DE1695308C3

DE1695308C3 - Verfahren zur Isolierung von Adenosintriphosphat

Info

Publication number: DE1695308C3
Application number: DE1695308A
Authority: DE
Inventors: Takashi Deguchi; Teruo Hayashi; Kiyoshi Kumabe; Hirotoshi Samejima; Masami Serizawa; Hiroshi Teranishi
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1966-05-13
Filing date: 1967-01-28
Publication date: 1974-10-31
Also published as: GB1118669A; US3493558A; DE1695308A1; FR1515265A; DE1695308B2

Description

durch eine Harzkolonne geschickt, die mit 201 eines basischen Anionenausstauscherharzes vom Polystyrolquaternären Ammonium-Typ in seiner Chlorid-Form beschickt war. Das Harz wurde mit Wasser gewaschen und anschließend mit einer 0,54%igen wäßrigen Ammoniumchlorid-Lösung gewaschen, um den pH-Wert des Ablaufs auf 7,0 einzustellen. Dann schickte man 601 einer wäßrigen 0,5n-Salzsäure mit 0,29% NaCl durch die Harzkolonne, um eine Adenosintriphosphat-Endfraktion von 601 mit 8,2 mg/ml Adenosintriphosphat zu sammeln.

Die Adenosintriphosphat-Fraktion wurde anschließend mit konzentrierter Natronlauge auf einen pH-Wert von 3JO eingestellt und mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 41/Std. durch drei hintereinandergeschaltete Harzkolonnen geschickt, von denen jede mit 1 1 des schwach basischen Anionenaustauscherharzes in seiner Chlorid-Form beschickt war. Nachdem 301 der Lösung das System passiert hatten, wurde eine neue regenerierte Harzkolonne als vierte Kolonne an ao das System angehängt. Um die restliche Adenosintriphosphatlösung in die folgenden Kolonnen zu drücken, wurde in die erste Kolonne 1 1 Wasser gefüllt und diese dann aus dem System entfernt.

Dann wurden 15 1 der Adenosintriphosphat-Fraktion von der zweiten bis vierten Kolonne in das System eingeführt. Die zweite Kolonne wurde dann wie die erste Kolonne von der Adenosintriphosphatlösung befreit und aus dem System entfernt. Ihr folgte eine neue regenerierte Harzkolonne, die als fünfte Kolonne in Serie an das System angehängt wurde. In gleicher Weise wurde mit der dritten Kolonne verfahren.

Jede der drei entfernten Kolonnen wurde mit einer wäßrigen In-Natronlauge (Strömungsgeschwindigkeit 21/Std.) eluiert, wobei jede Kolonne 3 i Adenosintriphosphatfraktion lieferte. Die vereinigten Fraktionen (9 1) hatten eine Adenosintriphosphat-Konzentration von 44,0 mg/ml und wurden durch Zufügen von wäßriger 6n-Salzsäure auf einen pH-Wert von 3,0 eingestellt. Die erhaltene Lösung war gefärbt und hatte eine optische Dichte von 1,8 bei 420 πιμ. Das Eluat wurde mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 31/Std. durch eine Harzkoionne (Durchmesser 8 cm) geschickt, die mit 21 eines amphoteren, schwach sauren, schwach basischen, entfärbenden Austauscherharzes beschickt war. Die Anfangsfraktion von 11 wurde verworfen, und die weitere, Adenosintriphosphat-haltige Fraktion wurde gesammelt. Danach wurde 21 Säure vom pH-Wert 3,0 in das System eingeführt, um die restliche Lösung aus der Kolonne zu drücken. Man erhielt 101 kombinierten Ablauf mit einer Adenosintriphosphat-Konzentration von 38,4 mg/ml, einem pH-Wert von 3,0 und einer optischen Dichte von 0,08 bei 420 πιμ.

