DE1966849C3 - 1 zu 1 Komplex von Cephalosporin C und Zink in kristalliner Form - Google Patents

Description

Barium) enthalt Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Schwermetallkompiexes ist es, daß er ohne komplizierte und aufwendige Aufarbeitt-ngsmethoden aus verdünnten Lösungen, die noch einen großen Anteil von Verunreinigungen enthalten, in homogener niikrokristalliner Form (von hohem Reinheitsgrad) ausgefällt werden kann und daß die Fällungen gut filtrierbar und bestandig sind. Das ist bei den obengenannten A'kali- und Erdalkalisalzen nicht der FaIL Beispielsweise muß man, um aas Bariumsalz von Cephalosporin C aus >° wässeriger Lösung zu isolieren, z. B. durch Filtrieren oder Zentrifugieren, die wässerige Lösung 35mal stärker konzentrieren als beim Zinkkomplex; das Natriumsalz kann man nur aus 350mal stärker konzentrierter Lösung abtrennen. Ein weiterer Vorteil >s des neuen Komplexes ist es, daß man daraus direkt (ohne vorherige Isolierung von Cephalosporin C oder dessen Natriumsalz) nach dem Halogenimidverfahren (vgL belgische Patente 6 43 899 und 7 20185) 7-Aminocephalosporansäure (7-ACS) in sehr guter Ausbeute zo herstellen kann, während das Bariumsalz unter gleichen Bedingungen nicht einmal Spuren von 7-ACS liefert Die Verwendbarkeit des neuen Zinkkomplexes zur Herstellung von 7-ACS nach dem Halogenimidverfahren ist daher ebenfalls überraschend.

Der Zinkkomplex wird bei einem pH-Wert von etwa 3—7, vorzugsweise 5 — 6 ausgefällt Das Cephalosporin C kann in der wässerigen Lösung in Form eines Salzes, z. B. eines Alkali- oder Erdalkalimetall- oder Ammoniumsalzes, z. B. des Natrium- oder Calciumsalzes, oder eines Salzes mit einer organischen Base wie Triäthylamin vorliegen. Die wässerige Lösung kann auch mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel, z. B. Alkohole, wie Äthanol oder Isopropanol, enthalten.

Der mikrokristalline Zinkkomplex kann leicht von der Lösung abgetrennt werden, z. B. durch Filtration, Abnutschen, Zentrifugieren. Er wird dann zweckmäßig mit Wasser und/oder organischen Lösungsmitteln gewaschen.

Wenn erwünscht, kann man den Zinkkomplex durch Umfällung bzw. Umkristallisation weiter reinigen, z. B. indem man den Komplex in einer Säure löst und aus der sauren Lösung durch Zugabe von Basen, wie verdünnter Natronlauge oder Triäthylamin wieder ausfällt

Der erfindungsgemäße Zinkkomplex von Cephalosporin C unterscheidet sich, wie bereits erwähnt von den bekannten Salzen des Cephalosporin C. Der Komplex wandert in der Papierelektrophorese als einheitlicher Substanzfleck. Die Löslichkeit in Wasser und in organischen Lösungsmitteln ist sehr gering. In S° der folgenden Tabelle ist die Löslichkeit des Cephalosporin C-Zinkkomplexes in Gramm pro 100 ml in Wasser, Niederalkanolen und in Aceton angegeben.

Tabelle

-

Lösungsmittel

Löslichkeit
OT

Dest Wasser	0,106	0,095
Methanol	0,037	0,035
Äthanol	0,034	0,027
Isopropanol	0,010	0,001
Aceton	0,005	0,014

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Zur Herstellung der als Ausgangsmaterial verwendeten Cephalosporin C-haltigen lösungen bedient man sich Hfr fOr Hie Isolierung von sauren hydrophilen Naturprodukten, z. B. Antibiotika, Wuchsstoffen, Vitaminen, aus Fermentationsflüssigkeiten üblichen Methoden. Als solche Methoden sind vor allem zu nennen:

1) Adsorption bzw. Absorption, z. B. an Aktivkohlen, wie »Norit«; an basischen Adsorptionsmitteln, wie Aluminiumoxid; an nichtionischen Entfärbungs- und/oder Adsorptionsharzen, wie »Asmit« (Pheny-

