DE1004343B

DE1004343B - Verfahren zur Herstellung von Vitaminen der B-Gruppe

Info

Publication number: DE1004343B
Application number: DE1956A0024193
Authority: DE
Inventors: Dr Konrad Bernhauer; Dipl-Chem Dr Wilhelm Friedrich
Original assignee: Aschaffenburger Zellstoffwerke AG
Current assignee: Aschaffenburger Zellstoffwerke AG
Priority date: 1956-01-26
Filing date: 1956-01-26
Publication date: 1957-03-14

Description

Verfahren zur Herstellung von Vitaminen der Bt2-Gruppe Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuartiger Vitamine der Bl2-Gruppe durch Einwirkung alkylierender Agenzien auf den Vitamin-B12 Faktor III.
Dieser Vitamin-Bla-Faktor findet sich in beträchtlichen Mengen neben Vitamin B12 im Faulschlamm städtischer Kläranlagen (vgl. dazuW. Friedrich und K. B ernhauer, Angew. Chem., 65, 627 [1953]) und fällt demzufolge als Nebenprodukt bei der Erzeugung von Vitamin Bls aus Faulschlamm an. Während das übliche Vitamin B12 als Basenanteil seines Nucleotids 5, 6-Dimethylbenzimidazol enthält, besitzt der Faktor III als Basenanteil 5 (6)-Hydroxybenzimidazol (vgl. hierzu W. Friedrich und K. Bernhauer, Angew. Chem., 67, 619 [1955] ; Z. Naturforschg., llb, 68 [1956] ; F. M. Robinson, I. M. Miller, J. F. McPherson und K. Folkers, J. Am. Chem. Soc., 77, 5192 [1955]). Der Faktor III kann rationell als 5 (6)-Hydroxybenzimidazolcobalamin bezeichnet werden.
Er unterscheidet sich demnach durch den Besitz einer phenolischen Hydroxylgruppe grundsätzlich vom üblichen Vitamin B12. Dieser besonderen Eigenschaft bedient sich das beanspruchte Verfahren, indem dabei vom Reaktionsvermögen der phenolischen Hydroxylgruppe gegenüber Alkylierungsmitteln Gebrauch gemacht wird.
Erfindungsgemäß läßt man auf den Vitamin-B12-Faktor III in wäßriger Phase in schwach alkalischem Milieu, wie z. B. in Gegenwart von Alkalicarbonaten, am besten im Temperaturbereich von 20 bis 60°, ein Dialkylsulfat, wie z. B. Dimethylsulfat oder Diäthylsulfat, oder einen Benzol-oder Toluol-sulfosäure-alkylester einwirken.
Die Umsetzung erfolgt unter Rühren oder Schütteln.
Nach erfolgter Reaktion wird der entstandene Bl2-Faktor zusammen mit dem Rest an Faktor III aus dem Reaktionsmedium durch Extraktion mit phenolhaltigen Kohlenwasserstoffen isoliert und von Salzen befreit. Die Trennung von unverändertem Faktor III wird dann chromatographisch vorgenommen (im Prinzip nach bekannten Methoden ; vgl. dazu W. Friedrich und K. Bernhauer, Z. Naturforschg., 9b, 755 [1954] ; lOb, 6 [1955]).
Erfindungsgemäß läßt sich die Trennung des Faktors III und des alkylierten neuen B12 Faktors, wie z. B. des 5 (6)-Methoxybenzimidazol-cobalamins (nachfolgend kurz als Faktor IIIm bezeichnet), besonders gut durchführen, wenn man eine Chromatographiersäure aus Zellulose und einen Entwickler verwendet, der aus wasserhaltigem sek.-Butanol besteht und Ammoniak sowie Cyanidionen enthält. Es findet dabei eine völlig quantitative Trennung in einem einzigen Arbeitsgang statt.
Die aus der Chromatographiersäule ablaufenden ammoniakalischen Eluate werden erfindungsgemäß durch eine kurze Destillation-am besten im Vakuum-vom Ammoniak befreit. Aus dem so behandelten Eluat erhält man dann den alkylierten Bl2-Faktor mit Hilfe iiblicher Methoden in kristallisierter Form.
Die bei der Alkylierung, z. B. mit Dimethylsulfat, erzielbare Ausbeute ist sehr zufriedenstellend. Der nicht umgesetzte Faktor III läßt sich ohne Schwierigkeiten wiedergewinnen und zur gleichen Reaktion verwenden.
Auf diese Weise gelingt eine praktisch quantitative Umsetzung des Faktors III, da keine weiteren Nebenprodukte erhalten werden.
Daß mit Hilfe von Dialkylsulfaten unter bestimmten Bedingungen Hydroxylgruppen organischer Verbindungen unter Bildung von Äthern alkyliert werden können, ist bereits seit langem bekannt. Es ist aber völlig überraschend, daß es mit Hilfe des geschilderten Verfahrens gelingt, eine so komplizierte organische Verbindung wie den Faktor III mit vorzüglicher Ausbeute umzusetzen und noch dazu in so selektiver Weise, wie dies erfindungsgemäß der Fall ist.