Man fügte 301 Methylalkohol unter anfänglichem schwachem Rühren zu, um das kristalline Dinatriumsalz des Ademosintriphosphats abzutrennen, das dann in 41 Wasser gelöst und zu 4196%igem Äthanol unter langsamem Rühren allmählich zugefügt wurde, wobei das Dinatriumsalz des Adenosintriphosphats in kristalliner Form ausfiel. Diese Kristalle wurden abfiltriert und in etwa 8 Stunden in der Kälte getrocknet. Man erhielt 374 g eines weißen kristallinen Pulvers des Dinatriumsalzes des Adenosintriphosphats mit einer 98,2%igen Reinheit.

Diese übliche Umkristallisation führt zu einer geringen Verbesserung des die Toxizität bemessenden LD_B0*Wertes.

Tabelle 1

LD₅₀-WeIIe des Adenosintriphosphais

aus verschiedenen Stufen des Beispiels 1

gemessen an Meerschweinchen

Getestetes Material

LD₅₀ i. v.
mg/kg

ATP-Fraktion aus dem stark basischen
Anionenaustauscherharz I 140

ATP aus dem Eluat vom schwach basischen, porösen Anionenaustauscherharz I 230

ATP aus dem Ablauf des amphoteren,
schwach sauren, schwach basischen,
entfärbendes Austauscherharz I 480

Umkristallisiertes Dinatriumsalz des
ATP I 510

Tabelle 2

Vergleich von erfindungsgemäß hergestelltem

Dinatriumsalz des Adenosintriphosphats
mit einem Dinatriumsalz des Adenosintriphosphats

handelsüblicher Qualität

hinsichtlich der Toxizität (LD₆₀)

gemessen an Meerschweinchen

Dinatriumsalz des ATP	LD₈₀ i. v. mg/kg
Handelsübliche Qualität in Japan	250
Handelsübliche Qualität in USA	251
Nach Beispiel 1 hergestelltes erfindungs
gemäßes Produkt	510
Nach Beispiel 2 hergestelltes erfindungs
gemäßes Produkt	390
Beispiel 2

Adenosintriphosphat wurde aus Adenosinmonophosphat, das in üblicher Weise durch Hydrolyse von Ribonucleinsäure (RNA) hergestellt und gereinigt worden war, über dessen Morpholidat, das mit Tributylammoniumpyrophosphat umgesetzt wurde, synthetisch hergestellt (vgl. J. Amer. Chem. Soc. 83 [1961], S. 649 bis 658).

500 g des auf diese Weise dargestellten Adenosintriphosphat wurden in 501 Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung durch Zufügen von Natronlauge auf 12,0 eingestellt. Die alkalische Lösung wurde dann mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 401/Std. durch eine Harzkolonne geschickt, die mit 201 eines basischen Anionenaustauscherharzes vom Polystyrol quaternären Ammonium-Typs in der Chlorid-Form gefüllt war. Das Harz wurde dann mit Wasser gewaschen. Anschließend schickte man 1401 einer wäßrigen 0,02 n-Salzsäure mit 0,29% NaCl, 801 einer wäßrigen 0,02 n-Salzsäure mit 0,59% NaCl und 601 einer wäßrigen 0,05n-Salzsäure mit 0,29% NaCl nacheinander als Eluierlösung durch die Harzkolonne, um 601 einer Adenosintriphosphat-Fraktion mit 8,0 mg/ml Adenosintriphosphat zu erhalten.

Die Fraktion wurde anschließend mit Natronlauge auf einen pH-Wert von 3,0 eingestellt und mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 41/Std. durch drei in

Serie geschaltete Harzkolonnen geschickt, von denen einigten Fraktionen der drei Kolonnen hatten eine

jede mit 11 eines schwach baiischen Anionenaus- Konzentration von 45,3 mg/ml. Die Behandlung mit

tauscherharzes in der Acetatform beschickt war. dem amphoteren, schwach sauren, schwach basischen,

Adenosintriphosphat wurde in ähnlicher Weise wie im entfärbenden Austauscherharz, Ausfällen mit Methanol