lendiamin-Formaldehyd- Kondensationsprodukt von Imacti-Maatsch.),»Amberiite« XAD-I, XA D-2, XAD-4 oder XAD-5 (Polystyrol-Polymerisate von Roehm&Haas), »Amberiite« XAD-7 oder XAD-8 (Acrylsäure-Polymerisate); an basischen Ionenaustauschern, wie »Amberiite« IR-4B (Phenol-Polyamin mit primären und sekundären Aminogruppen, schwach basisch), »Amberiite« IR-45, IRA-93 (Styrol-Divinylbenzol-Polymerisate mit primären, sekundären und tertiären Aminogruppen, schwach basisch), »Amberiite« XE-265 (Polyamin, schwach basisch), »Amberiite« 68 (Methacrylsäure-Polymerisat schwach basisch) »Amberiite« IRA-400, IRA-401, IRA-402, IRA-410 (Styrol-Divinylbenzol-Polymerisate mit quaternären Aminogruppen, stark basisch), »Amberiite« LA-I, LA-2 oder LA-3 (flüssige sekundäre oder primäre Amine mit hohem Molekulargewicht) oder an entsprechenden Ionenaustauscherharzen anderer Firmen, wie »Dowex 1 bis 4 (Dow Chemical Co.), »De-Acidit« FF (The Permutit Co.) »Imac« A 13, A 17, A 20, S. 5-40 (Imacti-Maatsch.);

2) Verteilung zwischen Lösungsmitteln, z. B. zwischen Wasser und Phenol oder alkyl-substituierten Phenolen, bei saurem oder schwach basischem pH-Wert;

3) chemische oder biologische Zerstörung von Nebenprodukten, z. B. mittels Säuren wie Schwefelsäure oder Oxalsäure, oder sauren Ionenaustauschern, z.B. »Amberiite« IR-120 (Styrol-Divinylbenzol-Poiymerisat mit Sulfonsäuregruppen) oder mittels Enzymen, z. B. Penicillinase.

Die Herstellung des erfindungsgemäßen Komplexes wird in den folgenden Beispielen beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.

Beispiel 1

Zu 156 ml einer Lösung mit einem Gehalt von ungefähr 7,7% an Cephalosporin C und der 3- bis 4fachen Menge an aus dem Kulturfiltrat stammenden Verunreinigungen gibt man unter Rühren und Kühlen im Eisbad eine Lösung von 44 g kristallisiertem Zinkacetat [Zn(OOCCH₃)2 · 2 H₂O] in 88 ml Wasser dazu, wobei das Gemisch noch klar bleibt

Anschließend läßt man unter starkem Rühren und weiterer Eiskühlung aus einem Tropfrichter in feinem Strahl 260 ml trockenes Äthanol (während 10-15 Minuten) einfließen und impft mit einer Spur Cephalosporin C-Zinkkomplex an und rührt weiter während 1¹A Stunden. Dabei wird die entstehende Trübung nach etwa '/< Stunde sehr stark, und ein feiner, kristalliner Niederschlag beginnt sich abzuscheiden. Man trennt den Niederschlag auf der Nutsche ab, wäscht ihn mit wenig Äthanol/Wassergemisch (6 :4) und dann mit 95%igem Alkohol nach und trocknet den Rückstand im Hochvakuum. Man erhält 6,2 g nahezu reinen Cephalosporin C-Zinkkomplex.

UV-Spektrum: A™„262 mu (e - 7300); IR-Spektrum in Nujol (s. Fig. 1). In der Papierelektrophorese in einem Kalium-Natriumphosphatpuffer (Vu molar; pH 5,5; 1'/» Stunden; 2OQOVoIt^ wandert der Komplex h!s

einheitlicher Substanzfleck, welcher mit UV-Spektrum oder Ninhydrin-Kollidin nachgewiesen werden kann, 10 cm gegen die Am* Ir.

Die Ausgangslösung kann wie folgt hergestellt werden:

Nach der in der britischen Patentschrift 9 68 324 beschriebenen Methode wird die Cephalosporin C-haltige Kulturlösung unter Zusatz eines Filterhilfsmittels filtriert, das Filtrat mit einem starksauren Ionenaustauscher in der Säureform auf pH 3 gebracht und durch einen basischen Austauscher in der Acetatform laufen gelassen, um die anorganischen Anionen gegen Acetat auszutauschen, das Cephalosporin C an Amberlite IR-4B adsorbiert und mit Pyridinacetatpuffer eluiert und aus dem eingeengten Eluat das rohe Cephalosporin C mit Aceton gefällt, filtriert und getrocknet 43,5 g der erhaltenen Fällung (Gehalt an Cephalosporin C 27,5%) werden in 156 ml Wasser gelöst.

Beispiel 2

13 g einer Fällung von rohem Cephalosporin C (Reinheit 23%), die nach dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren erhalten wurde, werden in 3,8 ml Wasser gelöst Dazu gibt man eine Lösung von 1,1 g Zinkacetat in 2,4 ml Wasser. Dann läßt man 8,2 ml Isopropylalkohol zutropfen und rührt 5 Stunden bei 0°. Nach dem Abnutschen und Trocknen erhält man 208,5 mg eines nahezu farblosen Kristallisates.