Wie gezeigt werden konnte, unterliegt nämlich unter den gewählten Reaktionsbedingungen nur die phenolische Hydroxylgruppe im Basenanteil des Faktors III der Alkylierung, während die alkoholischen Hydroxylgruppen des Riboseanteils gar nicht in Reaktion treten, wie sich aus den physiko-chemischen Eigenschaften des aus dem alkylierten Faktor III erhaltenen Nucleotids ergibt. Ein weiterer Beweis dafür, daß unter den gewählten Reaktionsbedingungen nur das phenolische Hydroxyl alkyliert wird, während die alkoholischen unberührt bleiben, ergibt sich daraus, daß das übliche Vitamin Bl2 bei der gleichartigen Einwirkung von Dimethylsulfat kein Reaktionsprodukt gibt, da es keine phenolische Hydroxylgruppe besitzt. Daß der Co-haltige Grundkomplex bei der Alkylierungsreaktion unberührt bleibt, wurde durch Isolierung von Ätiocobalamin nach Abbau des Faktors III m mit Perchlorsäure (s. dazu W. Friedrich und K. Bernhauer, Z. Naturforschg., 9b, 686 [1954]) bewiesen (vgl. Tabelle 1).
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung neuartiger Vitamin-Bl2-Faktoren bietet die Möglichkeit, die verschiedenartigsten O-Alkyläther des Faktors III herzustellen und deren biologische Wirksamkeit zu prüfen.
Dies erscheint deshalb bedeutsam, da so die Aussicht besteht, zu therapeutisch wertvollen Produkten zu gelangen.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch folgende Beispiele näher erläutert.
Beispiel 1 In eine Mischung von 50 mg Faktor III und 300 g Natriumcarbonat (Na2COs 1 OH2O) in 250 ml Wasser werden in einem 11 fassenden Gefäß bei 37° unter lebhaftem Rühren während 4 Stunden in kleinen Portionen 37, 5 ml Dimethylsulfat eingetragen. Anschließend werden 150 ml Wasser und 125 ml einer wäßrigen Phenollösung, enthaltend 80°/o Phenol, zugefügt. Man rührt das Ganze eine weitere Stunde bei 37°. Nach dem Stehenlassen über Nacht bei Zimmertemperatur wird die rotgefärbte Phenolphase abgetrennt, mit 100 ml o-Dichlorbenzol verdünnt und des öfteren mit Wasser gewaschen, bis das letzte Waschwasser neutral ist. Durch Zusatz von etwas Butanol und Äther führt man die Bl2-Vitamine aus der Phenolphase in die wäßrige Phase über, wäscht die wäßrige Phase mit Butanol und Äther, engt sie im Vakuum auf ein kleines Volumen ein, nimmt den Rückstand in etwas Kieselgur auf und trocknet dieses im Vakuum über CaCl2.
Das getrocknete, mit den B12 Vitaminen beladene Kieselgurprodukt wird in eine Zellulose-Chromatographiersäule -Durchmesser 6 cm, Höhe 14 cm-eingefüllt. Man entwickelt zunächst mit einem Entwickler, der aus 775 ml sek.-Butanol, 90 ml einer 25°/oigen wäßrigen Ammoniaklösung, 135 ml Wasser und 1 ml einer 10°/oigen Blausaurelösung besteht. Es erscheinen bald zwei violette chromatographische Zonen, und zwar A. eine untere, kräftige, schnell bewegliche Zone des Faktors IIIm, vom R-Wert 0, 33 ; B. eine obere schwache, langsam laufende Zone des Faktors III, mit dem R-Wert 0, 12.
Nach Elution der Zone A wird zwecks rascherer Auswaschung des Faktors III mit sek.-Butanol, das 30 °/0 Wasser enthält, eluiert. Die Eluate der Zone A werden zwecks Beseitigung von Ammoniak im Vakuum auf das halbe Volumen eingeengt, anschließend mit etwas Äther versetzt und mit Wasser extrahiert. Die wäßrige Lösung wird in üblicher Weise auf kristallisiertes Produkt verarbeitet. Der FaktorIIIm kristallisiert in prachtvollen, bis 1 cm langen dunkelroten, feinen Spießen. Ausbeute an absolut reinem kristallinem Material 29 mg. Aus der Zone B werden 15 mg Faktor III zurückgewonnen.
Der in der beschriebenen Weise erhaltene kristallisierte Faktor 111m ist aktiv gegenüber E. coli, L. leichmannii und Ochromonas malhamensis. Er ist ebenfalls hoch wirksam gegen perniciöse Anämie. In seinen physikalischen chemischen Eigenschaften ähnelt er sehr dem Faktor III, so daß er nur durch sein chromatographisches Verhalten vom Faktor III unterschieden werden kann.
