DE1928142A1

DE1928142A1 - Verfahren zur Isolierung von schwerloeslichen Verbindungen

Info

Publication number: DE1928142A1
Application number: DE19691928142
Authority: DE
Inventors: Fechtig Dr Bruno; Bickel Dr Hans; Peter Dr Heinrich; Mueller Dr Johannes; Bosshardt Dr Rolf; Voser Dr Walter
Original assignee: Ciba Geigy AG; Ciba AG
Current assignee: Novartis AG; BASF Schweiz AG
Priority date: 1968-06-14
Filing date: 1969-06-03
Publication date: 1969-12-18
Also published as: NL159714B; NL6909057A; DE1966849C3; DE1966849B2; CS172311B2; DK126657B; PL80066B1; IT1047907B; CH510691A; DE1966849A1; BE734565A; YU39103B; GB1270448A; YU139769A; US3661901A; FR2011520A1; JPS5218275B1

Description

CIBA AKTIENGESELLSCHAFT, BASEL (SCHWEIZ)

Case 6485/1+2
Deutschland

Verfahren zur Isolierung von schwerlöslichen Verbindungen.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Isolierung von schwerlöslichen* zur weiteren Umwandlung in Cephalosporin C oder 7-Amino-cephalosporansäure geeigneten Verbindungen aus bei der fermentativen Herstellung von Cephalosporin C erhältlichen Lösungen. Diese schwerlöslichen Verbindungen sind die schwerlöslichen Komplexe des Cephalosporin C mit Schwermetallen.

Bekanntlich erhält man bei der Herstellung von " Cephalosporine durch Fermentation eine wässerige Lösung, in der das Cephalosporin C in-geringer Menge neben zahlreichen anderen, z.T. ähnliche physikalische und chemische Eigenschaften aufweisenden gelösten Stoffen, z.B. neben variierenden Mengen von Cephalosporin .N, einem ebenfalls hydrophilen Antibiotikum,

enthalten ist. Die ■ ...

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Reindarstellung von Cephalosporin C aus solchen Kulturlösungen bzw. aus dem daraus erhältlichen Rohprodukt oder sehr verdünnten, z.B. 2-3 #igen wässrigen Lösungen ist sehr kompliziert und schwierig. Man erhält das Rohprodukt meist als schmieriges, uneinheitliches Gemisch von wechselnder Zusammensetzung und wechselnden physikalisch-chemischen Eigenschaften, so dass die Aufarbeitung häufig von Ansatz zu Ansatz variiert werden muss.

Als Verfahren zur Isolierung von Cephalosporin C aus Permentafcionslösungen wurde z.B. vorgeschlagen, das Cephalosporin C an Aktivkohle zu adsorbieren, zu eluieren, das eluierte Material an Aluminiumoxyd zu adsorbieren, erneut zu eluieren, an einem Anionenaustauscherharz zu adsorbieren,, mit einer wässrigen Pufferlösung vom pH 2,5 bis 8j0, z.B. Pyridinacetat, das rohe Cephalosporin C zu eluieren und dieses dann einem Extraktionsprozess mit Lösungsmitteln zu unterwerfen, .vgl. die deutsche Patentschrift 1 014 711· Nach einem weiteren Verfahren soll Cephalosporin C durch Lösungsmittelfraktionierung, insbesondere zwischen Wasser und: Phenol oder alkyl-substituierten Phenolen erhalten werden. Als weitere Möglichkeit wurde vorgesehen, Eluate aus der Aktivkohlesäule oder der Aluminiumoxydsäule oder der Säule aus Ionenaustauscherharz solchen Bedingungen in bezug auf Temperatur und Acidität auszusetzen, dass das im Kulturfiltrat enthaltene Cephalosporin N in Penicillinsäure umgewandelt wird, das Cephalosporin C jedoch praktisch

