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Verfahren zur Gewinnung von Tetracyclinen aus ihren Lösungen Im Patent
952632 ist ein Verfahren zur Gewinnung von Tetracyclinen aus ihren Lösungen beschrieben,
das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Tetracycline aus ihrer wäßrigen Lösung
durch Zugabe von Ferriionen und grenzflächenaktiven sauren Schwefelsäureestern oder
Sulfonsäuren in einem pH-Bereich von 1 bis 4 ausfällt, den gebildeten Niederschlag
in verdünnter Säure aufschlämmt, ihn in Gegenwart eines mit Wasser nicht mischbaren
organischen Lösungsmittels und eines Stoffes, der ein größeres Komplexbildungsvermögen
zum Ferriion aufweist als Tetracyclin, zerlegt, die organische Lösungsmittelschicht
abtrennt, das Lösungsmittel daraus abdestilliert, den Rückstand in einem niedermolekularen
aliphatischen Alkohol löst und durch Zugabe einer Mineralsäure die Tetracycline
als Salze kristallin abscheidet und gegebenenfalls durch Umkristallisieren weiterreinigt.
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Bei der Weiterbearbeitung dieses Gebiets wurde nun gefunden, daß man
besonders vorteilhaft verfahren kann, wenn man die saure, aufgeschlossene und filtrierte
Kulturlösung zunächst mit einem Anionenaustauscher behandelt und erst anschließend
die im Patent 952632 beschriebene Fällung ausführt und daraus die Tetracycline gewinnt.
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Als Anionenaustauscher eignen sich stark basische Polystyrolharze
vom Typ der quaternärenAmmoniumverbindungen (»Amberlite IR-400«), schwachbasische
Phenolformaldehyd-Polyamine (»Amberlite IR-4B«), quaternäre Ammoniumsalzverbindungen
vom Typ [R,RiR2, R,N+],A-, in denen einer der Reste R, R1, R, oder R3 vom Polystyrol
stammt, das seinerseits mit Divinylbenzol vernetzt ist (»Dowex 1« und j»Dowex2«),
ferner Polykondensate aus Phenol und Formaldehyd (»Wofatit M« und »Lewatit MN«).
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Ionenaustauscher sind schon mehrmals vorteilhaft zur Reinigung und
Anreicherung von Antibiotika aus ihren Lösungen eingesetzt worden. Man kann die
Ionenaustauscher stets für diesen Zweck verwenden, wenn das Antibiotikum basische
oder saure Eigenschaften besitzt, weil hier durch eine Änderung des pH-Werts die
Möglichkeit der Adsorption und Elution gegeben ist (vgl. britische Patentschrift
669348).
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In den USA.-Patentschriften 2538479, 2643997 und der britischen Patentschrift
638664 ist eine weitere Verwendungsmöglichkeit eines Ionenaustauschers zur Reinigung
beschrieben. Sie besteht darin, daß der Ionenaustauscher zur Neutralisation der
sauren Antibiotikalösung verwandt wird. Diese Arbeitsweise bietet den Vorteil, daß
zusätzliche Salze aus der Lösung ferngehalten werden.
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Die in der vorliegenden Patentanmeldung beschriebene Arbeitsweise
unterscheidet sich grundsätzlich von den obengenannten Anwendungsmöglichkeiten eines
Ionenaustauschers. Hier wird der Anionenaustauscher weder zur Adsorption der Tetracycline
noch zur Neutralisation einer tetracyclinhaltigen Lösung verwendet, sondern man
behandelt die sauren, tetracyclinhaltigen Kulturlösungen mit einem Anionenaustauscher,
um Störungen, die bei der Ausfällung der Tetracycline aus Fermentationslösungen
mit Ferriionen und Dodecylschwefelsäure auftreten können, zu vermeiden.
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Durch die Behandlung der sauren Kulturlösung mit dem Anionenaustauscher
werden vor allem Stoffe entfernt, die auf Zusatz von Ferriionen zur sauren, aufgeschlossenen
Kulturlösung ausfallen. Es handelt sich hierbei im besonderen um in der Kulturlösung
vorhandene Phosphationen. Sie bilden auch in saurer Lösung mit Eisen(III)-ionen
und Tetracyclin einen Niederschlag, der Phosphat-, Ferriionen und Tetracyclin enthält.
Dieser Niederschlag hat die Eigenschaft, daß er der Zerlegung mit einem Polyphosphat
widersteht, weil die Affinität des Polyphosphats zum Ferriion nicht ausreicht, um
aus dem Komplex das Ferriion herauszulösen. Zur Zerlegung des genannten Niederschlages
muß man einen stärkeren Komplexbildner, z. B. Äthylendiamintetraessigsäure, einsetzen,
was eine erhebliche Verteuerung des Verfahrens bedeutet.
