DE2049638A1 - Isomere Nukleosiddenvate und Ver fahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Description

RECHTSANWÄLTE

DR. JUR. DIPL-CHEM. WALTER BEIl

ALFRED HOSPPENER

DR. JUR. DiPL-CHEM. H.-J. WOUP,

DR. JUR. HANS CHR. BEIL J

623 FKANKFURTAM MAJN-UOCUSf

DOONSIIiASSE S9

204963a

Unsere l'r_e 16 634

Agence Nationale de Valorisation de la Recherche Courbevoie, Hauts de Seine, Frankreich

Isomere Nukleosidderivate und Verfahren zu ihrer Herstellung

Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleotide, insbesondere Derivate der zyklischen Adenosin-3¹,5'-monophosphorsäure und eines ihrer Isomeren»

Die zyklische Adenosin-3'i5'rmonophosphorsäure hat nachstehende Formel:

H H

/ Vv

0·

ι*·

h\h

Il

Ah

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wobei die Bezeichnung "zyklisch" angibt, dass die Atome des Phosphorsäureteils mit den Atomen des Riboseteils einen Ring bilden. Diese Verbindung wird in den Zellen dos tierischen Organismus erzeugt, und zwar ausgehend von der Adenosin-5'-tripho3phorsäure durch Einwirkung eineα Adenylcyclaseenzyms, Es wird angenommen, dass eine grosse Anzahl von Hormonen die Adenosin-3^!,5'-phosphorsäure (als "zyklische A M P" abgekürzt) als chemischen Vermittler zur Ausübung ihrer Wirkung als eine Art "zweiten Vermittler" nach der Terminologie von Sutherland und seinen Mitarbeitern verwenden. Die biologische Wirkung der zyklischen AIiP kann leicht in vitro durch verschiedene Versuche nachgewiesen werden, vor allem P durch den Versuch der Ausdehnung der Hautpigmentsellen in der Haut der Eidechse Anolis carolinensis, der Verbreitung von Hautpigmentzellen in der Haut des Frosche (Rana pipiens) sowie der Erhöhung der durch die Hypophyse freigesetzten SchilddrUsenhornionmenge bei Ratten, Die zyklische AMP erhöht die Produktion von Corticosteroiden /vgl, J,biol, Chenu, Bd, 234, S,1421 (1959)_7. Die Dibutyryldorivate dor zyklischen AMP haben die gleiche Wirkung und können die ACTH ersetzen. Bei gesundern Tieren erhöhen sie den plasmatischen Corticosteronspiegel (vgl, Imura und KoIl,, Endocrinology, Bd. 76, S. 933, 1965).

k Eine Verbindung mit ähnlichen Eigenschaften ist das Isomere, in dem der Ribosekern anstatt durch sein Kohlenstoffatom 1'

durch an das Stickstoffatom 9 des turin gebunden zu sein aas gleiche Atom an das Stickstoffatom 3 gebunden ist, wobei die Doppelbindungen des Purlnkerns infolgedessen verschoben werden. Man kam Uberein, diese Verbindung zyklische iso-AMP zu nennen,

Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung neuer Derivate von zyklischer AMP und zyklischer iso-AMP, die ähnliche, jedoch intensivere und/oder selektivere biologische Wirkungen aufweisen.

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Zv. den neuen Derivaten gehören:

A) Derivate von Adenosln-5^f»5'-moiiophosphorsäure der allge meinen ior^el

_i

'CH,

Ο·

H H

OH

-I

R.

in der einer der Substituenten
χ und y

R^ und R2 oder aber χ und y ^R1

ein Wasserstoffatom oder eine Allcylgruppe und der andere eine Alkylgruppe bedeutet, während

ein Wasserstoffatom bedeuten

jeweils ein Wasserstcffatom bedeuten,

ein Wasserstoff- oder Broaatom oder eine Sulfhjdryl-, Hydroxyl-, Thiomethyl- oder Aminogruppe,

und

ein Wasserstoffatom oder eine Aminogruppe bedeutet.

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Β) Das 2^!-O-Butyrylderivat der iso-Adenosin-3'»5'-monophosphorsäure;

C) Die"durch Salzbildung des an Phosphor gebundenen Ilydroxylester erhaltenen Salze.

Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf Derivate, die in der 6-Stellung einen NHCH,-, N(GH₅)₂-, HH-n-C^Hg- oder HII-tert.-O.Hq-Rest aufweisen sowie auf Derivate, für die R₂ = H und R₁ = Br, SH, S-CH₃ OH oder IiH₂ ist, sowie auf ein Derivat, bei dem R₂ = MI₂ und R.. = H ist, wobei χ und y H bedeuten·

G-emäss der vorliegenden Erfindung kann man die neuen zyklischen in N -Stellung alkylierten AMP-Derivate ausgehend von den in N -Stellung monoalkylierten und dialkylierten Derivaten der Adenosin-5^f-monophosphorsäure (AI¹IP) herstellen, indem man sie mit p-Hitrophenol in Gegenwart von Dicyclohexancarbodiimid (CgH₁₁-N=C=N-CgH₁O umsetzt, und die so erhaltenen Ester, vorzugsweise in Form von Triäthylammoniumsalzen, mit Kalium-tert.butoxid behandelt.

Die monoalkylierten und dialkylierten Derivate der Adenosin-5'-monophosphorsäure, die neu sind und einen Teil der Erfindung bilden, können dadurch erhalten werden, dass man ein f 6-Halogen-, insbesondere 6-Chlor-, 9-(ribo-|.;-furanosyl-2 ', 3 '-isopropyliden)-purin mit dem entsprechenden Mono- oder Dialkylamin umsetzt und das auf diese V/eise erhaltene Adenosinderivat einer Phosphorylierung unterwirft, und zwar vorzugsweise durch Einwirkung von Phosphoroxychlorid in Methylphosphat·

Die Erfindung betrifft ferner ein neues Vorfahren zur 'lernteilung von zyklischen Nukleotiden ausgehend von 5'-Nukleotiden, das gewisse Ähnlichkeiten mit in J_t Amer.Chem.Soc. Bd.03, S.698 (1961) beschriebenem Verfahren hat; dieses Verfahren bestellt darin, dasπ man ein 5'-Kukleotidsalz mit Dieyclohexyl-

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" 3 ■

carbcdiiiiiid (DUFC) oder Di-(cyclohexylinjino)-methanen in Gegei";^.rt von wasserfreiem Pyridin unter RückfluGG aun Sieden ürhitrrü.

Das charakteristische Ke:^ ι..; ο ich en der Erfindung besteht darin, dass man Dimethylformamid suoet^t, welche? eine doppelte "./irkung het: einerseits lösen sich die 5 '-Hukleotida leichter in Ί^:-.Ά Ge.:iir;ch, andererseits scheint das Diüiethylformanid die Reaktion günstig zu beeinflussen. Da.s Dimethylformamid wird in ausreichender ^enge zugegeben, so dass das 5'-JZuIcIeO-tid vollständig gelöst vird, ilan kann beispielsweise ein Gemisch von Pyridin und Dimethylformamid in gleichen Volumenmessen verwenden.

Das Verfaxireii ist einfacher als die Zyklisierung von p-Nitrophenolestor, das an erster Stelle angeführt wurde.

Im Fall von AMP mit einer Arni-uogruppe in der 2-Stellung erhält man geringere Ausbeuten wegen der Bildung eines Nebenprodukts, dfiCi in saurem oder alkalischem Medium unbeständig

2
ist, und das eine Adenosin-ii ,5'-phosphorsäure zu sein scheint, die eine Pnosphamidbindung enthält, woraus die Unbeständigkeit zu erklären ist. Mach Behandlung mit Ätznatron regeneriert sich diese Verbindung zum Ausgangsnukleotid, das man isolieren und der gleichen Verfallronsfolge unterwerfen kann, so dass die Ges.'-'Kitausbeute erhöht wird.

Auf diese V/eise kann man, unter Verwendung von Guanosin—5¹— phosphorsäure ((MO) als Ausgangsmaterial direkt zyklische GMP herstellen,. deren Anwesenheit in der liatur und biologische Wirkung, die qualitativ analog der Wirkung von zyklischer AMP ist, kürzlich entdeckt "wurde. Bei bestimmten biologischen Versuchen hat diese zyklische GMP sogar eine quantiative Wirkung, die derjenigen von zyklischer AMP überlegen ist*

Die zyklische 2'-O-Butyryl-iso-AMP kann gemäss der vorliegenden Erfindung durch direkte Acylierung der Säure, vorzugsweise

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in Form ihres Salzes von Triäthylammonium, hergestellt werden. Insbesondere kann man mit einem Überschuss an Buttersäureanhydrid in Gegenwart von Pyridin bei Umgebungstemperatur arbeiten.

Die neuen zyklischen AMP-Derivate können in der Industrie zu den gleichen Zwecken wie zyklische AI¹IP verwendet werden, insbesondere bei biochemischen und pharmazeutischen Forschungsarbeiten.

Die folgenden Beispiele erläutern die Herstellung der neuen ψ Derivate; die Temperaturen sind in Grad Celsius angegeben.

