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Verfahren zur Gewinnung von Tetracyclinen aus ihren Lösungen Unter
den Antibiotika stellen dieyenigeH, die sich vom Tetracyclin der Formel
ableiten, eine (besonders wichtige Gruppe dar, die durch ihr breites Wirkungsspektrum
gekennzeichnet ist. Hierzu gehören neben dem nicht substituierten Tetracyclin das
7-Chlortetracyclin und das 5-Oxytetracyclin. Sie werden von bestimmten Streptomycesstämmen
gebildet und durch Aufarbeitung ihrer Kulturlösungen gewonnen.
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Für die Anreicherung der Tetracycline aus der Kulturlösung wurden
vor allem folgende Methoden beschrieben: r. Extraktion der Kulturlösung mittels
mit Wasser nichtmischbaren organischen Lösungsmitteln; i. Adsorption des Tetracyclins
oder seiner Substitutionsprodukte aus der Knz.lturlösung mit Adsorptionsmitteln
und anschließendes Auswaschen; 3. Ausfällung mittels Metallhydroxyden der Erdalkalien
oder mit quaternären Ammoniumbaßen, die
vor allem beim 5-Oxytetracyelin
für die technische Gewinnung besondere Bedeutung erlangt hat (R. v. Reeves : Chem.
Engineering, i952, S. 145.
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In der französischen Patentschrift 1059 513 wird ein Extraktionsverfahren
zur Gewinnung von Chlortetracyclin beschrieben. Durch Zusatz einer Trägersubstanz,
die grenzflächernaktive Eigensc'hafte'n besitzt, wird 'bei saurem pl, das Chlortetracycli,n
in die organische Schicht übergeführt. Beider Übertragung auf Gärlösungen müssen
diese vorgereinigt werden. Dies kann dadurch erfolgen, daß man das Chlortetracyclin
bei schwach alkalischem p$ zusammen mit dem Mycel ausfällt und den erhaltenen Mycelkuchen
durch Erwärmen bei saurem pH auslaugt und die wäßrige Schicht extrahiert. Der Aufwand
an organischen Lösungsmitteln ist :dabei erheblich. , Auch das Verfahren der Gewinnung
von Oxytetracyclin aus Gärlösungen mit Hilfe von Butanol wurde verlassen, ,veil
zu viele Reinigungsschritte infolge des ungünstigen Verteilungsquotienten erforderlich
waren (R. V. Reeve r s, C'hem. Engng., 1952, S.145).
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Die Gewinnung von Oxytetracyclin durch Ausfällen mit Erdalkalihydroxyden
wurde von P. P. Regna und Mitarbeitern, J. Amer. Chem. Sot., Bd.73, 1951, S.4214,
beschrieben. Der Nachteil dieses Verfahrens, besteht vor allem darin, daß der Reinheitsgrad
des Endproduktes nur etwa 65,5% beträgt.
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Die Ausfällung von Oxytetracyclin aus Fermen tationslösungen mittels
eines sauren Azofarbstoffes wird in der USA.-Patentschrift 2 649 48o beschrieben.
Bei diesem Verfahren ist vor allem die Ausfällung unvollständig und außerdem der
Reinheitsgrad des Endproduktes nur, wie im Beispiel i beschrieben, etwa 4oo/aig.
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Nach den meisten bisher :beschriebenen Verfahren ist die Aufarbeitung
und Reinigung der Tetracycline bis zu kristallinen Verbindungen umständlich und
verlustreich.
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Es wurde nun gefunden, daß man die Tetracycl.ine aus ihren Lösungen
gewinnen kann, indem man sie aus ihrer wäßrigen Lösung durch Zugabe von Fer@iionen
und grenzflächenaktiven sauren Schwefelsäureestern oder Sulfonsäuren in einem pH
Bereic'h von i Abis 4 ausfällt, den Niederschlag in verdünnter Säure suspendiert,
ihn in Gegenwart eines mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittels und
eines Stoffes, -der ein größeres Komplexbildungsvermögens zum Ferriion aufweist
als das Tetracyclin, zerlegt, das organischeLösungsmittel abdestilliert, den Rückstand
in einem niedermolekularen al:ip'hatischen Alkohol :löst, durch Zugabe einer Mineralsäure
das Tetracyclin als Salz kristallin abscheidet und es gegebenenfalls durch Umkristallisieren
weiter reinigt.