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unbeeinflusst bleibt, oder das Cephalosporin N unter der Einwirkung von Penieillinase zu zerstören und das Cephalosporin C dann durch fraktionierte Extraktion mit Lösungsmitteln oder durch Chromatographie mit einem Ionenaustauschharz abzutrennen. Man hat auch versucht, Cephalosporin C aus dem säurebehandelten Medium direkt mit einem Ionenaustauscher zu adsorbieren. Diese direkte Adsorption hatte jedoch die Nachteile, dass infolge der Anwesenheit anderer Änionen ausser Cephalosporin C sehr grosse Mengen des Anionaustauschharzes erforderlich waren.und darüber hinaus die · Chloridionen-- mitelulert wurden und in den weiteren Stufen des Verfahrens Schwierigkeiten verursachten. Schliesslich wurde ein Verfahren beschrieben, bei dem das geklärte Fermentationsmedium mit einem stark saure Gruppen in der H-Form enthaltenden Kationenaustauscher auf ein pH von 2,8 bis 4,0 eingestellt wird, dann der Kationenaustauscher von dem angesäuerten Medium abgetrennt und dieses durch einen starken Anionenaustauscher in der Form eines Salzes mit einer schwachen, flüchtigen, monobasischen organischen Säure von praktisch den gesamten Chloridionen und anderen, anorganischen Anionen. befreit wird und schliesslich das Cephalosporin C aus dem Perkolat z.B. durch Adsorption an einem Anionenaustauscher in der Acetatform und Elution mit Pyridinacetat-

puffer gewonnen wird,(vgl. die deutsche Patentschrift .

1 126 564). Es ist L- . , : ^__

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auch bekannt, rohes Cephalosporin C durch Ueberführung in kristallisierbare Salze wie das Natrium- oder Bariumsalz zu reinigen. Jedoch können diese Salze nur aus relativ konzentrierter und vorgereinigter Lösung kristallisiert werden, und es müssen wegen der guten Wasserlöslichkeit dieser Salze grosse Verluste bei der Auskristallisation in Kauf genommen werden.

Es wurde nun ein vorteilhaftes Verfahren gefunden, bei dem aus einer Lösung, insbesondere auch aus verdünnter und/oder verunreinigter Lösung, z.B. Fermentationsflüssigkeiten oder Eluaten ein mikrokristalliner Metall komplex des Cephalosporin C mit einem Schwermetall isoliert wird. Dieser Metallkomplex lässt sich in homogener, gut filtrierbarer und beständiger Form aus der mit weiteren wasserlöslichen Stoffen verunreinigten Lösung abscheiden. Der Komplex kann leicht in Cephalosporin oder dessen wasserlösliche Salze übergeführt oder direkt für die V/eiterverar bei tung zu 7-Aminocephalosporansäure verwendet werden.

Das Verfahren gemäss der Erfindung ist dadurch

gekennzeichnet, dass man aus einer Cephalosporin C enthaltenden verdünnten wässrigen Lösung einen Metallkomplex des Cephalosporin C mit einem Schwermetall ausfällt. Als Schwermetalle sind besonders zweiwertige Schwermetalle wie Kupfer, Nickel, Blei,

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- 5 - ■

Kobalt, Eisen, Mangan, Quecksilber, Cadmium, vor allem aber Zink zu nennen. Die Fällung erfolgt in wässeriger Lösung mit-.tels eines wasserlöslichen Salzes des betreffenden Schwer-." metalles, z.B. mittels Sulfaten, Halogeniden, besonders des Chlorids, und insbesondere auch mittels des Acetats.

Der Metallkomplex wird bei einem pH von ca. 3-7.» vorzugsweise 5-6 ausgefällt. Das Cephalosporin C kann in der wässerigen Lösung in Form eines Salzes, z.B. eines Alkalioder Erdalkalimetall- oder Ammaniumsalzes, z.B. des Natrium- oder

j
Calciumsalzes, oder eines Salzes mit einer organischen Base wie Tri· äthylamin vorliegen. Die wässerige Lösung kann auch mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel, z.B. Alkohole wie Aethanol oder Isopropanol enthalten.

Der mikrokristalline Metallkomplex kann leicht von der Lösung abgetrennt werden* z.B. durch Filtration, Abnutsehen, Zentrifugieren. Er wird dann zweckmässig mit Wasser und/oder organischen Lösungsmitteln gewaschen.