Beispiele 1-4

a) N -Alkyl-adenosin-5'-phosphorsäuren (N -n-Butyl-AMP)

Das Ausgangsmaterial.ist 9-(Ribo-p—furanosyl—2^f,3'-isopropyliden)-6-chlor-purin; es wurde nach dem in J.Amsr.Cheni.Soc,, Bd. 33, 1961, S.150 sowie im tschechischen Patent Ho.110 beschriebenen Verfahren hergestellt. 50 mg dieses Produkts wurden 15 Stunden bei 80 C in einer Lösung von 1 ml wasserfreiem n-Butylamin erhitzt, im Vakuum bis zur Trockne verdampft, in Chloroform aufgenommen und wieder im Vakuum bis zur Trockne verdampft. Dieses Verfahren wurde mehrere Male wiederholt. Der Rückstand wurde nun eine Stunde im Vakuum getrocknet und in 1 ml abaoltem Methanol gelöst. 0,5 g Kieselsäuregel "Merck" (0,05 - 0,20 mm) wurden zugesetzt, dann wurde bis zur Trockne eingedampft. Der Feststoff wurde oben in eine Kieselsäuregelkolonne eingeführt, die 155 mm lang war und einen Durchmesser von 8 mm hatte. Hit einem Chloroform-Methanol-Gemisch (90:10 Valumenteile) wurde eliiiert, wobei Fraktionen von 1 ml aufgefangen wurden. Das 9-(Ribo-ßfuranosyl-2¹,3'-isopropyliden)-6-n-butyl-aminopurin war in den Fraktionen Nr, 7 bis 13 enthalten. Nach Eindampfen bis zur Trockne wurden 37 mg einer amorphen Substanz erhalten,

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rad ORIQfHAL'

die chromatographisch einheitlich ist (Rf-Wert : 0,75 auf einer dünnen Kieselsäureschicht in mit Wasser gesättigtem n-Butanol)·

467 rag des vorstehenden Produkts, das während 2 Stunden unter einem Hochvakuum bei Uormaltemperotur getrocknet Worden war, wurden in 3,3 ml Methylphosphat gelöst. Die Temperatur wurde auf O⁰C gehalten, 0,47 ml Phosphoroxychlorid wurden eingeführt, und das ganze wurde 5 "bis 6 Stunden stehen gelassen. Der Überschuss an Reaktionsmittel wurde durch Zugabe von 20 g gestossenem Eis zerstört.

liach halbstündigem Rühren stellt man den pH-Wert mit konzentriertem Ammoniak auf 1,5 ein. Es wurde sodann 50 bis 60 Minuten auf 80-90⁰C erhitzt, wodurch es ermöglicht wird, die Isoprcpylidongruppe durch Hydrolyse zu entfernen. Nachdem der pH-Wert mit konzentriertem Ammoniak auf 7,0 eingestellt worden war, rührte man 10 tünuten in ^egenw rt von 10 g aktiver Tierkohle (die nach dem in Can. J. Biochem. Physiol., 3d. 41, 1963, S. 469 beschriebenen Verfahren erhalten wurde), Vielehe durch Waschen in Säure behandelt worden war. Die durch Filtrieren erhaltene Tierkohle, die in 100 ml Wasser gewaschen vurde, wurde mit 400 ml eines Geraischs von konzentriertem Ammoniak, Wasser und Methanol (Volumenverhältnis = 15s35s5O) behandelt, wodurch ein Eluicren des absorbierten Nukleotids ernöglicht wurde. Das ^emiach wurde zur Trockne eingedaupft, erneut in Wasser aufgenommen, mittels 0,5 m Schwefelsäure bis auf einen pH-Wert von 2,0 angesäuert und anschliessend auf etwa 2 ml konzentriert. liach Zugabe von Alkohol und iuischlies.-end Aceton sowie Stehenlassen bei 0°C erhielt man 310 mg N -n-Butyl-AMP in Kristallform. D_as analytisch reine Produkt schmilzt bei 155-158⁰C und zeigt sich bei der Chromatographie einheitlich,

b) Weitere 1. '-alkylierte AltP-Derivate wurden auf die gleiche V/eise hergestellt. In dor nachstehende/i Tabelle werden einige

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BAD

Kenndaten verschiedener Derivate angegeben:

Tabelle I

N -alcoylierte AMP-Derivate

Substituenten am Schmelz- /max - Rf-Wert in verschiedenen _TT6 punkt (mu) Γ max Lösungsmittelsystemen *) ^N "ABC

Monoäthyl	184-185°	268	16900	0,21	0,30	0,33'
Dimethyl	225-230°	274	18400	0,30	0,37	0,61
n-Butyl	155-158°	266	14000	0,50	-	0,75
terteButyl	—	270	15200	0,51	0,66	0,75

*) Lösungsmittelsystem, A : Alkohol-Auirnoniumacetat, 0,5 m (Volumverhältnis =5:2)}

B: Isopropanol-konzentr.Ammoniak-Y/asser (Vol.= 6 s3ϊ 1 )» C: Isopropanol-1$iges Ammoniumsulfc.t (Vol. =2:1)

Beispiele 5-8

a) Ή ,N -Dimethyl-adenosin-3',5'-phosphorsäure (zyklische N⁶-Dimethyl-AMP) und ihre Salze

150 mg N -Dimethyl-adenoBin-5'-phosphorsäure (N -Dimothyl-AMP) werden in einem Gemisch von 2,5 ml wasserfreiem Dimethylformamid und 2,5 ml -wasserfreiem Pyridin gelöst, ilan gibt 0,112 ml Tri-n-butylamin, 556 mg p-Witrophenol und 825 mg Dicyclohexyl-carbodiimid (DCHC) zu. Das Nukleotid geht nach 5- bis 10-minütigem Rühren vollkommen in Lösung über. Das Gemisch wurde 24 Stunden bei Normaltemperatur stehen gelassen. Durch Papierchromatographie (System A der Tabelle I) weist man den p-Nitrophenolester des AMP-Derivats und das entsprechende symmetrische Pyrophosphat in etwa gleichen Mengen n^eh. Das Gemisch wurde im Vakuum bis zur i'rockne eingedampft, und der Rückst£ind wurde in 10 ml V/asser aufgenommen, !lach dem Filtrieren wurde fünfmal extrahiert, und zwar jedesmal mit 10 ml Äther, um das p-Nitrophenol und überschüssiges

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DOHC zu entfernen. Die wässrige Lösung wurde auf eine Kolonne von DEAE-Zellulose (4-0 cm lang, Durchmesser = 2,8 cm) in Form des Bicarbonate gegossen· Hachldem Waschen der Kolonne mit 500 ml zweifach destilliertem Wassor wurde je nach Konzentr;:tionsgr:<.dient mittels Wasser eluiert, dem in zunehmenden Mengen 0,1 m Triäthylammonium-bicarbonat zugesetzt wurde (pH = 7»5), insgesamt wurden 3 liter des ^emischs verwendet. Es wurden 20 ml-Fraktionon aufgefangen. Der p-lTitrophenolsäureester von Ή -Dimethyl-AJIP (Ausbeute = 45$) war in den Fraktionen Hr. 56-73 enthalten; r _m„ =274 fflu; c „,___-

J^ iuci-x. / ^ mcUv

22_e000o lii-ch j3indampfen zur Trockne erhielt man das Triäthylaoü.ioniumsalz, dap, mehrere Stunden unter einem Hochvakuum bei riormalteuipera-fcur getrocknet wurde.

Das ü'riäthylammoniujusalz (107 mg) wurde in 4 ml wasserfreiem Dimethylsulfoxid gelöst, 1 ml. einer 1 m Lösung von Kalium— butoxid in wasserfreiem tert,-Butylalkohol wurde zugegeben; hiordurch. wurde das zyklische Nukleotid unter Freisetzung von p-iiitrophenolat gebildet, liach Ablauf von 3 Stunden bei Normal-

ra-fcur rührte man mit 2 g Dowex 50 (als M. - Form); ch Zu^'i'ne von 10 ml Wasser wurde filtriert. Anschliessend wurde das Harz mit 0,2 η Ammoniak bis zur vollständigen SIuierung des zyklischen ITukleotids gewaschen. Die Ammoniaklösung wurde im Vakuum eingedampft und, wie vorstehend angegeben, auf einer DEAE-Zellulose-Kolonne fraktioniert. Die 3?raktione-i :i>. 53-^fC2 enthielte!» das zyklische Nukleotid, Sie wurden vereinigt und zur 'i'rockne eingedampft, erneut in Methanol aufgenommen und wiederum zur !Trockne eingedampft. Anschliessend wurden sie in 0,5 ml wasserfreiem Methanol gelöst, und 2ml einer 0,5 m Natriumperchloratlösung in wasserfreiern Aceton wurden zugegeben. Die Fällung des Natriumsalzes des zyklischen iiukleotids wurde schliesslich durch Zugabe von 5 ml wasserfreiem Aceton vervollständigt. Durch Zentrifugieren erhielt man 39 mg des Produkts, das in Aceton gewaschen wurde.

