chemical Co., Midland, Michigan, bestehend aus einem quer verbundenen Copolymeren von Styrol mit Divinylbenzol (4 % des letzteren), welches als funktionelle Gruppen quaternäre Ammoniumgruppen enthält). Teilchengrösse   0,   075-0, 15 mm. Nach Adsorption wird mit Wasser bis zur neutralen Reaktion gewaschen. Die Säure wird dann mit 280   cm3   einer wässerigen AmmoniumformiatPufferlösung (PH 9, 8) gewaschen, welche eine Normalität von 0,1,bezogen auf Formiationen, aufweist. 



  Die Eluate enthalten keine Substanz, die das ultraviolette Licht absorbiert. Die Säule wird weiter mit 
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  1 <SEP> n-AI <SEP> II <SEP> III <SEP> IV <SEP> V <SEP> VI <SEP> VII <SEP> VIII <SEP> IX
<tb> 7, <SEP> 4 <SEP> 1-5 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 
<tb> 7, <SEP> 4 <SEP> 6-17 <SEP> 23700 <SEP> 24500 <SEP> 1, <SEP> 04) <SEP> 2, <SEP> 33 <SEP> 2, <SEP> 41 <SEP> 
<tb> 7,4 <SEP> 18 <SEP> - <SEP> 26 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 6, <SEP> 5 <SEP> 27-33 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 
<tb> 6, <SEP> 5 <SEP> 34-48 <SEP> 3760 <SEP> 5870 <SEP> 1.

   <SEP> 56 <SEP> b) <SEP> - <SEP> - <SEP> 0,56 <SEP> 0,44 <SEP> c)
<tb> 6, <SEP> 5 <SEP> 49-50 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 
<tb> I <SEP> = <SEP> PH <SEP> der <SEP> Eluiermittel
<tb> n <SEP> = <SEP> Fraktionen
<tb> III <SEP> = <SEP> Totalabsorption <SEP> (PH <SEP> 14) <SEP> bei <SEP> 260 <SEP> mu
<tb> IV <SEP> = <SEP> Totalabsorption <SEP> (PH <SEP> 14) <SEP> bei <SEP> 280 <SEP> m 
<tb> V <SEP> = <SEP> Durchschnittsverhältnis <SEP> 280 <SEP> mu/260 <SEP> my <SEP> 
<tb> VI <SEP> = <SEP> Thymin <SEP> (in <SEP> Millimol)
<tb> VII <SEP> = <SEP> Thymidin <SEP> (in <SEP> Millimol)
<tb> VIII <SEP> = <SEP> 5-Fluor-uracil <SEP> (in <SEP> Millimol) <SEP> 
<tb> IX <SEP> = <SEP> 2'Desoxy-5-fluor-uridin <SEP> (in <SEP> Millimol)
<tb> a <SEP> = <SEP> Allmähliche <SEP> Zunahme <SEP> von <SEP> 0, <SEP> 75 <SEP> bis <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> 
<tb> b <SEP> = <SEP> Allmähliche <SEP> Abnahme <SEP> von <SEP> 1.

   <SEP> 97 <SEP> bis <SEP> 0, <SEP> 98 <SEP> 
<tb> c <SEP> = <SEP> 0,5 <SEP> Millimol <SEP> Desoxyribose <SEP> (gemä# <SEP> der <SEP> Prüfung <SEP> nach <SEP> Stumpf, <SEP> loc. <SEP> cit.)
<tb> 
 
Die Prüfung der Ultraviolettabsorptionsspektren und die Papierchromatographie der einzelnen Fraktionen hat ergeben, dass die Fraktionen   6 - 17   nur Thymin und Thymidin, die Fraktionen 34 bis 48 dagegen die Fluor-Verbindungen enthalten. Die Fraktionen   34-48   werden deshalb vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird in 30   cms   der oberen Schicht einer Zweiphasenmischung gelöst, welche aus 60 Teilen Äthylacetat, 35 Teilen Wasser und 5 Teilen Ameisensäure besteht.