Beispiel 1 beschrieben von dem Harz adsorbiert. Die 5 und Umkristallisieren mit Äthanol wurde in ähnlicher

drei Harzkolonnen wurden anfangs mit Wasser und Weise, wie im Beispiel 1 beschrieben, ausgeführt und

später mit 0,5n~NatronIauge (Strömungsgeschwindig- ergab eine Ausbeute von 383 g eines weißen kristallinen

keit: 31/Std.) gewaschen, wobei man je Kolonne 4,5 1 PuJvers des Dinatriumsalzes des Adenosintriphosphats

einer Adenosintriphosphatfraktion erhielt. Die ver- in einer Reinheit von 97,4% als wasserfreies Salz.

Claims

geringe Mengen stark toxischer Verunreinigungen.

Patentanspruch- Es besitzt eine Toxizität entsprechend einem LD₅₀-

Wert von 250 mg/kg, gemessen an Meerschweinchen.

Verfahren zur Isolierung von Adenosintriphos- Gemäß dem erfindunssgemäßen Verfahren gdingt

phat (ATP) unter Entfernung toxischer Begleitstoffe 5 es demgegenüber, aus Rohlosungen, wie sie nach den aus Lösungen, die bei dessen fermentativer Her- oben angegebenen Herstellungsverfahren erhalten stellung mit Hilfe von Brevibacterium ammonia- werden, ein ATP zu isolieren das erheblich weniger genes oder bei dessen chemischer Synthese aus toxisch wirksame Stoffe enthalt als das nach den be-Adenosin-S'-monophosphoromorpholidat und Tri- kannten Verfahren dargestellte. -,,.„.

butylammoniumpyrophosphat erhalten worden io Dieses Ergebnis wird dadurch erreicht, daß das sind, durch ein mehrstufiges Reinigungsverfahren Eluat der ersten Stufe auf einen pH-Wert von 1,5 bis an Ionenaustauschern, wobei in der ersten Stufe 3,0 eingestellt, danach in einer zweiten Stufe an einem ein stark basischer Ionenaustauscher und ver- schwach basischen, porösen Anionenaustauscherharz dünnte, Natriumchlorid enthaltende Salzsäure als vom phenol-aliphatisehen Amin-Typ in der balzform Elutionsmittel verwendet wird, dadurch ge- 15 adsorbiert und mit einer wäßrigen 0,5-bis in-aJkaukennzeichnet, daß das Eluat der ersten sehen Lösung eluiert wird, daß die ATP-Losung aus Stufe auf einen pH -Wert von 1,5 bis 3,0 eingestellt, der zweiten Stufe auf einen pH -Wert von 1,0 bis 5,0 danach in einer zweiten Stufe an einem schwach eingestellt und danach in einer dritten Stufe mit einem basischen, porösen Anionenaustauscherharz vom amphoteren, schwach sauren, schwach basischen, ent-Phenol-aliphatischen Amin-Typ in der Salzform 20 färbenden Austauscherharz behandelt und der das adsorbiert und mit einer wäßrigen 0,5- bis 1 n-alka- ATP enthaltende Ablauf mit einem niedermolekularen Iischen Lösung eluiert wird, daß die ATP-Lösung aliphatischen Alkohol versetzt wird, wobei das ATP aus der zweiten Stufe auf einen pH-Wert von in Form des Dinatriumsalzes ausfällt. Die zweite Stufe 1,0 bis 5,0 eingestellt und danach in einer dritten mag nahe gelegen haben. Sie ist jedoch darauf ausge-Stufe mit einem amphoteren, schwach sauren, 25 richtet, das ATP aus einer Lösung mit hohem Anteil schwach basischen, entfärbenden Austauscherharz an neutralen Salzen abzutrennen, um schließlich nach behandelt und der das ATP enthaltende Ablauf dem Eluieren mit verhältnismäßig wenig Lauge eine mit einem niedermolekularen aliphatischen Alkohol konzentrierte Lösung zu erhalten. Sie ist bedeutungsversetzt wird, wobei das ATP in Form des Di- voll für die Wirksamkeit der dritten Stufe. Hohe Salznatriumsalzes ausfällt. 30 konzentrationen können nämlich dort erheblich stören.