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Bei Gegenwart von Phosphationen ist der Eisen- und der Dodecylsulfatverbrauch
erhöht und die Niederschlagsmenge dementsprechend größer als in phosphatfreien Kulturlösungen.
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Es war überraschend und nicht vorauszusehen, daß mit Hilfe eines so
einfachen Verfahrensschrittes, wie ihn die Behandlung der Kulturlösung mit einem
Anionenaustauscher
darstellt, die geschilderten Schwierigkeiten
so leicht zu beheben sind. _ Der Anionenaustauscher wird vor der Verwendung in die
S 04 oder Cl-Ionenform übergeführt. Dies kann mit wäßriger Säure oder einer Salzlösung,
z. B. einer wäßrigen Lösung von Natriumsulfat öder Kochsalz, erreicht werden. Anschließend
wäscht man ihn mit verdünnter, wäßriger Säure aus, bis die ablaufende Flüssigkeit
einen pH-Wert von 1 .bis 3,5 aufweist.: Nach dieser-Vorbehandlung des Anionenaustauschers
wird die saure, geklärte Kulturlösung, die einen pH-Wert von 1 bis 3,5 aufweist,
mit dem Anionenaustauscher in Berührung gebracht. Für diesen Zweck wählt man vorteilhaft
eine Ionenaustauschersäule und läßt die Kulturlösung durch diese laufen. Ein Ausrühren
der Kulturlösung reit dem Anionenaustauscher führt gleichfalls zum Ziel, bedingt
aber einen Mehreinsatz an Ionenaustauscher und eine längere Verweilzeit. Die Menge
des Anionenaustauschers ist abhängig von den auszutauschenden Begleitsubstanzen
und der Verweilzeit der Kulturlösungen mit dem Ionenaustauscher. Sie beträgt etwa
1 bis 5 0/0, bezogen auf das Volumen der Kulturlösung. Der pH-Wert der Kulturlösung
wird auf 1 bis 3,5 eingestellt. Vorzugsweise arbeitet man bei einem pH-Wert von
1,5 bis 2,5. Von den Anionenaustauschern werden unter den angeführten Arbeitsbedingungen
die Tetracycline nicht adsorbiert.
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Während des Durchlaufs der Kulturlösung wird mit einer Eisen(III)-ionenlösung
geprüft, ob die Ionenaustauschersäule richtig arbeitet. Zu diesem Zweck versetzt
man eine kleine Probe der ablaufenden Lösung mit Eisen-(III)-ionen. Man wählt auf
1 Mol Tetracyclin etwa 2 bis 3 Mol Eisen(III)-ionen. - Die Lösung nimmt sofort-
die dunkle Farbe der Eisen(III)-tetracyclinkomplexverbindung an. Bei richtiger Leistung
der Säule muß die Lösung zumindest 10 bis 15 Minuten klar bleiben, d. h., es darf
keine Trübung oder Ausflöckung auftreten. Bei Eintritt der beschriebenen Merkmale
ist die Säule erschöpft und muß regeniert werden.
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Das Regenerieren der Säule wird mit starker Schwefel-oder Salzsäure
vorgenommen. Gleichfalls verwertbar für diesen Zweck sind wäßrige Salzlösungen der
genannten Mineralsäuren, z. B. eine 10%ige Kochsalzlösung. Die benötigten Mengen
betragen etwa 5 bis 10%, bezogen auf das Volumen der durchgelaufenen Kulturlösung.
Man wäscht anschließend die Säule mit verdünnter Schwefel-oder Salzsäure nach, bis
der p11-Wert der ablaufenden Flüssigkeit einen Wert von 1 bis 3 zeigt. Nach dieser
Behandlung ist die Säule gebrauchsfertig und kann zur Klärung weiterer Kulturlösungen
eingesetzt werden.
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Beispiel 1 501 Tetracyclingärlösung werden mit 20%iger Schwefelsäure
auf einen pH-Wert von 1,5 eingestellt und 4 Stunden gerührt; hierauf wird die Lösung
unter Zusatz von 2,5 kg eines Filterhilfsmittels mittels einer Filterpresse vom
Mycel befreit. Man erhält etwa 451 klares, saures Kulturfiltrat.
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Ein Glasrohr mit einem Durchmesser von etwa 5 cm und einer Länge von
80 cm wird mit 1 kg »Aberlite IR-400 « gefüllt und der Ionenaustauscher mit 10%iger
wäßriger Schwefelsäure in die S 04 Ionenform übergeführt. Anschließend gibt man
destilliertes Wasser durch die Säule, bis das ablaufende Wasser einen pH-Wert von
1,5 bis 2 aufweist. Nach dieser Vorbehandlung ist die Säule gebrauchsfertig.