Beispiel 2 50 mg Faktor III werden, wie im Beispiel 1 beschrieben, methyliert, jedoch mit dem Unterschied, daß nicht bei 37°, sondern bei 50° gearbeitet wurde. Die Ausbeute an Faktor 111m war in diesem Fall um einige Prozente niedriger. Das gewonnene Reaktionsprodukt hatte die gleichen Eigenschaften wie das im Beispiel 1 beschriebene.
Beispiel 3 In eine Mischung von 50 mg Faktor III und 300 g Natriumcarbonat (Na2CO3. 1 OH2O) in 250 ml Wasser werden in einem 11 fassenden Gefäß bei 37° unter lebhaftem Rühren während 4 Stunden in kleinen Portionen 33, 7 ml Diäthylsulfat eingetragen. Anschließend werden 150 ml Wasser und 125 ml einer wäßrigen Phenollösung, enthaltend 80°/o Phenol, zugefügt und weiterbehandelt, wie im Beispiel 1 beschrieben. Bei der Zellulose-Säulenchromatographie (s. Beispiel 1) erscheinen zwei violette chromatographische Zonen, und zwar A. eine untere, kräftige, schnell bewegliche Zone des Faktors IIIe, vom R-Wert 0, 4 ; B. eine obere, schwache, langsam laufende Zone des Faktors III mit dem R-Wert 0, 12.
Nach Elution und üblicher Verarbeitung (s. Beispiel 1) kristallisiert der Faktor III e in schonen, 1 cm langen dunkelroten Spießen. Ausbeute an vollkommen reinem kristallisiertem Produkt 34, 2 mg (68, 4 0/,). Aus der Zone B werden 10 mg Faktor III zurückgewonnen.
Der in der beschriebenen Weise erhaltene kristallisierte Faktor III e ist aktiv gegenüber E. coli, L. leichmannii und Ochromonas malhamensis. Das Absorptionsspektrum des Faktors IIIe ähnelt dem des Faktors III. In seinem chromatographischen Verhalten ist der Faktor III e vom Vitamin B12 kaum zu unterscheiden (s. Tabelle 2).
Da der Faktor III e unter völlig gleichen Bedingungen wie Faktor III m dargestellt wurde, besitzt er zweifellos die analoge Struktur, er unterscheidet sich also vom Faktor III m nur dadurch, daß er am Sauerstoffatom der Benzimidazolgruppe statt eines Methylrestes einen Athylrest besitzt. Dieser Vorstellung entsprechen auch völlig die physikalischen Daten des Faktors III e (s. Tabelle 2).
Der Faktor IIIe kann also rationell als 5 (6)-Äthoxybenzimidazol-cobalamin bezeichnet werden. Dieses Produkt wurde erstmalig von J. Pawelkiewicz und K. Nowakowska (Acta Biochim. Polon., 2, 259 [1955]) auf biosynthetischem Wege gewonnen. Das von diesen Verfassern ermittelte Absorptionsspektrum dieses Faktors stimmt mit dem des in der geschilderten Weise gewonnenen Faktors IIIe vollkommen überein.
Beispiel 4 In eine Mischung von 100 ml Faktor III und 120 g Na2CO3-1 OH2O in 100 ml Wasser werden in einem 11 fassenden Gefäß bei 37° unter lebhaftem Rühren während 4 Stunden in kleinen Portionen 13, 5 ml Diäthylsulfat eingetragen. Bereits während der Reaktion scheiden sich rote, feinkristalline Stäbchen ab, die hauptsächlich aus Faktor III e bestehen. Anschließend werden 60 ml Wasser und 50 ml einer wäßrigen Phenollösung, enthaltend 80 °/0 Phenol, zugefügt. Der Ansatz wird nun, wie im Beispiel 3 beschrieben, weiterverarbeitet. Ausbeute an völlig reinem kristallisiertem Faktor III e 68, 6 ml (68, 6°/o). An nicht umgesetztem Faktor III werden etwa 20 mg zurückgewonnen.
Beispiel 5 50 mg Faktor III werden, wie im Beispiel 1 beschrieben, methyliert, jedoch mit dem Unterschied, daß als Methylierungsmittel 12, 5 ml Benzolsulfon-säuremethylester verwendet werden. Die Reaktionsbedingungen sind sonst die gleichen wie im Beispiel 1. Die Aufarbeitung erfolgt ebenfalls so wie im Beispiel 1. Die Ausbeute an Faktor III m beträgt 80 °/0.
Beispiel 6 50 mg Faktor III werden, wie im Beispiel 1 beschrieben, methyliert, jedoch mit dem Unterschied, daß als Methylierungsmittel 37, 5 ml p-Toluolsulfonsäuremethylester verwendet werden und daß die Methylierung 10 Stunden lang vorgenommen wird. Im übrigen geht man genau so vor wie im Beispiel l. Man erhält eine Ausbeute von 10 0/0 an Faktor III m.
Die nachfolgenden Tabellen enthalten Gegenüberstellungen der Eigenschaften der Faktoren III und IIIm bzw. III e.