Zwecks Ueberführung des Komplexes in Cephalosporin C bzw. dessen wasserlösliche Salze wie Alkalimetall- oder Ammoniumsalze wird der Komplex z.B. mit Bicarbonatlösung oder verdünnter Natronlauge oder einem entsprechenden Kationenaustauscher (z.B. "Amberlite" IRC-50 oder IR-120 oder "Dowex" •chelating resin A-I in der Natriumform) behandelt·oder das Schwermetall wird als Sulfid ausgefällt, oder es wird in

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_t ι

einen schwerlöslichen Komplex mit organischen Komplexbildnern wie 8-Hydroxychinolin oder 8-Hydroxychinaldin übergeführt.

Man kann den Komplex auch direkt als Ausgangsmaterial für die Herstellung von 7-Aminocephalosporansäure verwenden, z.B. daraus.7-ACA nach den in den belgischen Patenten 643 899 oder 720 I85 beschriebenen Verfahren herstellen.

Ferner ist es vorteilhaft, den Komplex durch Umfällung bzw. Umkristallisa-tion weiter zu reinigen, z.B. indem man den Komplex in einer Säure, z.B. in Essigsäure, löst und aus der sauren Lösung durch Zugabe von Basen wie verdünnter Natronlauge oder Triäthylamin wieder ausfällt.

Die Schwermetallkomplexe von Cephalosporin C sind neu und bilden ebenfalls einen Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Es handelt sich um l:l-Komplexe, d.h. der Komplex enthält pro Mol Cephalosporin C ein Atom des Metalls. Der Komplex wandert in der Papierelektrophorese als einheitlicher Substanzfleck. Die Löslichkeit in Wasser und in organischen Lösungsmitteln ist sehr gering. In der folgenden Tabelle ist die Löslichkeit in Gramm pro 100 ml des Komplexes in Wasser, Niederalkanolen und/oder in Aceton angegeben.

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Tabelle :

Lösungsmittel Cu-Komplex

Zn-Komplex

Hg-Komplex

dest. Wasser

Methanol

Aethanol

Isopropanol

Aceton

dest. Wasser
23°C

O⁰C

23°C

0,058 0,066

Q, 019 0,052

0,027 0,019

0,022 0,015

0,016 0,029

Fe-Komplex

0,2

0°C

0,106

0,037
0,034
0,010

0,005

23⁰C

0⁰C

0,095 —

0,035 —

0,027 --

0,001 —

0,014 --

23⁰C

0,059 0,015 0,006 0,006

Co-Komplex Ni-Komplex Cd-Komplex 0,08 0,14 0,04

Zur Herstellung der als Ausgangsmaterial verwendeten Cephalosporin C-haltigen Lösungen bedient man sich der für die Isolierung von sauren hydrophilen Naturprodukten, z.B. Antibiotika, Wuchsstoffen, Vitaminen, aus Fermentations flüssigkeiten üblichen Methoden. Als solche Methoden sind vor allern zu nennen:

1.) Adsorption bzw. Absorption, z.B. an Aktivkohlen wie "Norit"; an basischen Adsorptionsmitteln wie Aluminiumoxid; an nichtionischen Entfärbungs- und/oder Adsorptionsharzen wie "Asmit" '(Phenylendiamin-!Formaldehyd-Kondendatlonsprodukt von Imacti-Maatsch.), "Amberlite" MD-I, XAD-2, XAD-4 oder XAD-5 (Polystyrol-Polymerisate von Roehm & Haas), "Amberlite" XAD-7 oder XAD-8 (Acrylsäure-Polymerisate)j an basischen Ionenaustauschern wie .