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451 aufgeschlossenes, saures Kulturfiltrat mit einem Gehalt von 1,5
g Tetracyclin je Liter Kulturlösung läßt man durch die gebrauchsfertige Anionenaustauschersäule
laufen. Die Durchlaufgeschwindigkeit wird so eingestellt, daß für die angegebene
Menge Kulturfiltrat 3 bis 5 Stunden benötigt werden. Zur Überprüfung auf richtige
Arbeit der Säule werden jeweils 10 ccm der durchlaufenden Kulturlösung entnommenundmit
0,06 ccm einer 10%igen Eisen(III)-chloridlösung versetzt.
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Die Lösung zeigt bei richtiger Arbeit der Säule die tiefe Farbe der
Eisen(III)-tetracyclinkomplexverbindung. Tritt eine Ausfällung oder Trübung nach
der Zugabe der Eisen(III)-chloridlösung ein, so ist die Säule erschöpft und muß
regeneriert werden.
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Man erhält etwa 431 klares, ausgetauschtes, saures Kulturfiltrat.
Der Tetracyclingehalt der Lösung hat sich gegenüber der Ausgangslösung nicht geändert.
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Nach dem Gebrauch wird die Säule mit 51 Wasser nachgewaschen und anschließend
mit 5 bis 8 1 10%iger Schwefelsäure behandelt. Man läßt Wasser durch die Säule laufen,
bis das ablaufende Wasser einen pH-Wert von 1 bis 2 aufweist. Nach dieser Vorbehandlung
ist die Säule für weitere Aufarbeitungen einsatzfähig.
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101 saures, mit einem Anionenaustauscher behandeltes Kulturfiltrat,
das einen Gehalt von 15 g Tetracyclin (1500 y/ccm) aufweist, wird mit 30 ccm 20%iger
Eisen-(III)-chloridlösung versetzt und gut durchgerührt. Nach 10 Minuten gießt man
unter mäßigem Rühren 360 ccm einer 5%igen Dodecylsulfatlösung in die klare, tiefgefärbte
eisenhaltige Lösung, fügt 30 g eines Filterhilfsmittels hinzu und zentrifugiert
den Niederschlag ab. Der Tetracyclingehalt der überstehenden Lösung beträgt 28 y/ccm.
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Der Niederschlag wird in 500 ccm Butanol suspendiert und durch starkes
Durchmischen in Lösung gebracht. Hierfür sind etwa 15 Minuten erforderlich. Zu der
buta-, nolischen Lösung gibt man 20 g eines Hexanatriumtetrapolyphosphats (»Polyron«),
das in 200 ccm Wasser gelöst ist. Es ist zweckmäßig, die Polyphosphatlösung vorher
mit starker Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2 einzustellen. Das kräftige Rühren
wird 2 bis 3 Stunden fortgesetzt. Das Gemisch zeigt nun eine rötlichgelbe Farbe.
Man entnimmt eine kleine Probe und prüft wie folgt auf Vollständigkeit der Zerlegung:
Die geschleuderte Probe darf nur noch einen geringen Niederschlag in der Zwischenschicht
aufweisen. Die Farbe der Zwischenschicht ist schwach grau und darf nicht schokoladenbraun
sein. Im zuletzt genannten Fall ist die Zerlegung noch nicht beendet, und das Durchmischen
muß fortgeführt werden.
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Nach Beendigung der Zerlegung trägt man 40 g Natriumsulfat in die
Lösung ein, rührt noch etwa 10 ,Minuten und trennt die Schichten mittels einer Zentrifuge.
Die Butanolphase wird aufgearbeitet und die wäßrige Phase noch einmal nach Zugabe
von 5 g des obengenannten Polyphosphates mit 500 ccm Butanol unter Rühren 1 Stunde
nachbehandelt. Die Schichten werden getrennt und die erhaltene zweite Butanolphase
zur Zerlegung eines neuen Ansatzes eingesetzt. Der pH-Wert wird während der Zerlegung
auf 2 gehalten.