Im nachstehenden Versuch wird die Verwendung des

erfindungsgemäßen Komplexes zur Herstellung von 7-ACS geschildert:

2,40 g etwa 73prozentiger Cephalosporin C-Zinkkomplex werden in 250 ml absolutem Methylenchlorid suspendiert. Nach Zugabe von 2,42 ml absolutem Pyridin und 5,28 ml Trimethylchlorsilan wird 2 Stunden bei 30° gerührt, wobei eine farblose, fast klare Lösung erhalten wird. Diese wird mit 5,44 ml absolutem Pyridin versetzt. Nach Abkühlen der Lösung auf unter -20° läßt man 44,4 ml einer 8prozentigen Lösung von Phosphorpentachlorid in Methylenchlorid zulaufen und rührt 40 Minuten bei -12°. Nach erneuter Kühlung unter — 20° werden 56 ml absolutes Methanol zugetropft Man läßt 30 Minuten bei -10° und weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur ausreagieren. Die trübe Lösung wird nach der Zugabe von 12 ml 25prozentiger wässeriger Ameisensaure fi-triert und der pH-Wert von 13 auf 2,0 erhöht, wozu 5.6 ml Triäthylamin benötigt werden. Man rührt die gebildete Suspension 45 Minuten bei Raumtemperatur. Hierauf wird mittels Triäthylamin (8,5 ml) ein pH-Wert von 3,25 eingestellt Das Reaktionsgemisch wird nach 90 Minuten Kühlung im Eisbad filtriert Der Rückstand wird mit Methanol gut gewaschen. Der fast farblose Niederschlag wird mit

Methylenchlorid und Äther nachgewaschen und im Vakuum getrocknet Man erhält 0,75 g 7-ACS von 94prozentiger Reinheit Im UV-Spektrum (in O₁InN-NaHCO₃) ist A_(MI-264mu (ε-8000); λ_Βώ-222ΐημ (ε-4300).

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Der 1 :1-Komplex von Cephalosporin C und Zink in kristalliner Form.

   Gegenstand der Erfindung ist der schwerlösliche 1 :1-Komplex von Cephalosporin C und Zink. Dieser Komplex kann aus wasserigen Lösungen, welche rohes, fermentativ gewonnenes Cephalosporin C enthalten, ausgefällt werden.

   Bekanntlich erhält man bei der Herstellung von Cephalosporin C durch Fermentation eine wässerige Lösung, in der das Cephalosporin C in geringer Menge neben zahlreichen anderen, z. T. ähnliche physikalische und chemische Eigenschaften aufweisenden gelösten Stoffen, z. B. neben variierenden Mengen von Penicillin N, einem ebenfalls hydrophilen Antibiotikum, enthalten ist Die Reindarstellung von Cephalosporin C aus solchen Kulturlösungen bzw. aus dem daraus erhältlichen Rohprodukt oder sehr verdünnten, z. B. 2-3%igen wässerigen FermentationsbrQhen ist sehr kompliziert und schwierig. Man erhält das Rohprodukt meist als schmieriges, uneinheitliches Gemisch von wechselnder Zusammensetzung und wechselnden physikalisch-chemischen Eigenschaften, so daß die Aufarbeitung häufig von Ansatz zu Ansatz variiert werden muß.

   Als Verfahren zur Isolierung von Cephalosporin C aus Fermentationslösungen wurde z. B.' vorgeschlagen, das Cephalosporin C ah Aktivkohle zu adsorbieren, zu eluieren, das eluierte Material an Aluminiumoxyd zu adsorbieren, erneut zu eluieren, an einem Anionenaustauscherharz zu adsorbieren, mit einer wässerigen Pufferlösung vom pH 2Ji bis 8,0, z. B. Pyridinacetat, das rohe Cephalosporin C zu eluieren und dieses dann einem Extraktionsprozeß mit Lösungsmitteln zu unterwerfen, vgl. die deutsche Patentschrift JO 14 711. Nach einem weiteren Verfahren soll Cephalosporin C durch Lösungsmittelfriktionierung, insbesondere zwischen Wasser und Phenol oder alkyl-iubitituierten Phenolen erhalten werden. Als weitere Möglichkeit wurde vorgesehen, Eluate aus der Aktivkohlesäule oder der Aluminiumoxydsäule oder der Säule aus Ionenaustauscherharz solchen Bedingungen in bezug auf Temperatur und Acidität auszusetzen, daß das im Kulturfiltrat enthaltene Penicillin N in die entsprechende Penicillinsäure umgewandelt wird, das Cephalosporin C jedoch praktisch unbeeinflußt bleibt, oder das Penicillin N unter der Einwirkung von Penicillinase zu zerstören und das Cephalosporin C dann durch fraktionierte Extraktion mit Lösungsmitteln oder durch Chromatographie mit einem Ionenaustauschharz abzutrennen. Man hat auch versucht, Cephalosporin C aus dem säurebehandelten Medium direkt mit einem Ionenaustauscher zu adsorbieren. Diese direkte Adsorption hatte jedoch die Nachteile, daß infolge der Anwesenheit anderer Anionen außer Cephalosporin C sehr große Mengen des AniOnenaustauschharzes erforderlich waren und darüber hinaus die Chloridionen miteluiert wurden und in den weiteren Stufen des Verfahrens Schwierigkeiten verursachten. Schließlich wurde ein Verfahren beschrieben, bei dem das geklärte Fermentationsmedium mit einem stark saure Gruppen in der H+-Form enthaltenden Kationenaustauscher auf ein pH von 2Ji bis 4,0