Erfindungswesentlich ist daher die Kombination der zweiten mit der dritten Stufe, wodurch der angestrebte Effekt erzielt wird.

Das erfindungsgemäß dargestellte ATP enthält we-35 sentlich weniger toxisch wirksame Stoffe als das nach

den bekannten Verfahren gewonnene. Das zeigt der

ermittelte LD₅₀-Wert von 480 mg/kg. Selbstverständlich kann das so hergestellte ATP durch nachgeschaltete klassische Reinigungsstufen wie Umkristallisation 40 verbessert werden, was jedoch häufig gar nicht erfordeilich ist. Dieses ATP kann somit in der Therapie in

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur erheblich größerer Dosis als handelsübliche Präparate Isolierung von Adenosintriphosphat (AT?) unter Ent- eingesetzt werden. Somit können bessere Heileffekte fernung toxischer Begleitstoffe aus Lösungen, die bei erzielt werden. Da das ATP nach dem erfindungsdesiien fermentativer Herstellung mit Hilfe von 45 gemäßen Verfahren trotz der umfangreichen Reini-Brevibacterium ammoniagenes oder bei dessen chemi- gungsoperationen in guter Ausbeute darstellbar ist, scher Synthese aus Adenosin-S'-monophosphoromor- läßt sich eine Produktion auf industrieller Basis durchpholidat und Tributylammoniurapyrophosphat (vgl. führen.

J. Am. Chem. Soc. 83 [1961], S. 649 bis 658) erhalten Das schwach basische, poröse Anionenaustauscher-

worden sind, durch ein mehrstufiges Reinigungs- 50 harz der zweiten Stufe wird in der Salzform, z. B. in verfahren an Ionenaustauschern, wobei in der ersten der Chlorid-, Acetat-, Sulfat- oder Formiatform verStufe ein stark basischer Ionenaustauscher und ver- wendet, wobei mehrere Kolonnen mit diesem Anionendünnte, Natriumchlorid enthaltende Salzsäure als austauscherharz hintereinander geschaltet werden kön-Elutionsmittel verwendet wird. nen. Als amphoteres, schwach saures, schwach basi-

Es ist bereits bekannt, ATP-Lösungen durch Adsorp- 55 sches, entfärbendes Austauscherharz wird in der tion an ein stark basisches Anionenaustauscherharz dritten Stufe vorzugsweise ein Harz mit Hydroxyl- und und anschließende Eluierung zu reinigen (vgl. Journal Anilingruppen und ;zur Ausfällung des ATP nach der Am. Chem. Soc. 72 [1950], S. 4273 bis 4275). dritten Stufe Methanol oder Äthanei verwendet.

Nach dem in der Praxis üblichen Verfahren zur Die folgenden Beispiele und Tabellen erläutern die

Herstellung von ATP geringer Toxizität (vgl. belgische 60 Erfindung.
Patentschrift 655 014), wird die ATP-Lösung ebenfalls B e i s d i e 1 1

zunächst durch Behandlung mit einem stark basischen ^p

Ionenaustauscher gereinigt; das Eluat dieser ersten

Reinigungsstufe wird dann mit Natriumhydroxid neu- 1201 einer Gärbrühe aus der Vergärung von Brevi-

tralisiert. Die so erhaltene Lösung wird mit Aktivkohle 65 bacterium ammoniagenes (ATCC 6872), enthaltend behandelt und nach der Filtration engeengt. Beim Ab- 4,5 mg/ml Adenosintriphosphat, 1,2 mg/ml Adenosinkühlen kristallisiert das Natriumsalz des ATP aus. diphosphat, 0,4 mg/ml AdenosinmonOühosphät, wur-Das nach diesem Verfahren gewonnene ATP enthält den mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 401/Std.