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Der Butanolextrakt wird mit dem gleichen Volumen Tetrachlorkohlenstoff
versetzt, in 75 ccm 1 n- und 425 ccm n/100-Schwefelsäure eingetragen und nach der
Durchmischung werden 20 g geschmolzenes Olelyamin zugefügt. Nach guter Durchmischung
werden die Schichten getrennt und die organische Schicht mit weiteren 250 ccm n/100-Schwefelsäure
extrahiert. Die Schichtentrennung kann im Scheidetrichter oder besser mit einer
Zentrifuge ausgeführt werden. In die vereinigten, wäßrigen Schichten trägt man 1
g des Dinatriumsalzes der Äthylendiamintetraessigsäure ein und stellt unter Rühren
und Kühlen mit starker Natronlauge den p11-Wert auf 4,4 bis 4,6 ein. Nach 10stündigem
Stehen wird die auskristallisierte Tetracyclinbase abgesaugt, mit Wasser nachgewaschen
und unter vermindertem Druck bei 50°C getrocknet. Ausbeute: 13,1 g.
Das
Produkt weist einen Tetracyclingehalt von 92 bis 95 % auf.
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Beispiel 2 501 Oxytetracyclingärlösung «-erden mit 20%iger Schwefelsäure
auf einen PH-Wert von 1,5 eingestellt, 2 Stunden gerührt und die Lösung unter Zusatz
von 2 kg eines Filterhilfsmittels mittels einer Filterpresse vom Mycel befreit.
Man erhält etwa 44 bis 461 klares, saures Kulturfiltrat.
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Verwandt wird die im Beispiel l beschriebene Säule. Die Füllung wird
mit 1 kg »Lewatit MN« vorgenommen, das mit starker Salzsäure in die Cl-Ionenform
übergeführt wird. Mittels Wasser wird der PH-Wert der Säule auf 1 bis 3 eingestellt.
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Man läßt 451 aufgeschlossenes, saures Kulturfiltrat mit einem Gehalt
von 1 g Oxytetracyclin je Liter Kulturlösung durch die vorbehandelte »Lewatit-MN«-Säule
laufen, wozu etwa 3 bis 5 Stunden benötigt werden. Die Überprüfung der Säule auf
richtige Arbeit nimmt man wie im Beispiel 1 vor. Erhalten werden 441 Oxytetracyclinlösung,
deren 0xytetracyclingehalt keine meßbare Veränderung erfahren hat.
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Nach dem Gebrauch wird die Säule mit Wasser nachgewaschen. Mit 3 bis
5110%iger Kochsalzlösung, die man langsam durch die Säule laufen läßt, werden die
Trübungsstoffe von der Säule entfernt und mit verdünnter Salzsäure der pH-Wert der
Säule auf etwa 2 eingestellt.
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101 aufgeschlossenes und mit einemAnionenaustauscher wie vorstehend
behandeltes Kulturfiltrat mit einem Gehalt von 10 g Oxytetracyclin (1000 y/ccm)
werden mit 30 ccm 20%iger Eisen(III)-chloridlösung versetzt und gut durchgemischt.
Nach 10 Minuten gießt man 360 ccm 5%ige Dodecylsulfatlösung unter mäßigem Rühren
ein und schleudert nach weiteren 10 Minuten den Niederschlag ab. Die Aktivität der
Mutterlauge beträgt Der Niederschlag wird in 400 ccm Butanol suspendiert und mit
einer Auflösung von 24 g Hexanatriumtetrapolyphosphat (»Polyrom) in 200 ccm Wasser
versetzt. Durch Zugabe von 20%iger Schwefelsäure wird der pH-Wert der Lösung auf
2 eingestellt und 2 bis 3 Stunden innig durchmischt. Nach Beendigung der Zerlegung
werden 40 g Kochsalz eingetragen und die Schichten getrennt. Die wäßrige Phase wird
nochmals mit 100 ccm Butanol extrahiert und das Butanol nach dem Abtrennen mit der
Hauptmenge vereinigt. Aus den Butanolextrakten gewinnt man das Oxytetracyclin.
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Die vereinigten Butanolschichten werden im Vakuum auf 200 ccm eingeengt
(Druck: 3 bis 5 mm; Außenheizung: 40°C), und der ausgefallene Niederschlag wird
mit einer Nutsche abfiltriert. Der Niederschlag wird mit etwa 50 ccm Butanol ausgewaschen
und verworfen. Das Waschbutanol wird zur Hauptmenge gegeben und die Butanollösung
im Vakuum auf etwa 5 bis 10 ccm eingeengt. Man versetzt den dicken Sirup mit 150
ccm Methanol und tropft in die klare Lösung unter Rühren und Eiswasserkühlung 50
ccm 10n methanolische Salzsäure ein. Nach 10stündigem Stehen wird das kristalline
Oxytetracyclinhydrochlorid abgesaugt und mit wenig Isopropylalkohol und Äther ausgewaschen.
Nach der Trocknung unter vermindertem Druck bei 40 bis 50°C wiegt das Hydrochlorid
9,1 g. Der Gehalt an Oxytetracyclin beträgt 87 bis 90 0/0.