   eingestellt wird, dann der Kationenaustauscher von dem

   . angesäuerten Medium abgetrennt und dieses durch einen starken Anionenaustauscher in der Form eines

   Salzes mit einer schwachen, flüchtigen, monobasischen

   5 organischen Säure von praktisch den gesamten

   Chioridionen und anderen anorganischen Anionen

   befreit wird und schließlich das Cephalosporin C aus dem Perkolat z. B. durch Adsorption ui einem

   Anionenaustauscher in der Acetatform und Elution mit

   Pyridinacetatpuffer gewonnen wird (vgL die deutsche Patentschrift 11 26 564).

   Alle diese Verfahren sind technisch und ausbeutemäßig nicht befriedigend, vgL zum Beispiel die Einleitung der deutschen Patentschrift 1126 564. Auch das

   ■j Verfahren dieser Patentschrift ist sehr kompliziert, es benötigt verschiedene Ionenaustauscher, die sich nachteilig auf die Ausbeute von Cephalosporin C auswirken, weil sie ieils eine zu geringe bzw. zu wenig selektive Adsorptionskapazität für Cephalosporin C haben oder dieses teilweise zerstören. Auch ist die Regeneration großer Mengen von Ionenaustauschern aufwendig und wegen der Unstabilität einiger Ionenaustauscher mit Verlusten verbunden. Außerdem sind große Flüssigkeitsmengen abzudampfen, etwa bis zur

   is Sirupkonsistenz, damit das Cephalosporin C oder dessen Natriumsalz abgeschieden werden.

   Es ist bekannt, rohes Cephalosporin C durch einmalige Adsorption an einem Ionenaustauscher und nachfolgende Elution aus Fermentationslösungen zu gewinnen. Zur weiteren Reinigung bzw. zur Gewinnung von weiterverarbeitbaren Zwischenprodukten wurde dieses rohe Cephalosporin C in kristallisierbare Salze, wie das Natrium-, Kalium- oder Ammoniumsalz nach vorheriger chromatographischer Trennung an einem Amberlite XE 58-Ionenaustauscher überfahrt (vgL Die Pharmazie, Bd 18 [1963] S. 253/261). Man hat auch das Bariumsalz gewonnen, wobei die chromatographische Trennung entfällt, die Nebenprodukte aber durch einen flüssigen Ionenaustauscher wie Amberlite LA-2 entfernt werden müssen und das Bariumsalz in das Natriumsalz zurücliverwandelt werden muß. Dies ist nötig, da diese Salze nur aus relativ konzentrierter und vorgereinigter Lösung kristallisiert werden, und et müssen wegen der guten Wasserlöslichkeit dieser Salz« große Verhüte bei der Aulkristallisation in Kauf genommen werden.

   Es wurde nun gefunden, daß Cephalosporin C mit Zink überraschenderweite einen ganz speziellen Komplex, nämlich den schwerlöslichen 1 :1-Komplex bildet, d. h. einen Komplex, der pro Molekül Cephalosporin C

   so 1 Atom Zink enthält, und welcher in leicht abtrennbarer mikrokristalliner Form ausfällt Es war zwar bekannt (vgl. The Biochem Journal, Band 62 [1956], S. 657), daß Cephalosporin C seine (geringe) antibakterielle Aktivität nicht verliert, wenn man einer wässerigen Lösung von Cephalosporin C Zinksulfat zufügt und die Lösung einige Stunden bei 37° C stehen läßt Dabei trat eine Ausfällung irgendeines Zinksalzes des Cephalosporins C bei den beschriebenen Versuchen nicht ein, vielmehr blieb die Vielzahl der anwesenden Ionen (Na+, Zn++,

   SO₄ - -, Cephalosporin C-Anion) bestehen.

   Der gebildete 1:1-Zinkkomplex des Cephalosporins C in kristalliner Form ist neu. Er ist strukturell verschieden von den oben genannten Alkali- und Erdalkalisalzen, welche pro Molekül Cephalosporin C die einer Carboxylgruppe entsprechende Menge Metall, also z. B. 1 Atom eines einwertigen Metalls (und entsprechend auf zwei Moleküle Cephalosporine 1 Atom eines zweiwertigen Metalls wie Calcium oder