Mittels einer konzentrierten wässrigen HatriurasalzlöBung kann

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man das zyklische Nukleotid in Form von Schwerinetallsalzen ausfällen, beispielsweise als Silbersalz; durch Zugabe von Silbernitrat in schwachem Überschüsse Durch Zersetzung dieses Salzes in einer wässrigen Suspension mittels Schwefelwasserstoff erhält man eine Lösung der freien Säure, Durch Neutralisation mittels anorganischer oder organischer Basen erhält man die entsprechenden Salze des zyklischen Nukleoteids,

b) Die N⁶-Monomethyl-, N⁶-n-Butyl- und M⁶-tcrt,Butylderivate der AMP wurden auf die gleiche Weise hergestellt.

In der nachfolgenden ^x'abelle II werden einige Kenndaten der verschiedenen Derivate a_ngei»eben·

Tabelle II

	N -substituierte Derivate der zyklischen ΑϊίΡ	am	Λ	max '	fcmax	Rf-Wert	in veri	0,49	0,75
Substituenten		270	17000	jchiedenen *\	0,78	0,76
H6		274	20000	Lösungsmittelsystemen ' AB C	0,83	0,82
Monomethyl		269	18200	0,58	0,80	0,83
Dimethyl		272	18200	0,88
n-Butyl			0,75
tert.Butyl	0,70

*) Die Lösungsmittelsysteme sind die gleichen wie in tabelle I **) Die Messungen wurden bei einem pH—Wert von 7^0 vorgenommen

Beispiel 9

2'-O-Butyryl-iso-adenosin-3¹,5'-phosphorsäure (zyklische 2'-O-Butyryl-iso-AMP)

Bei der bereits beka_nnten Herstellung der iso-Adenosin-3'»5'-phosphorsäure (zyklische iso-AMP) v;ird über einer DEAE-Zellulosekolonne fraktioniert, die das zyklische Nukleotid in Form einer Lösung seines Triäthylammoniumsalzes liefert. Dieses

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getrocknete SnIz (25mg) wurde in 0,75 ml wasserfreiem Pyridin gelöste E3 wurden 0,375 g Buttersäureanhydrid zugegeben, und das Gemisch wurde 6 Stunden bei Normal temperatur stehen gelassen. Der grösste Teil des Pyridins vmrde im Vakuum abgedampft; der Buttersäureanhydridüberschuss vmrde änseliliessend durch Zugabe von 0,35 ml Wasser bei O C zersetzt und unter einera Hochvakuum zur trockne eingedei pft. Der !rückstand vmrde noch 12 Stunden bei JJorraalteniperatur unter einem Hochvakuum gehalten. Er wurde in 10 ml Wasser erneut aufgenommen und über eine DEAR-Zellulosekolonne mit einer Lange von 15_f5 cm und einem Durchmesser von 0,8 cm gegossen. Sie wurde zunächst mit 300 ml Wasser gewaschen, und es wurde je nach Konzentrationsgradient mit v/_asser, dem steigende» iiem-eii an 0,1 m Triäthylammoniumbicarbonat zugegeben wurden, eluiert. (pH = 7»5)· 20 ial-Frakt ionen wurden aufgefangen. Das Jionobuttersäurederivat war in den Fraktionen iir. 56 bis 7S enthalten, diu vereinigt und lyophilisiert wurden. Der Rückstand wurc-o in 0,2 ml wasserfreiem Hethanol auf genominen} 1 Ml einer 0,5 m liatriumperchloratlösimg in wasserfreiem Aceton vmrde zugesetzt, und aohlxesslieh vmrdeη 5 ml wasserfreies Aceton zugegeben, um die Ausfällung des 1-iatriuiisalzes der zyklischen 2'-0—Butyryl—iso—AMP zv vervollständigen, das abzentrifugiert und in wasserfreiem Aceton gewaschen wurde. Man erhielt 13 ma ^ max=^{270 a}'> £ max^{= 12}·⁸⁰⁰? R_f~Wert im 0,5 m

Athanol-A;u!'!Ojiiuniacetatsyste^r:i (Voluinverhältnis ^xZ) auf V/lxatxnanpL\pier K:e_e 1_e ^i^s in dem UV-Spektrura beobachtete Maximum war pre.ttißeh identisch mit ^r?em Spektrum de? :J.3 Ausgangsnaterial vorv.'ciideten zyklicciien in ο-AI-IP, v/odiirch die Ge^p.uwart des -■-"^:-ty.:ylr3Etes am IT''' ausgeschlossen ist} letzterer kanu sich also nur in 2'-Stellung finden. lian erhält das gleiche Produkt, vem- die "uaKtionsdauer der iso-AlIP mit den: 3utteroäurean-■ydrid in Ca^eir-.'art von Pyridin bin ?,u 8 Tagen verlängert wird, vias die schwache Reaktionsfähigkeit der Amino-ll -Gruppe zeigt.

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BAD ORIGIHAL

Beispiel 10

Zyklische N -n-Butyl-adenosin-3¹,5'-phosphorsäure (zyklische N⁶-η-Butyl-ΑΗΡ)

175 mg N -n-Butyl-adenosin-5'-phosphorsäure (N°-n-13utyl~AMP), die nv.oh dem Verfahren des Beispiels 3 hergestellt worden waren, wurden in das Triäthylammoniumsalz übergeführt, das sorgfältig getrocknet wurde. E₃ wurde in 10 ml wasserfreiem Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wurde tropfenweise in einem Zeitraum von 2 Stunden in 10 ml eines siedenden Gemische aus Dimethylformamid und wasserfreiem Pyridi« zu gleichen Volumenteilen gegeben, 180 mg DCHO wurden zu dem Gemisch gege- ψ hen, das eine weitere Stunde unter Rückfluss zum Sieden erhitzt wurde. Während des gesamten Verfahrensablaufs wurde kontinuierlich gerührt.

Nach dem Eindampfen zur Trockne im Vakuum wurde das Gemisch in 50 ml Wasser aufgenommen, filtriert, um den ausgefällten Dicyclohexylharnstoff zu entfernen, anschliessend wird die Lösung zweimal mit 20 ml Äther extrahiert, um das DCHO zu entfernen. Die wässrige Lösung wurde nun auf eine DEAE-Zellulosekolonne in ihrer bicarbonierten Form gegossen (Höhe = 40 cm, Durchmesser = 2,8 cm). Nachdem die Kolonne mit 500 ml zweifach destilliertem V/asser gewaschen worden war, wurde sie je nach dem Konzentrationsgradienten mit Viasser eluiert, dem ' steigende Mengen an 0,1 m l'riäthylamrnoniumbicarbonat zugesetzt worden waren, Insgesamt wurden 2 Liter des Gemische verwendet. Es wurden 20 iul-Fraktionen aufgefangen.

Das zyklische Eukleotid war in den Rohren 60 bis 81 enthalten. Ihr Inhalt wurde im Vakuum zur Trockne eingedampft; der Rückstand wurde zweimal zu wasserfreiem Methanol gegeben, das dann im Vakuum abgedampft Wurde, Anschliessend wurde er in 1,5 ml absolutem Methanol aufgenommen. Das Natriumsalz des zyklischen Nukleotids wurde durch Zugabe von 20 ml einer 0,125 m Natriumperchloratlösung in wasserfreiem Aceton ausge-

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BADOWGfNAL

fällt. Der Feststoff (100 mg) wurde abzentrifugiert und mehrere Male mit wasserfreiem Aceton gewaschen.

Das Salz hat die SummGi'iormel Cj JK^gH₁-OgP Itfa, und die entsprechende Säure (die wie nachstehend beschrieben hergestellt wird) besitzt alle Eigenschaften, die für die zyklische H⁶-n-I3utyl-AMP in der f:
6934747 angegeben sind.

Beispiel 11

H -n-Birtyl-AMP in der französischen Patentanmeldung

Guanosin-3¹»5'-phosphorsäure (zyklische G-MP)

150 mg G-I-IP in Form der freien Säure wurden in 25 ml Dimethylformamid gelöst. Im Verlauf von 2 Stunden führte man die Iösui'g tropfenweise in ein siedendes Gemisch von 50 ml Pyridin, 50 ml wasserfreies Dimethylformamid und 170 mg DCIIC ein. Bs wurde weitere zwei Stunden unter Hückfluss zum Sieden erhitzt und kontinuierlich während des gesaiaten Verfahrensablaufs gerührt«

IJach Eindampfen zur 'Trockene im Vakuum würde das Gemisch in 25 ml Wasser aufgenommen, filtriert und dreimal mit 15 ml Äther extrahiert. Die wässrige Lösung wurde im Vakuum zur 'i'rockne eia i'edu

Auscer zyklischer GMP enthielt der Rückstand eine Substanz,

ο
die wahrscheinlich Guanosin-N ,5'-phosphorsäure ist. Um die

Phospharaidinvorbinduug zu hydrolysieren, nimmt man sie in 10 ml 0,2 η Ätznatron auf und erhitzt sie 45 Minuten bei 60⁰C.

jlach der neutralisation mit Essigsäure wurde das Gemisch, auf eine DEAE-Zellulosekolonne (Höhe = 40 cm, Durchmesser = 2,8 cm) aufgebracht. Die Kolonne wurde mit 300 ml Wasser gewaschen und je /!Hch Konzentrationsgradient mit Wasser eluiert, dem in .stei.-;ciii')'jn .!engen 0,1 m Triäfchylammoniumbicarbonat zugesetzt wurde; insgesamt wurden 3 Liter des Gemischs verwendet.