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BAD ORIGINAL

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"Amberlite" IR-4B, (Phenol-Polyamin mit primären und sekundären Aminogruppen, schwach basisch), "Amberlite"lR-45, IRA-93 ■(Styrol-Divinylbenzol-Polymerisate mit primären, sekundären und tertiären Aminogruppen, schwach basisch), "Amberlite" XE-265 (Polyamin, schwach basisch), "Amberlite" 68(Methacrylsäure-Polymerisat schwach basisch) "Amberlite" IRA-400, IRA-401, IRA-402, IRA-410 (Styrol-Divinylbenzol-Polymerisate mit quaternären Aminogruppen, stark basisch), "Amberlite" LA-I, LA-2 oder LA-3 (flüssige sekundäre oder primäre Amine mit hohem Molekulargewicht) oder an entsprechenden Ionenaustauscherharzen anderer Firmen wie "Dowex 1 bis 4 (Dow Chemical Co.)* "De-Acidit" PF (The Permutit Co.)"lmac" A I3, A 17, A 20,

S. 5-40 (Imacti-Maatsch.);

2.) Verteilung zwischen Lösungsmitteln, z.B. zwischen Wasser und Phenol oder alkyl-substituierten Phenolen, bei saurem oder schwach basischem pH;

3·) chemische oder biologische Zerstörung von Nebenprodukten, z.B. mittels Säuren wie Schwefelsäure oder Oxalsäure oder sauren Ionenaustauschern, z.B. "Amberlite" IR-120(Styrol-Divinylbenzol-Polymerisat mit SuIfonsäuregruppen) oder mittels Enzymen, z.B. Penicillinase.

Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.

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Beispiel 1 :

. Zu 156 ml einer Lösung mit einem Gehalt von ungefähr 7,7 % an Cephalosporin und der 3 bis 4-fachen Menge an aus dem-KuIturfiltrat stammenden Verunreinigungen gibt man unter Rühren und Kühlen im Eisbad eine Lösung von 44 g kristallisiertem Zinkacetat [Zn(OOCCH^)₂.2H₃O] in 88 ml Wasser dazu, wobei das Gemisch noch klar bleibt.

Anschliessend lässt man unter starkem Rühren und weiterer Eiskühlung aus einem Tropfrichter in feinem Strahl 2β0 ml trockenes Aethanol (während 10-15 Minuten) einfliessen und impft mit einer Spur Cephalosporin C-Zinkkomplex an und rührt weiter während 1 1/4 Stunde. Dabei wird die entstehende Trübung nach ca, 1/4 Stunde sehr stark, und ein feiner, kristalliner Niederschlag beginnt sich abzuscheiden. Man trennt den Niederschlag auf der Nutsche ab, wäscht ihn mit wenig Aethanol/Wassergemisch (6:4) und dann mit 95 #igem Alkohol nach und trocknet den Rückstand im Hochvakuum. Man erhält 6,2 g nahezu reinen Cephalosporin-Zinkkomplex. UV-Spektrum :/f 262 ηιμ (ε= 7300); IR-Spektrum in Nujol,

ΓΏ3.Χ.

s. Fig.l. In der Papierelektrophorese in einem Kalium-Natriumphosphatpuffer (1/15 molar; pH 5,5,1 1/2 Stunden; 2000 Volt) wandert der Komplex als einheitlicher Substanzfleck, welcher mit UV-Spektrum oder Ninhydrin-Kollidin naehgewieasn werden kann, 10 cm

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- ίο -

gegen die Anode.

Die Ausgangslösung kann wie folgt hergestellt werden: Nach der im englischen Patent 968*324 beschriebenen Methode wird die Cephalosporin C-haltige Kulturlösung unter Zusatz eines Fil'terhilfsmittels filtriert, das Piltrat mit einem starksauren Ionenaustauscher in der Säureform auf pH gebracht und durch einen basischen Austauscher in der Acetatform laufen gelassen, um die anorganischen Anionen gegen Acetat auszutauschen, das Cephalosporin C an Amberlite IR-4B adsorbiert und mit Pyridinacetatpuffer eluiert und aus dem eingeengten Eluat das rohe Cephalosporin C mit Aceton gefällt, filtriert und getrocknet. 43·5 g der erhaltenen Fällung(Gehalt an Cephalosporin C 27,5 %) werden in 156 ml Wasser gelöst.