Tabelle 1

Physikalische bzw. chemische Merkmale Faktor IIIm Faktor III

Absorptionsspektrum............................... wie Faktor III vgl. Angew. Chem., 65,

627 [1953]

Elektrophoretisches Verhalten neutral neutral

in wassergesättigtem sek.-Butanol + CN'praktisch wie Faktor III vgl. Angew. Chem. 65,

627 [1953]

Rf-Werte

in wassergesättigtem sek.-Butanol + NHg + CN'... 0, 32 0, 257

Vert. Koeff. = 1*), (NH4) 2SO4 in % ........................ 32 34

Abbauprodukte mit 70°/oiger Perchlorsäure Ätiocobalamin und Nu-Ätiocobalamin und Nu-

cleotid des Faktors III m cleotid des Faktors III

Absolutes Maximum der Nucleotide 288 289

in mµ beim PH-Wert 8,3 .......................... 247,5 289,5 248 291

in mµ beim PH-Wert 12............................ 247,5 289,5 316

Base............................................. 5 (6)-Methoxybenzimidazol 5 (6)-Hydroxybenzimidazol

*) Im System n-Butanol/Wasser + Ammonsulfat. Die Zahlen geben den Gehalt an Ammonsulfat in der wäßrigen Phase an, bei dem der Verteilungskoeffizient = 1 ist.

Tabelle 2

Physikalische bzw. chemische Merkmale Faktor IIIe Faktor III m

Absorptionsspektrum ähnlich Faktor III

Elektrop0horetisches Verhalten ................... neutral

Vert. Koeff. = 1a), (NH4)2SO4 in % ............... 25,5

Papierchromatographisches Verhaltenb) Rf RB12 RFIII Rf

Entwicklersysteme :

1. wassergesättigtes sek.-Butanol + CN' .......... 0,266 0,989 1,26

2. wie 1, mit Eisessigc) ......................... 0,304 1,0 1,21 0,252

3. wie 1, mit NH3d) .............................. 0,324 0,972 1,20

4. wie 1, mit 3% Kalignoste) ..................... 0,333 0,96 1,17 0,266

5. wie 1, mit 3% NaClO4e)......................... 0,415 0,98

6. wie 1, mit KClO4, gesättigte) ................. 0,303 1,0

7. wie 1, mit 3% Na-Camphersulfonate) ............ 0,38 0,978

a) Siehe Tabelle 1. b) Aufsteigend, Entwicklungsdauer 48 Stunden. c) 100 ml sck.-Butanol + 1 ml Eisessig + 50 ml Wasser + 0,5 ml 1%ige wäßrige Blausäure. d) 100 ml sek.-Butanol + 14 ml 25%ige wäßrige NH3-Lösung + 36 ml Wasser + 0,5 ml 1%ige wäßrige Blausäure. e) S. W. Frie drich, G. Groß und K. Bernhauer, Mikrochemie und Mikrochim. Acta (Wien), im Druck.

Claims

PATENTANSPRÜCHE : 1. Verfahren zur Herstellung von Vitaminen der Bl2-Gruppe, dadurch gekennzeichnet, daß man auf den Vitamin-B12 Faktor III in wäßriger Phase in schwach alkalischem Milieu, zweckmäßig bei 20 bis 60°, ein Dialkylsulfat oder einen Benzol-bzw. Toluolsulfosäurealkylester einwirken läßt, das Reaktionsgemisch mit phenolhaltigen Kohlenwasserstoffen extrahiert und die Trennung des in dem Extrakt enthaltenen Reaktionsproduktes von unverändertem Faktor III chromatographisch vornimmt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Gemisch der Bl2-Faktoren nach der Reaktion mit Hilfe der Zellulose-Säulenchromatographie unter Verwendung von wasser-, cyanidionen-und ammoniakhaltigem sek.-Butanol als Entwickler getrennt wird und die dabei gewonnenen Eluate durch Destillation vom Ammoniak befreit werden.