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wurden 20 ml-Praktionen gewonnen.

Die Fraktionen Nr. 40 "bis 64, welche zyklische GMP enthalten, wurden im Vakuum zur Trockne eingedampft. Wasserfreies Methanol wurde 3mal zugegeben, und das Gemisch wurde zur Trockne eingedampft. Anschliessend wurde es in 1 ml wasserfreiem Methanol aufgenommen, und die zyklische GiIP wurde in Form des Natriuiasalzes (38 mg) durch Zugabe von 12,5 ml

einer 0,1 m Natriumperchloratlösung in wasserfreiem Aceton ausgefällt, ^αε Produkt wurde abzentrifugiert und mit wasserfreiem Aceton gev/aschen. Es entspricht der Sumrnenfoririel ^ C..-J;!.. ..NcO₇P Na, HpO; es zeigte sich aufgrund seiner verschiedenen Charakteristika (UV-, IH-Spektren, R_f-V/ert in verschiedenen Lösungsmitteln), dass es mit authentischer zyklischer GMP identisch ist.

Die unveränderte oder regenerierte GMP wird durch Waschen der Kolonne mit 0,15 m Triäthylammoniumbicarbonat erhalten. Sein Triäthylammoniumsalz kann nun eine Reihe von Verfahren unterworfen werden, die für seine Überführung in zyklische GMP angegeben werden; hierdurch wird die Erhöhung der Gesamtausbeute ermöglicht.

Die nachfolgenden Beispiele betreffen die Herstellung neuer ) Derivate von zyklischer AMP,

Bei denjenigen, die in der 8-Steilung einen Substituenten haben, kann die Synthese ausgehend von zyklischer AiIP durchgeführt werden. Das Zwischenprodukt ist in beiden Fällen das in der 8-Stellung broniierte Derivat. Das Halogenatom dieses Derivats ist beweglich genug, wenn man es mit nukleophilen Substituenten behandelt. Auf diese Weise kann man es durch eine Amino-, Siifhydryl-, Thiomethyl- oder Hydroxylgruppe ersetzt.

Die Prienzipien der nachstehend angegebenen Synthesen werden durch die folgenden Beispiele erläutert.

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Beispiel 12

S-Srom-adenosin-iJ¹,5'-phosphorsäure (zyklische 8-Brom-AMP)

a) ausgehend von zyklischer AMP

500 ras zyklische AI-IP werden in 0,75 ml 1 η Ätznatron gelöst. ilacii der Zugabe von 15 ml gesättigtem Bromwasser lässt man das Gemisch 6 Stunden "bei .Nornialtemperatur stehen. Anschliessend wird es mit 10 g Aktivkohle gerührt, und zwar in Form von Horit, das zunächst mit einem Amiiioniak-Ätlianol-Wasser-Gemiyeh (VolumverhältniB: 15:60:25), dann mit Salzsäiuy uno .»'asser gewaschen wurde; anschliessend wird filtriert, und die Kohle wird mit Wasser gewaschen, bis die Brom-Ionen vollständig verschwunden sind. Daraufhin wird unter Rühren mit dem Ammoniak-lthanol-Wasser-Gemisch (15:60:25) eluiert, "Die Lösung wird im Vakuum zur Trockne eingedampft, und der Rückstand wird erneut in V/asser aufgenommen.

Diese Lösung wird auf eine bicarbonisierte DEAE-Zellulose-Kolonne (40 cm Höhe, Durchmesser = 2,8 cm) aufgebracht. Die Kolonne wird zunächst mit 500 ml Wasser gewaschen. Anschliessend wird sie. je nach Konzentrationsgradient mit Wasser gewaschen, dem in steigenden Heiigen 0,1 m Triäthylammoniunibicarbonat zugesetzt wurde. Han verwendet insgesamt 3 Liter des Gemische. Ss werden 20 ml—Fraktionen aufgefangen«,

Die Traktionen Nr. 35 bis GO werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Dor Rückstand wird dreimal in Methanol aufgenommen und im Vakuum zur Trockne eingedampft, Schliesslich nimmt wan ihn in 5 ml Wasser auf und säusrt ihn auf einen pH-Wert von 2,5 an, was die Kristallisation des Produkte hervorruft. Man gibt noch 2 Volumina Alkohol zu und lässt das Gemisch 24 Stunden bei O⁰C stehen. Der Feststoff wird nun abzentrifugiert, zweimal mit 5 ml absolutem Alkohol gewaschen und schliesslich getrocknet. Man erhält 410 mg (67?oige Ausbeute). Das liatriumsa-lz hat die Summenforael O₁₀H₁₀II₅O

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Id) aufgehend von 8-Brom-AMP

Die 8-Brom-AMP wurde nach dem in ChemeOomraun., Bd₈1, S„17 (1967) beschriebenen Verfahren hergestellt» Die Zyklisierung wurde nach dem im J.Aiiiei&Soc., Bd.83, S_e698 (19^1 ) "beschriebenen Verfahren durchgeführte

170,4 mg 8-Brom-AKP (0,4 Mol) werden in 10 ml Pyridin gelöst, dew 2 ml Wasser zugesetzt worden waren. Man gibt 117,6 rag 4-Morpholin-IT,IT'-dicyclohexylcarboxamidin (0,8 Mol) zu. Die Lösung wird im Vakuum zur Trockne eingedampft; der Rückstand wird in 20 ml wasserfreiem Pyridin aufgenommen und erneut zur Trockne eingedampft. Dieses Verfahren wird zweimal wieder-

k holt, mn das Wasgor vollständig zu entfernen. Schliesslich löst man ihn in 20 ml wasserfreiem Pyridin und führt ihn während eineinhalb Stunden in eine Lösung von 165 mg Dicyclohexylcarbodiimid in 40 ml wasserfreiem Pyridin ein, das "bis zum Sieden erhitzt wurde, ^as Sieden unter Rückfluss wird zv/ci Stunden lang aufrechterhalten. Die Lösung wird nun im Vakuum zur Trockne verdampft. Der Rückstand wird in 20 ml Wasser aufgenommen; nach dem Filtrieren, wird dreimal mit 20 ml Ät,_j:„r extrahiert» Die Fraktionierung wird nach dem Verfahren des vorangegangenen Beispiels vorgenommen, nachr.era die Lösung über eine DEAE-Zellulosekoloniie (Höhe = 20 cm, Durchmesser =1,2 cm) gegossen worden war» Die zyklische 8-Brom-AMP, welche erhalten wird (121 mg), hat die gleichen iligen-

) schäften wie das nach a) hergestellte Produkt, Die Ausbeute kann noch verbessert werden, wenn die Syklisiorung in Gegenwart von Dimethylformamid (vgl. Beispiel 1) durei?geführt wird.

Beispiel 13

8-Thio-adenoBin-5'-phosphorsäure (8-Thio-AIiP) und . 8-Thio-adenosin-3',5'-phosphorsäure (zyklische 8-Thio-Al[P)

Wie in den drei vorangegangenen Beispielen werden in diesem Beispiel die 8-Brom-AMP und zyklische 8-t?rora-AHP mit nuklco- '

1 098Ί67 2 2 95

BAD ORIGINAL

pliilen Reagennien behcnaelt, und zwar ausgehend von Halogen und durch Substitution durch andere Gruppen,,

a) 8-Thio-AMP

500 mg c3-j3rorn-AIIP werden gut pulverisiert und in 50 ml 90/iigen Äthylalkohol in Suspension gebracht; 200 mg Thioharnstoff werden zugesetzt, und das 3-eaii;;oh wird unter ständigem "Rühren sechs Stunden unter Rückfluss zum Sieden erhitzt. Das Ausgangsprodukt ist nun vollständig verschwunden« ilan neutralisiert mit Triethylamin und fraktioniert über einer DEAS-Zellulosekolonne unter den weiter oben becchriebenen bedingungen. Die 8-Thio-AMP wird nur eluiert, wenn die Konzentration des Triätliylammoniumbicarbonats von 0,1 m auf 0,2 m erhöht wird« Die Rohre 120 bis 150 enthalten das erwartete Produkt. Das Verfahren wird, wie ν r^tehexid beschrieben, fortgesetzt» Das Produkt wird durch Lösen in 1 ml Wasser umkristallisiert, der pH-Wert wird auf 2,5 eingese/tllt, und 2 ml absoluter Äthylalkohol werden zugegeben. Man erhält 250 mg (52/oige Ausbeute)« Das Produkt entspricht der Sumrnenformel C₁₀H₁₄Ii₅O₇P S.

b) zyklische 8-Thio-AMP

DuS im !''all von Ü-Brom-AMP angewandte Substitutionsverfahren erweist sich bei zyklischer 8-33rom-AMP als nicht anwendbar. Schliesslich kam das in anderen Fällen angewandte, in J.Amer, Ohem.Soc., J3d. 06, S. 1243 (1964) beschriebene Verfahren zur Anwendung·

wan lässt bei niedriger Temperatur Schwefelwassarstoff in 20 ml einer 1 m l.atriumäthylat-Alkohollösiing einperlen, um ftutriuDisulfhydrat zu erhalten. Der überschüssige Schwefelwasserstoff wird anöchliessend durch Sieden entfernt. Nun werden 100 mg zyklische 8-lirom-AMP zugegeben, und das Sieden untc-r Rückfluss wird fünf Stunden fortgesetzt. Nach Neutralisation mit Esaigsäure dampft man im Vakuum zur Trockne ein,

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nimmt in 10 ml Wasser auf und fraktioniert Unter den üblichen Bedingungen über einer DSAÜ—ZeIIuIosekolonne (Höhe = 30 cm, Durchmesser = 1,2 cm). Das ^xrodukt wird nur mit 0,1 m Triäthylammoriiumbicarbonat eluiert; es findet sich in den Fraktionen Nr. 60 bis 110. .Nach der üblichen Behandlung erhält man dos Produkt in kristallisierter Form, indem nan den pH—V/ert auf 2,5 senkt. Die Kristallisation erfolgt in Äthylalkohol. ^aan erhält 52 mg (58>-aige Ausbeute), Die Substanz entspricht der Summenformel O^QpLpIi₁-O^P S.