Beispiel 2 :

1*3 S einer Fällung von rohem Cephalosporin C (Reinheit 2$%), die nach dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren erhalten wurde, werden in 3*8 ^ml Wasser gelöst. Dazu gibt man eine Lösung von 1,1 g Zinkacetat in 2,4 ml Wasser. Dann lässt man 8,2 ml Isopropylalkohol zutropfen und rührt 5 Stunden bei 0°. Nach dem Abnutschen und Trocknen erhält man 208,5 mg eines nahezu farblosen Kristallisates.

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19281Λ2 - η -

Beispiel 3 >

h g einer Fällung von rohem Cephalosporin C

(Reinheit hO%), die nach dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren erhalten wurde, werden in 14,5 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird mit 0,6 ml Triethylamin und 1,8 g Kupferacetat hydrat in 40 ml Wasser versetzt. Die klare^ tiefdunkelgrüne Lösung wird mit kristallinem Kupferkomplex von Cephalosporin C angeimpft und über Nacht im Kühlschrank stehen gelassen. Der mikrokristalline Niederschlag wird abgenutscht und nacheinander mit je 100 ml Eiswasser, 95-proz. Alkohol und Aether gewaschen und im Vakuum getrocknet, wobei 1,298 g 88-prozentiger Cephalosporin C-Kupferkomplex erhalten werden.

UV-Absorptionsspektrum: zeigt ein Maximum bei 266-267 ηιμ (B = lO'OOO) und ein Minimum bei 232 ΐημ.

Aus dem Filtrat wird nach Zugabe von 2 Volumenteilen Alkohol noch ein Niederschlag von 0,690 g.ca. 60-prozentigem Material erhalten.

Der zum Animpfen verwendete Cephalosporin C-Kupferkomplex kann wie folgt hergestellt werden: Man löst 3^184 g 89,5 prozentiges Cephalosporin C in Form der freien Säure unter Rühren in 31*8 ml destilliertem Wasser und versetzt·die Lösung mit 1,5 ml Triäthylamin. Diese

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Lösung (pH ca. 7,5) wird sofort mit einer Lösung von 1,685 g Kupferacetat-hydrat in 73,8 ml Wasser versetzt (pH 4,8). Aus .der klaren,dunkelgrünen Lösung beginnt sich ein heller blaugrüner Niederschlag abzuscheiden. Man lässt über Nacht bei 0 stehen und filtriert das mikrokristalline Produkt ab. Es wird mit 25.ml kaltem Wasser, 2 mal mit 25 ml 95-prozentigem Aethanbl und 4 mal mit Aether gewaschen und im Vakuum getrocknet, Man erhält 3,227 g (ca. 94 % d.Th.), reinen Cephalosporin C-Kupferkomplex. -

Dieser zeigt im UV-Spektrum in 0,1-n. Natriumcarbonat = 266-267 nm (£ = II.3OO). Im IR-Spektrum in Nujol sind u.a., folgende Banden vorhanden: 29I (Schulter, w); 3*01 Cm); 5,71 (s); 6,01 (s); 6.O3 (s); 6,13 (Schulter, in); 6,51 (m); 7,85 (wm); 8,15 (m); 8,38 (w); 8,55 (w); 8,75 (w); 8,96 (w); 9,28 (wm) 9,68 (wm^, vgl. Fig. 2.

Die Elementaranalyse ergibt N = 8,5 % (ber. 8,8 %); S = 6,7 % (ber. 6,7 %)', Cu (oszillographisch) = 14,1 % (ber. 13,7 %).

Beispiel 4 :

0,50 g ca. 85-proz. Cephalosporin C-Natriumsalz-Dihydrati/ _m„_v = 260 nm, ε= 7'35O in Η,-,0) werden in 8 ml dest.

ΓΠ3.Χ · ed.