   Man füllt dann eine Kolonne von   4, 4 cm x 49 cm   mit 285 g Cellulosepulver (aschefrei, StandardQualität) das mit der oberen Schicht des erwähnten Äthylacetat/Wasser/Ameisensäure-Gemisches befeuchtet wurde und stampft die nasse Cellulose in   die Absorptionsröhre   mit Hilfe eines Stabes. Die 30 cm der Lösung werden dann durch die Säule fliessen gelassen. Die Säule wird mit der oberen Schicht des obigen   Äthylacetat/Wasser/Ameisensäure-Gemisches eluiert;die Durchflu#geschwindigkeit   beträgt 40 cm in der Stunde und die Fraktionen werden in Abständen von 30 Minuten gesammelt.

   Sie werden einzeln auf Ultraviolettabsorption bei 260 mu und 280 mu (PH 14) geprüft. 

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<tb> @
<tb> i <SEP> n <SEP> m <SEP> iv <SEP> v <SEP> vi <SEP> 
<tb> 1 <SEP> - <SEP> 56 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb> 57 <SEP> - <SEP> 93 <SEP> 1405 <SEP> 3735 <SEP> 2, <SEP> 61 <SEP> 0, <SEP> 57 <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP> 
<tb> 94 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> -
<tb> 95 <SEP> - <SEP> 96 <SEP> 118 <SEP> 124 <SEP> 1, <SEP> 05 <SEP> unbedeutend <SEP> 0, <SEP> 02 <SEP> 
<tb> 97-104 <SEP> 1275 <SEP> 1905 <SEP> 0, <SEP> 92 <SEP> - <SEP> 0.

   <SEP> 38 <SEP> a) <SEP> 
<tb> I <SEP> = <SEP> Fraktionen
<tb> II <SEP> = <SEP> Totalabsorption <SEP> (PH <SEP> 14) <SEP> bei <SEP> 260 <SEP> m 
<tb> III <SEP> = <SEP> Totalabsorption <SEP> (PH <SEP> 14) <SEP> bei <SEP> 280 <SEP> mu
<tb> IV <SEP> = <SEP> Durchschnittsverhältnis <SEP> 280 <SEP> m /260 <SEP> mg
<tb> V <SEP> = <SEP> 5-Fluor-uracil <SEP> (in <SEP> Millimol)
<tb> VI <SEP> = <SEP> 2'-Desoxy-5-fluor-uridin <SEP> (in <SEP> Millimol) <SEP> 
<tb> a <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 39 <SEP> Millimol <SEP> Desoxyribose <SEP> (gemäss <SEP> der <SEP> Prüfung <SEP> nach <SEP> Stumpf, <SEP> loc. <SEP> cit.) <SEP> 
<tb> 
 
Die Fraktionen 97-104 werden vereinigt und im Vakuum bei 450 zur Trockne eingedampft.

   Man erhält 96 mg (25,3%) 2'-Desoxy-5-fluor-uridin als farblose glasige Substanz.   Seine Ultraviolettabsorption   ist charakteristisch Für ein Desoxyribosid und demjenigen von Desoxyuridin   ähnlich,   aber mit einer Verlagerung des Maximums auf grössere Wellenlängen. Wie man es für ein Desoxyribosid erwartet, und im Gegensatz zu dem freien Pyrimidin, gibt es nur eine geringe Verschiebung des Maximums in alkalischem 
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   : bei PH 7. 2. ÀPATENTANSPRÜCHE : 
1. Verfahren zur Herstellung eines N-Glykosides von 5-Fluor-uracil und seiner Salze mit Basen, dadurch gekennzeichnet, dass man 2-Desoxy-ribose von einem 2-Desoxy-ribosid mittels Streptococcus 
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Claims (1)

1. 2. Verfahren nach Anspruch l, dadurch gekennzeichnet, dass man als 2-Desoxy-ribosid Thymidin verwendet.