Beispiel 14

ρ S-Thio-methyl-cidenosiu—3', 5'-phosphorsäure (zyklische

8-T ti i o-ine t hyl-AMP)

100 mg zyklische 8 Brom—Ai-IP v/erden in einer Lösung von 1 m Natriummethylmercaptat in absolutem Alkohol in Suspension gebracht, die sechs Stunden unter Rückfluss sieden gelassen. Ans chi ie s.s end wird mit üssiysciuce neutralisiert und im Vakuum zur i'rockne eingedampft. Der Rückstand v/ird in 50 ml V/asfjer aufgenommen; der pH-Wert wird auf 3 eintasten t, und das liukleotid v/ird durch Rühren mit 3 g Aktivkohle absorbiert, Er wird mit Wasser gewaschen und durch .-JehcUidlung mit einan Gemisch aus Äthanol, korn: ent r.Aijimonink und Wasser (60:15*25) eluiert_β Die Löouni;; v/ird im Vakuum zur i'rockne eingedampft, und tier R'.ick nt und wird in 10 ml V/asser aufgenoa'.-ien. Die ITr^kionicriuig erfolgt anschliessend untor den übliciieri isedin^iuijon übet-· oin-ji· DSiiE-Sellulosekolonne (Höhe = 50 cm, Durchmesser =1,2 cm). Das erwartete Produkt wird in den Fraktionen i;t. 15 bis 60 festgestellt (ee ist erforderlich, die UV-Spektren. Rohr fi":· Rohr zu prüfen, um eine Trennung von zwei anderen -^rodukteii durchzuführen, die nicht identifiziert wurden). IKs in diesen Fraktionen enthaltene TrIUtUyIa_1nI_115n-I₂ wird nach dem vorstehend beschriebenen Verfpiiren in das Watriumsalz übergeführt, ikui erhält 36 mg (40>£ige Ausbeute).

Die Substanz entspricht der Summenformel C. ^ILp^cOgl* S Na,

109816/2295 .· ^

BAD OWGINAU

:ίαΐ.■;.■;::. el 15

ο-ί :y:3ro"i.3?-adej^of;in-3 ', 5^l -phosphorsäure (Z3'kli;;che ; j-iiy dr ο i-cy-Al-iP)

225 mg wasserfreies, fri-sca ixeccJii'iolsenes Natriuinacetat wer-("I?η in 7>5 nil Kisecsic .^elöpt, und 150 mg zyklische 3—.Jrorn-AP werden in Fori'i der iVoxen v.'aKseri'reien Säure zuüe^r/utm. ~j 3 ^'j'.irioij '..ird in ein raif 135°O erhitztes ßsd jje^eben, und es wird EUGi Stunden unter Rückfluss stun Siodsn erhitzt (nach ~\5 ''iiiuten ist d-:.s Mulcleotid vollständig gelöst). Die Lcsuni;; v.irc. nun sur i'rockae ei/a^cd ⁿ.ü:pft, und der liiic.Vatand wird in 1t. -:il lian.jer fuf^enoiuiueii. ])ie Frukt.ionierun^ über einfer DKiIE- ^■>lli,!lo3ekolonne v/ird unter den üblichen Bed in,"Im₀'en durchgeführt. Das erwartete Produkt \jird in den i'raktionen ür. 50 "dig 70 feot^c-rj-uellt, man vereinigt sie und dampft. i;ü Vakuum :-;ur '.!'rockne ein. Di3 anfallende 'i'riätliylammoniuiüsalz v.'ird uji'ev den. bereits beschriebenen icdi.igun^en in das wntrium- HC.Iz über .j ti führt. Ilajj. erhält 35 ia^: (66/ci^e Ausbeute), Das --"roäukt lift die Hu..) leniorwel 0.₀]i^_oW_r0₇P I^a,

-■-f:.i pi el 1ό

e-Ainino-adenosirL-5 '-pliosphorsäure (8-Amijio-AI-iP) und 8-A^r':iiio-adeno π in-3^f»5 ' —phosp'aorsäure (zj^kli sehe 8-Amino-AMP)

426 ra^· 8-x3rom-AHP verden in 2,5 nil Formamid gelöst; 10 ml .'Bit Ammoniak gesättigtes Methanol werden su{ve^;eben. Das vor— sie alte Rohr v/ird 48 Stunden leng bei 87-92°C erhitzt. Das ilcti anol v/ird verdampft, 10 ml Wasser werden zugegeben, und die Prr.ktioniorun^· erfolgt nach den üblichen Üedingunger. über einer DJüAE-Zellulosekülcnne. Das erwartete Produkt ist in den \raklioi en i;r. 50 bis 70 enthalten; sie werden vereinigt und aur ¹J-¹ rockne eiliged mpft. Zusamiaen mit der 8-Amino-AJ-iP finden sich in uiin Eoh^e.Miüch zwei Verbindungen, die kleinere Peaks aufweisen, von denen eine schwierig von dem Hauptprodukt zu treiben ist» 'Dias?, letztere ist dennooh in der Folge vervendbar, olijlf ich .siu hui -Tor Analyse keine koreekten Ziffern lieferte. ■H<, -Vusbeutc i;jträ_tit nach der her^x. las gewonnenen Phosphors

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BAD ORIGINAL

176 rag gut trockenes Triäthylammoniurnsalz von 8-Amino-AMP werden in einem Gemisch von 25 ml Pyridin und 5 ml Wasser gelöst, 146 mg A-Morpholin-NjN'-dicycloh.exylcarboxamidiri werden zugegeben, um das Nukleotid in ein lösliches Salz überzuführen. Das Gemisch wird im Vakuum zur Trockne eingedampft, in 25 ml Pyridin aufgenommen und erneut zur l'rockne eingedampft,, Dieses '^erfahren wird zweimal wiederholte Schliesslich wird der Rücketand in 50 ml Pyridin gelöst, Die Zivilisation in Gegenwart von 202 mg Dicyclohexyl-Carbodiimid, die in 50 ml Pj/ridin gelöst sind, wird so durchgeführt, wie es in Beispiel 3 l·) beschrieben wurde„ Das Reaktionsprcdukt wird über einer DEAS-Zelluloselcolonne unter den üblichen P Bedingungen fraktionierte Das erwartete J-roduki; befindet sich in den Fraktionen lir. 50 bis 65, die vereinigt und im Vakuum zur 'l'rockne eingedampft werden, Schliesslich erfolgt die Überführung in das liatriumsalz unter den bereits beschriebenen Bedingungen.

Plan erhält 56 mg (Ausbeute = 32^). Die Ausbeute kann durch Ver wendung von Dimethylformamid während der Zyklisierung (!Beispiel 1 ) verbessert werden. Das Produkt entspricht der Suniuenfornel C₁₀H₁ ^OgP Na.

piel 17

2-An.irio~adenosin-3 ', 5 '-phospiiors^;iure ( zyklische 2-Amino-AIlP) Das Synthesenprinzip ist wie folgt:

Als Ausgangsmaterial wird 2-Amino-6-chlor-9-(2',3',5'-triacetyi-^~D-ribofuranosyl)-purin verwendet, das ausgehend von Guanosin hergestellt wird. Die Acetylgruppen werden durch Ammonolyse entfernt. Das 2-Amino-6-chlor-9-(p—D-riTiofuranosj'l)-purin wird unter strengeren Bedingungen mit Ammoniak beJicMidtIt, wodurch jpi&n 2-Araino-adenosin erhält. Das Produkt wird in das 2 ' , 3'-Isopropylidenfiorivat übergeführt, das durch Piicsphorylierung mi⁴- -hosphoro: ichlorid in Ge.· envMrt von Pyridin iu:l A'.neisenGliurc 2-AmInO-AMP ergibt ■(vgl.Praiirösisc!.*« Potent ur. 1 5^1 156). Aus letzteren erhält wu* .-;.i;iiliecsl.i eh durch

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"BAD

g in Ge ;enwart von BCHC und Dimethylformamid (vgl. Beispiel 2) zyklische 2-Amino-AMP. Die drei letzteren Produkte sind neu und bilden einen Teil der Erfindung.