Was.ser gelöst. Die gelbe Lösung wird mit 0,27 g Nickelchlorid (wasserfrei) in 2 ml Wasser versetzt, wobei sich ihr pH-Wert

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- ι?—

von 5)5 auf 4,0 erniedrigt. Die grüne klare Lösung wird .bis zur beginnenden Trübung mit Aethanol versetzt und über Nacht im Kühlschrank aufbewahrt. Man nutscht die feinen Kristal le ab, wäscht mit Wasser, Alkohol-Wassergemisch und Alkohol und trocknet. Das blassgrüne Produkt weist in 0,01 N Essigsäure einen Extinktionskoeffizienten von 8,650 bei 26o nm auf.' [a]p° = + 82° + 1° (c = 0,996 % ) in 0,5 N NaFICO,-Lösung). Der quantitative Hydroxylamintest"ergibt einen Gehalt von 100 % IR-Spektrum in Nujol, siehe Fig. 3.

Beispiel 5 ί '

Der Kobalt-(ll)-Komplex von Cephalosporin C wird analog Beispiel 4 aus 0,50· g Cephalosporin C-Natriumsalz Dihydrat und 0,525 g Kobalt-(ll)-acetat (Tetrahydrat) unter Zusatz von 0,1 ml Eisessig hergestellt. Der mikrokristalline, rosafarbene Niederschlag wird beim Trocknen über Phosphorpentoxid blauviolett. .

Beispiel 6 :

Der schwach beige gefärbte Cadmiumkomplex von Cephalosporin C wird analog zu Beispiel 4 aus 0,50, g Cephalosporin C-Natriumsalz-Dihydrat und 0,500 g Cadmiumacetat (Di.r hydrat) unter Zusatz von 0,1 ml Eisessig hergestellt. Seine optische Drehung in 0,1 mol. Komplexonlosung (EDTA.Na2) teträgt + 79° ±1° (c = 0,958 Ji). 909851/1733

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Beispiel 7 :

Der Eisen-(II)-Komplex von Cephalosporin C wird analog zu Beispiel 4 aus 0,50 g Cephalosporin C-Natriumsalz-Dihydrat und 0,342 g Eisen-(II)-Chlorid (Dihydrat) hergestellt. Er wird in Form von graubraunen Mikrokristallen erhalten.

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Claims

1928U2 - 15 Patentansprüche :

1. Verfahren zur Isolierung von schwerlöslichen, zur weiteren Umwandlung in Cephalosporin C oder 7-ACA geeigneten schwerlöslichen Verbindungen aus bei der fermentativen*Herstellung von Cephalosporin C erhältlichen Lösungen, dadurch gekennzeichnet, dass man schwerlösliche Komplexe des Cephalosporin C mit einem Schwermetall ausfällt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man den Komplex aus verdünnter und/oder verunreinigter wässeriger Lösung ausfällt.

3· Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man den Komplex aus einer Fermentationsflüssigkeit ausfällt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man den Komplex aus Eluaten auffällt.

5. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass als Schwermetall ein zweiwertiges Schwermetall verwendet wird.

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6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5* dadurch gekennzeichnet, dass als' komplexbildendes Metall, Kupfer oder Quecksilber verwendet werden. .-

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass als komplexbildendes Metall Zink verwendet wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, dass der Komplex mittels eines wasserlöslichen Schwermetallsalzes aus wässriger Lösung ausgefällt wird.

9· Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch

gekennzeichnet, dass der Komplex in Gegenwart von mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln ausgefällt wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, dass der Komplex in Gegenwart von mit Wasser mischbaren Niederalkanolen ausgefällt wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-10, dadurch gekennzeichnet, dass der Komplex zwecks weiterer Reinigung mittels einer verdünnten Säure in Lösung gebracht und

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.- 17 -

dann durch Zufügen von Basen bis zu einem pH von höchstens 8 wieder ausgefällt wird.

12. Verfahren zur Isolierung eines Schwermetallkomplexes von Cephalosporin C wie in den Beispielen beschrieben.

15· Komplexe von Cephalosporin C mit zweiwertigen Schwermetallen.

14. Der Quecksilberkomplex von Cephalosporin C. 15· Der Kupferkomplex von Cephalosporin C. l6. Der Zinkkompiex von Cephalosporin C.

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Le e rs e i t e