Das 2-Amino-6-chlor-9-(2',3',5'-triacetyl-p-D-ribofuranosyl)-purin wird unter Verwendung von üuanosin als Ausgangsmaterial nach den Angaben in "Methods in Nucleic Acids Chemistry", 3d. 1, S, 242, hergestellt«, Das Produkt wird 14 Stunden lang bei Uormalteriiperatur mit einer durch Ammoniak gesättigten Lösung in !!ethanol zur Desacetyliorung behandelt»

Die Substitution des Chloratoms durch eine Aminogruppe erfordert ziemlich strenge Bedingungen. 200 mg des vorgenannten Produkts v/erden 48 Stunden lang in einem Autoklaven bei 120 C mit 50 ml konzentriertem Ammoniak behandelt. Die noch dem Erkalten abgelagerten 2,6-Diamino-nukleosidkristalle (55- bis 65$- ige Ausbeute) werden aufgefangen, mit Alkohol und Wasser gewaschen und getrocknet. Das Produkt war bereits nach einem anderen Verfahren hergestellt worden, jedoch ist das erfindungsgemäsae Verfahren praktischer.

1,3g der vorstehenden Verbindung werden in 220 ml Aceton suspendiert; 52 ml Dimethoxypropan und 9,2 g monohydratisierte p-Toluolsulfonsüure v/erden zugegeben« Das Gemisch wird bei llormixlteraperatur gerührt, nachdem das liukleosid gelöst ist, fällt das p-Toluolsulfonat des Isopropylidenderivats aus. iiach Ablauf einer Stunde wird das ^öalz abzentrifugiert und mit Aceton gewaschen; es wird durch Behandlung mit 40 ml Natriunuicarbonat (IQ'/Sig) zersetzt. Nachdem es vollständig gelöst und im Vakuum zur Trockne einged· _mpft ist, wird der Rückstand durch Zugabe von drei mal 50 ml Sensol getrocknet und dann eingedampft. Die Extraktion wird mit insgesamt 150 ml Chloroform vorgenommen, dann wird zur Trockne eingedampft. Es folgt erneutes Trocknen durch zweimaliges Einführen von 51 ml Benzol, dann wird ein^edtiiüpft. Der iückstand wird in einer Γ-Iinimalmenge Chloroform gelöst, die Fällung erfolgt durch Zugabe

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BAD

eines Benzolüber-jchusses. -Λάιι erhält 1,2 g des amorphen Produkts, das "bei der Chromatographie einheitlich ist.

Für die Phosphorylierung wird die vorstehende Substanz (1,1 g) in ein U-emiach von 3,5 ml Acetonitril, 1,74 ml Phosphoroxy_ Chlorid, 0,46 ml Wasserfreie Ameisensäure und 1,5 ml wasserfreiem ryridin gegeben. Bis sum Auflösen wird ka.lt gerührt, dann wird das Gemisch zwei Stunden lang bei 3 bis 4"C stehen gelassen« Nun werden langsam bei O G 35 ml "fässer eingeführt, es wird zwei Stunden bei O⁰C gerührt, und der pH-Wert wird mit Natriumhydroxid auf 1,5 eingestellt. Während einer Stunde wird bei 70 C erhitzt, um die Isopropylidengruppen zu entfernen, darm wird mit 16 g Aktivkohle gerührt. Letztere wird mit Wasser gewaschen. Das absorbierte ITukleotid wird mit einem Gemisch von Äthanol, konzentriertem Ammoniak und Wasser (Volumverhältnis 60:15*25) eluiert. Anschiiessend erfolgt eine !Fraktionierung über einer DEAE-Zellulosekolonne je nach Konzentrationsgradient mittels Wasser, dem 0,35 m Ammoniumbicarbonat in steigenden Mengen zugesetzt wird. Die 2-Amino-AMP ist in den Fraktionen Mr. 100-140 enthalten. Ihr unter den üblichen Bedingungen isoliertes Triäthy!ammoniumsalz wird direkt weiterverwendot (die Menge des anwesenden Phosphors entspricht 640 mg Salz)·

Die Zykliaieruiig wurde ausgehend von 400 mg des Triäthylammoniumsalz von 2-Amino-AMP, die in 5 ml Wasaer gelöst waren, durchgeführt» Nach Zugabe von 360 mg 4-Morpholin—Ν,Ν'-dicyclohexyl-earboxamidin wird das Verfahren, wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben, durchgeführt, wobei 510 mg DCHG und 50 ml Dimethylformamid verwendet werden. Durch Papierchromatographie stellt man ausser dem erwarteten Produkt eine andere, schneller: wandernde Verbindung fest, die vielleicht (siehe Beispiel 11) ■

2
2-Amino-adenosin-l ^'-phosphorsäure ist. Nach Eindampfen zur (Trockne im Vakuum behandelt man di*s rohe Gemisch während einer Stunde bei 60⁰C mit 50 Teilen 0,1 η Natriumhydroxid. Man neutralisiert mit Essigsäure und fraktioniert unter den üblichen

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BAD ORlGlNAt.

!Bedingungen über ein-ar DSAE-Zellulosckclonne. D?. ε Produkt wird schliesslich auf die angegebene "Weise ins ^atriumsalz ii"bοιγ-führt. Schliesslich erhält man 106 mg des i-roduhts, das der Sur^eriforwel G^H^NgOgP lia entspricht.

V/i3 in der Französischen Patentanmeldung Hr, 6 934 747 angegeben, kann man die Silbersalze ausgehend von wässrigen konzentrierten Hr.- i;r ium s al ζ en der erfindun^s^emässen ITukleotidderivate ausfällen; tlvirch. Zersetzen der Silbersalze mittels Scr ■■,'efelv.aseerstoff erhält man die freien Säuren und ochliess-Iicli durch ieutralisation mittels anorganischer und organischer Basen die entsprechenden Salze₀ Andererseits sind alle diese ν erbindungen für eine Acylierung in. dtr N -Stellung

8 °

oder 2^!-0- und eventuell Ij-, S-O, 8-S und !,""-Stellung geeignet« Wird insbesondere die Behandlung mittels 3uttersäu.rean-.hydrid in Gc^eir.:art von Pyridin durchgeführt, so erhält man die am N⁶ und2^f-0 und eventuell am 8-0, 8-S, N³ und II² butyry-Iie3?ten derivate» Diese Verbindungen sind von Interesse, denn die Dibutyryl-I>°, 2'-0-Al-IP v;eist bei vielen in vivo-Versuchen eine Wirkung auf, die derjenigen des Stam.nnukleotids überlegen ist.

Zviilisoiie ll°,.. '-ü-Dibutyryl-a-thio-AKP

7> m_t- zyklische 8-Thio-AiIP v;ii*d in einen ■J-er.iirjch von 2,5 ml vjLS j-irfreiern l'yriäin und 1_f25 al 3uttersäur-3aiil_sydrid suspendiert« V,^Tähro:..ä drei Stunden v;ird das Geaii -;cli gerührt, bis es vollständig gelöst ist, dann wird es 20 Stunden bei b%;,tb 11.... er-.tur stelteh belassen, Die Löuiu'i_tJ- \;ird nun auf -1O⁰G gekühlt, una 1,5 ;.il Eis werden vorsichtig zugegeben. liach droistunii,,en Stehenlassen bei Umgebungstemperatur dampft man das ^e:rii'ich im Hoc:ivakuum zur Trockne ein und hält es 24 Stunden i2i diesem Vakuum. Man nimmt es in 5 ml V/asser auf und frcktioni-r."t es ü'-'j:.* -.;i:-ijv Duiui—Zellulosekolonne unter den vorstehend ·■■.■■■■■■ 3^:. ·:^!_θκ ^^Άχϊ\( ranzen. Die das bu+yrylierte Derivat e-triiltoi-'.'e x'rai'.t-icn v:ird zur Trockne eiii^eäa^pft; es wird ;.!Ghi-üro

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BAD

Male zusammen mit wasserfreiem Methanol eingedampft, und dann wird d'^T.s Gemisch in 2 ml Äthanol aufgenommen. Man gibt die theoretische Menge an Bariumjodid in 1 ml Alkohol zu (als "Basis wird der Phosphorgehalt in Lesung genommen: für 1 Atom P ist 1/2 Mol BaIp erforderlich), das Bariumsalz setzt sich mich einet¹ gewissen Zeit ab, wird abzentrifugiert und mit etwas Alkohol gewaschen, ,,an erhält 29 mg des Produkts; eine beachtliche Menge des Produkts in den Mutterlaugen kann in weniger reiner Form durch Zugabe von 2 bis 3 Volumina wasserfreiem Äther gewonnen werdeiio Das Produkt hat die SuLirje.iiforrnel

^C18^H23^N5°8'^PS'^Ba//2

Seiner Zusammensetzung und seinem IR-Spektrum nach enthält das Produkt lediglich 2 Butyrylgruppen, die zweifellos am N und 2'-0 fixiert sind. Die Sulfhyrylgruppe am C-8 hat nicht reagiert, was sich durch die Tatsache erklärt, do.ss sie vollständig in ihrer tautomeren Thioketonform vorliegt.

Einige Kenndaten von erf indungsgemässeri Derivaten dsr zyklischen AMP werden in der nach stehenden Tabelle I angegeben.

Substanzen

8-Broin-AMP c ***)
S-Thio-AMP c
3-Thioiaethyl-AIIP c
8-Hydroxy-AMP c
8-Amino-AMP c
2-Aminο-AMT c

8-Amino-Al-IP
8-Thio-AMP

Dibutyryl-f-tliio-AMP

Tabelle I	max.**)	max.**)	H^-V/ort in v mittelßvstom A	wei Lösungfi-
(rau)	15.200	0.43	en *) Ji
266	•24.000****	) 0,25	0,63
O Ct ""7-ΐί--V-τί--¥- ^	18ο400	0, 43	0,40
280	11,500	0,30	0,66
270	16,000	0,23	0,4ö
273	10.200		0,32
258	10.200	0,20
282	16.100	0,05	0,2p
274	25»200	0,06	0,23
236***)	24.100		ϋ,·2 5
297****)	19.800	0,iJ5
c 246	25· [^00		ο,β:
326

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BAD

*■) Losui^s'iiittelsystcn: A = iithanol-Anino „iumacetst

0,5 η (Voliiia-verntll-u- '

r.is: 5:2) B = Isopropanol-Amiiioniuinsulfat (1/0

(Volum --J-IiHIt.mis: 2:1)

**) MacBuiiijen in "//asf.-'.-r., fills nicht anders an^e{;eben, bei ρκ 7;

***) ο = zyklisch;
■***■■*) i.iosPUi.₀c_i bei pH 11,0.

_^Γ/3 ·.: ;vJe mnäclist UiItBi-¹Gi-IG-Ut, v.'ie sic¹-, dio Derivats von zykli-Gcliwi? AiIP, ν.·θ^Ί.ο.ι-ιε Alkylsii^stituonten am H 1α^>-:ι, und die a^klisohs 2^t-O-'3'jityryl-±üo-AlTP "bei Hypopiiynon von Ratten v'::¹-/ialten, .lie nach eineff bekannten Verfahren inku'jiort vjarden (J. üiocper.1. of Physiol., Canada, Bd. 33, S. <0S, 1955).

iJV.cli einer oinstimdijen Inkubationszeit bei 3ΰ G ir. einem Kreus-Rinyer-Medium, dem Latriurcibicarbonat und Glukose nugesetzt worden var, er::eu_:jten die Hypopiiysen der Ratten in Getftnv;art der .L-sne-.xi Derivate mehr tliyreotropes Hormon als die H^^pophysen, die als Kontrolle dienten} der Gehalt der Inkubationspoodukte an thyreotropeni Hormon na.oh der Verdürjuiun^ vrarde nach dem Verfahren von McKenzie bestimmt (vgl.Endrocrinology, 3d. 63, S. 372, 1958).

Die Br^ebnisse sind ir. der nachstehenden tabelle aufgeführt, in lur die Abkürzungen in der Kopfspalte die folgende jeweilige Bedeutung haben:

H ο ak t; i ο η : la c Fi

McKenzie Prozentsatz der Erhöhung der Radioaktivität

des Lluts in Schlägen des Zählwerk:= pro Minute und pro ml Blut, nach 2 Stunden

Lovar-Re;'ktion Reaktion, die durch Kovarianz nacJi Überführung in DeziMf.rllo^a?arithmen berechnet wurde

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"BAD 0ΒΚ3ΛΝΑΪ.

Dünnet Stat.Bedeutgc

'J)SH mU ras Hyp.

Statistische 3ae

unbedeutend, + lieJoutend (ρ = O,C5),

++ sehr bedeutend (p = O,G1) Hilli-Einiieitcm an tlyreotropem Hormon pro mg Hypophyse

Tabelle

Behandlung-

Dosis Reak-

in Mil- tion Kovar- St^t. limol nach reak- BedeuiicKeiizie tion Dunnet turit:

TSHmU T ins- mg/ ges„ hyp

Kontrollver bindung	C	5	140$	2,31	4,53	_	30,0	2,94
AMP c		3	316tf	2,59	4,94	χ χ	76,5	5,71
Dimethyl-ÄMP c		3	298$	2,62	3,66	X X	7O95	5,73
Monomethyl-AMP	C		2 5 ΟσΑ	2,54	_	X X	54,0	4,20
Kontrollver bindung		3	137$	2,25	5,36	_	20,0	1,90
AI-IP c	C	1	347$	2,66	1,81	X X	60,0	4,65
tert.Butyl-AMP		1	186°/	2,39	4,57	unbed.	26,0	2,05
n-Eutyl-AIEP c		1	302^0	2,60	3,41	χ χ	46,0	3,98
Monomethyl-AMP		1	27(¥	2,51	4,13	X	40,0	2,95
O-Butyryl-iso- AMP c	C		27596	2,56		X X	42,0	2,94
Kontrollver bindung		1	135^	2,00	3,77	.	20,0	1,69
n~Butyl-AMP c		1	2235«	2,23	1,28	X X	31,0	2,77
tert.Butyl-AMP		3		2,08	4,24	unbed.	23,0	1,92
AMP c	1,5	2435i	2,26	2,10	χ χ	37,0	3,44
O-Butyryl-iso- AMP c	17096	2,13	unbed.	24,0	2,00

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bad

Aus dieser tabelle geht hervor, dass die neuen zyklischen AMP-jJerivate, -nit Ausnahme des ii -tcsrt.-Butylderivats, Anlass zu einer bedeutsamen Erhöhuixg der Preis et sung von thyreotropem iiorr-ion sogar in einer Dosis von eineTi Hilli-iiolekül waren, während die zyklische AMP selbst in dieser Dosis noch keine .'iirirua^; hat. Die geringere Wirkung des terto-Butylderivats bei diesem Versuch scheint, im Vergleich zu dem n-Butyldorivat aer sterischen Hinderung zusuKobreiben su sein, denn der n— Butylrest ist kettenförmig, während der tert.-Butylrest kompakt

jjo.i -lern Versuch der Wirkung auf die Hautpigment%aellen der Eidechse Anolis dagegen vorhalten sich der tert.-Butylrest sov'ie der normale Butylreat in etv;a gleich. Die Hinimalkonze.'jtr::tiGnon, die eine positive Il-akTio:. bei diesem "tr: bev:irkten, sind die fol^_:enrien

iUvIP C	1	Mil	lim öl
IiOiiO:..ethyläe.:ivat	o,	43	Ilillimol
Diüiethylderivat	o,	5^	Il
n-Butylderivat		ZC	Il
terto-Butylderivat	o,	28	II

Die Derivate der zyklischen Adenosin-3^T,5'-monophosphorsäure, die in den 2- und/oder S-Stellungeii Substituenten haben, wurden c.uf die Freisetzung des Hypophysenwach ε tumshormons bei der Ratte in vitro untersucht« Die üosicrun^· des Hypophysenwachstuinshorraons ('5H) und des Prolactin (PR) wurde durch Gel-Elektrophore3e diu-ohc^e

In u r ϊ,ί-c^ ■, -hriulan l'abolle II vjorden die Ergebnisse angegeben, .lie erhielt vurd n. Die j-'ukleotidkonzentr-tionen sind in mti und die l-ieix-eu dec ^ypophysenwaciistumshcrmons, die in den Inkuba-¹ i.-.i-mcdiea freigesetzt wurden, werfen i*/u-/m_ü der Hypophyse Uj.:, -,13 -"-"roneiitsats beEcjen yuf die ]Ioi.trollverbindun&en an^e-

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* BAD

	- 28	—	II	GH 'mg hyp.	(bezogen auf die Kontrollverbindung)
	Tabelle	GH ml)
Versuch	Dosis (mil) / (2		1,07	-
A		32	2,72	254
Kontrollverbindung	—	74	4,88	45 t
8-Amino-AMP c	2	156
3-Brorno-AMP c	2		0,75	-
B		16	1,40	186
Kontroliverb indung	-	32	4,53	604
AMP c	5	92	2,68	357
8-Thio-AMP c	2	56	1,55	2ü6
8-Hydro:ry-AMP c	2	32
e-Amino-AI-IP c	2		1,29	—
0		36	2,65	205
Kontrollverbindung	-	66	3,31	256
AMP c	4	84	3,37	261
S-Thiomethyl-AMP c	2	82	2,21	171
8-Thio-AMP c	2	54	5,68	440
8-Amino-AMP c	2	188	2,98	231
8-Brora-AMP c	2	72	0,31
8-Hydroxy-AMP c	2	23	1,90	235
Kontrollverbindung		52	0,99	122
AMP c	9	30	1,47	181
AMP c	3	41	3,56	439
2-Amino-AMP c	2	97	1,75	216
8-Thio-AMP c	2	53
8-Brom-AMP c	1		0,69	—
E		21	2,19	317
Kontrollverbindung	-	62	2,34	339
8-Thio-AMP c	1,5	66
8-Hydroxy-AI'-TP c	4

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Tobelle II (Fortsetzung)

Versuch	G	Dosis (mM)	GH (£u2i)	GH mg hyp.	(bezogen auf die Kontrollverbind:mg)
iLontrollver b induiij ;	Ko η t ro 1 Iv 'S, r b indung		20 ·	0,32
3-Amiiio-AMP c	2-Amino-AMP c	4	44	2,01	245
.:-;>:!voxy-AI'TP c	O" j j. Kontro live rb indung	4	60	2,34	285
2-Ariiino-AIiP c	AiiP c	4	37	1,53	193
DBC	8-3rOiTi-AMP c	2	75	3,06	373
D3C	;:G,2'-0-Dibutyryl- 3-thio-AIiP c	1,5	56	2,53	309
-	23	1,16	-
3	52	2,88	248
	16	0,72
4	20	0,995	133
2	72	3,54	490
2	84,	4,50	625

DBC = zyklische Ir,2'-Dibutyryl-AMP

Die neuen Derivate der zyklischen AMP zeigten alle im biologischen Versuch d;or Hornionfreisetzung eine Wirksamkeit, die der zyklischen AlIP überlegen ist« Die zyklische 8-Thio-AIiP, zyklische 8-Broüi-AMP und insbesondere die zyklische ].^r6,2'-0-Dibutyryl-8-thio-AiIP zeigen eine der zyklischen N⁶, 2'-Q-Dibutyryl-AMP (DBC) überlegene Wirksamkeit.

Die neuer' Derivate der zyklischen AI-IP können in der Industrie für die gleichen Zwecke wie zyklische AIlP verwendet werden, und zwar vorwiegend für biochemische, biologische und pharmazeutische Unter uchungen.

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BAD

Die neuen Derivate können zur Untersuchung des Mechanismus der hormonalen Wirksamkeit verwendet werden. Da sie die Rolle eines sekundären Vermittlers der hormonalen Wirkung spielen, können sie im Organismus die Wirksanikait der Hormone selbst ersetzen.

_/Vi<;; 1098ΊΟ/2295

Claims (1)

1. ΡΑΐ2;ΙϊΑίί SPRÜCHE :

   ηcmere ivulileosidderivate, nämlich

   (A) Derivate der Ädenoain-3¹,5'-jrorxopiiosplicrsäure- der allgeiii-iJ.:·. Formel:

   V.' C

   ¹G

   Il

   CH

   i. ι der

   e5.iiov inr Sii'jstituenteii X und Y ein Wusser^toffaton odor eine Alkyl gruppe αΐιά der andere eine Allc3/lgruppe bedeutet, v.'ülirend H, "Jini R--, ^T.ia2se-'stüiTatome sind,

   oder X und Y je./eils ein '.iaBGerstoffaton, R^ ein Wasserstoff-οΛογ Jroinatom oder eine Sulfhydryl-, Hydroxyl-, Thiometliyl- oder Aminogruppe, und R₂ ein Wasserstoffa-'-on oder eine Aj:iinojrup^e bedeuten, εον;ΐβ

   (^T0 das 2'-Ü-But2'rylderivat der lsoaaeiu>sin-3' ,5 '-monophcsp-crc^uxO uijiö d'.r>:i; uurch Verselaung d.^r an Phosphor ^eoui-enen OyO . obildeten Salze.

   t-

   - 32 -

   2. Derivate nach Anspruch. 1, dadurch gekennzeichnet, daß R-, und

   niedere Alkylgruppen sind.

   3. N⁶-Monomethyl-, N⁶, N ^Dimethyl-, N^D-n-Butyl- und N°-tert. Butylderivat der Adenosin-3¹>5'-monophosphorsäure und ihre Salze.

   4. Derivat der Adenosin-3',5'-monophosphorsäure, gekemizeich-

   net durch die nachstehende Teilformel:

   in der R-, ein Bromatom oder eine SH-, OH-, SCH-,- oder NHp-Gruppe ist.

   5. Derivat der Adenosin-3',5'-monophosphorsäure, gekennzeichnet durch die folgende Teilformel:

   6. Verfahren zur Herstellung eines Derivates gemäß einem der vorstehenden Ansprüche 1 "bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man ein N -monoalkyliertes oder IT ,N^D-dialkyliertes Derivat der Adenosin-5'-monophosphorsäure mit p-Nitrophenol in Gegenwart von Dlcyalohexyl-carbodiimid umsetzt und die dabei erhaltenen Ester, vorzugsweise in Form des Triäthylammoniumsalzes, mit Kalium-tert.-butoxid behandelt.

   7. Verfahren zur Herstellung von 8-Broin-adenosin-3 ', 13 '-nonophosphorsäure der nachstehenden Teilformel:

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   dadurch.gekennzeichnet, dass man 8-Brom~adenosin-5'-monophosphor säure nach dem Zyklisierungsverfahren gemäss Anspruch 6 behandelte

   8o Verfahren zur Herstellung Ton 8-Brom-adenosin—3¹ >5.'-monophosphorsäure, dadurch gekennzeichnet, dass man Adenosin-3^!,5'-monophospiiorsäure mit Brom in wässriger Lösung umsetzte

   9« Verfahren zur Herstellung von 8—Brom-adenosin-3',5'-monophosphorsäure, dadurch gekennzeichnet, dass man 8-Brom^adenοsin-5 '-mono phosphor säure mit Dicyclohexyl-carbodiimid in Pyridin in Gegenwart von Dimethylformamid umsetzte

   1O₀ Verfahren zur Herstellung einer .Verbindung nach Anspruch 4, bei der R-, eine« OH-, SH- öder SCH~-Rest ist, dadurch gekennzeichnet, dass man 8-Brom-aäenosin-3'»5'-monophosphorsäure mit ITatriumacet&t, -hydrogensulfid oder -methylmercaptat umsetzt.

   11« Verfahren zur Herstellung von S-Amino-adenosin-S',5'-monophosphorsäure, dadurch gekennzeichnet, dass man 8-Amino-adenosin-5 '-monophosphorsäure der Zyklisierung'l&spruch 6 unterwirft.

   12-, Verfahren zur Herstellung von 8-Amino-adenosin-3',5'-monophosphorsäure, dadurch gekennzeiclinet, dass man 8-Aminoadenosin-5'-monüphosphorsäure mit Dicyclohexyl-carbodiimid in Pyridin in G-egonwart von Dimethylformamid umsetzte

   10 9 816/2295

   - 34 - .

   13» Verfahren zur Herstellung der Verbindung gemäas Anspruch 1 (B), dadurch gekennzeichnet, dass man Isoadeno3in-3',5'-monophosphorsäure, vorzugsweise in ?orm des Triathylammoniuia-salzes, der Einwirkung eines Butyrylierungsmittels unterwirft,

   14. Verfahren nach Anspruch 13» dadurch gekennzeichnet, dass man mit Buttersäureanhydrid im Überschuss in. Gegenwart von Pyridin "bei Raumtemperatur verwendet»

   15o Derivate der Adenosin-5'-mciophosphorsäure der allgemeinen Formel: _{R R}

   HO _v O

   OH OH ^H

   in der R., und R₂ die in Anspruch -1 oder 2 angegebene Bedeutung haben, ,

   16, Verbindungen gemäss Anspruch 15, wobei R.. eine Methylgruppe und 'Rp ^ei-ⁿ Wasserstoff atom, R^ und R2 Methylgruppen oder Ri eine η-Butyl- oder tert^Butylgruppe und Rp ein ^w"asserstoffntom sind. .

   17e Adeiiosin-5^!-monophosphorsäurederivate der allgemeinen Formel:

   10 9816/2295

   .OH

   OH OH

   Br, IJH₂, OH, SH oder CH,, und

   ein Wasserstoffatom bedeuten, oder aber ein Wasserstoffatom und Ro eine SHo-G-ruppe ist.

   Tc₀ i3ut3?rylierto Derivate der Adenosin-3', 5 '--menophosphorsL.iuran, die Gubstitueirfcen in 2 und/oder 8-Slellungen haben, v.'obci die Butyrylgruppen an K und/oder an 2'-0 und/oder an Ii^ und/oder an ϊΓ¹" und/oder an 8-0 und/oder an 8-S gebunden sind. „ .

   19-c Sylvlisclie S , 2 ^l-0-Dibutyryl-8—thio-adenosiii-3' _f 5 '-monop^liosp^;ior3äi-.re und iJir Bariumsalz„

   20« Verfahren sur rierstelltmg der butyrylie_'teii Derivate gemäss A:;?ci-uch 18, dadurch gekeniiüeiclmet, dass man die Adencsin-3¹, 5 '-monophosr-r.orsäureiij die Substituonten in den 2- und/oder 8-Stellu:-'x_:-_;oii racen, mit BTittersäureauiiydrid in üe-^oir.'/art von wä.-serxreiern Pyridin helir^iäelt_a

   -i-'ü·¹ Ar-once IUi.tioi.iale d·/ Yalcrisctioji dt,- la Rec-.erche

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