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Die Fällung der Tetracycline wird so vorgenommen, daß man zu -der
sauren wäßrigen Lösung, bei einem pg von 1 'bis q. zunächst. so viel eines Ferrisalzes,
z. B. Ferrichlorid, zusetzt, daß sich eine lösliche Eisentetracycliukoniplexverbindung
bildet (vgl. z. B. A. Albert: Nature, Bd. 172, 1953, S.2oi) und noch Eisenionen
im Überschuß vorhanden sind. Bei Kulturlösungen von z. B. i g 5-Oxytetracyclin im
Liter genügt eine Zugabe von etwa 6oo mg Ferrichlorid je Liter. Die Bildung der
Eisenkomplexverbindung erkennt man an dem Entstehen einer bestimmten rotbraunen
Färbung. Nunmehr wird die grenzflächenaktive Substanz der Lösung zugesetzt, und
es fällt ein Niederschlag aus, der aus der Tetracyclineisenkomplexverbin.dung und
dem Fällungsmittel besteht und gegebenenfalls noch beringe Mengen des Eisensalzes
.des.grenzflächenaktiven Stoffes' enthält.
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Als grenzflächenaktive Substanzen kommen saure Sch.wefelsäureester
oder Sulfonsäuren, die als Netz-, Wasch- und Emulgsermittel Verwendung finden, z.
B. primäre und sekundäre Alkylsulfate und Alky1sulfonate, Fettsäurekondensationsprodukte
mit z. B. Oxyäthansulfonsäure oder Methyltaurin oder Alkylbenzolsulfonate in Betracht.
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Der Niederschlag wird von der Lösung abfiltriert, zur Zerlegung in
Wasser suspendiert und mit einer Mineralsäure ein pH-Wert von etwa 2 eingestellt.
Dann wird in Gegenwart eines mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittels ein Komplexbildner
zugesetzt, der eine größere Verwandtschaft zum Ferriion besitzt als das Tetracyclin.
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Als .Komplexbildner eignen sich z. B. Nitriloessigsäure, Diaminoäthantetratssigsäure,
Pyrophosphorsäure oder Oxalsäure.
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Als Lösü.ngsmittel kommen die für Tetracycline üblichen organischen
Lösungsmittel in Frage, vor allem mit Wasser nicht mischbare Alkohole, z. B. Butanol.
Durch die Trägerwirkung der genannten grenzflächenaktiven Stoffe wird die Überführung
,des Tetracyclins aus der wäßrigen in die organische Lösungsmittelschicht begünstigt.
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Zur Gewinnung der kristallisierten Tetracycline wird -die organische
Lösung dann im Vakuum zur Trockne eingedampft und der Rückstand in einem niedermolekularen
aliphatischen Alkohol, z. B. Methanol, Athanol oder Propanol, gelöst und durch Zugabe
einer starken Mineralsäure, z. B. konzentrierter.Salzsäure, das Tetracyclin als
Salz kristallin ausgefällt.
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Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich unter anderem dadurch
aus, daß die Fällung des Tetracyclins sm sauren Bereich bei pu i bis q. vorgenommen
wird, während bisher in einem pH-Bereich vors 6 und höher gefällt werden mußte.
Man benötigt nur geringe Mengen von Eisensalz als Fäll:ungsmittel. Die Fällung ist
so arteigen, daß sie vorzugsweise unmittelbar in Gärlösungen durchgeführt wenden
kann.
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Der entstehende Niederschlag enthält nur wenig Verunreinigungen und
läßt sich nach üblichen Methoden leicht abtrennen. Die weitere Aufarbeitung erfordert
nur einen geringen Aufwand und führt sofort zu einem kristallisierten Produkt von
hohem Reinheitsgrad, wobei de Ausbeute, bezogen auf die Ausgangswirksamkeit der
Gärlösung, sehr hoch ist und etwa 8o % beträgt. Die für die Fällung benutzten Substanzen
sind technisch leicht zugängliche Verbindungen.
Das Verfahren läßt
sich auch mit anderen Tetracyclindernvaten wie 7-Chlortetracyclin oder 5-Oxytetracyclin,
durchführen.
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Durch die genannten Vorteile, vor allem auch die Arteigenheit der
Fällung und die allgemeine Anwendungsmöglichkeit auf alle bisher bekannten Tetracycline,
ist das Verfahren von besonderer technischer Bedeutung und den bisher bekannten
überlegen. Beispiel i i 1 vom Mycel befreite, geklärte Kulturlösung mit einem Gehalt
von i g 5-Oxyfietracyclin wird mit konzentrierter Salzsäure auf den pH-Wert von
1,5 eingestellt, dann werden 3 ccm einer 2oo/oigen Ferrichloridlösung zugegeben
und nach io Mixnuten 24 ccm einer 5o/oigen Natriulndodecylsulfatlösung unter Rühren
eingetragen. Nach 5 Minuten Stehen wird der entstandene Niederschlag abgeschleudert.
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Der a)bgeschleuderte Niederschlag wird in 5o ccm 1/2 n-Salzsäure aufgeschlämmt.
Man fügt 6 g Diami:noäthantetraessigsäure zu, stellt den p$ Wert der Lösung auf
2 ein, setzt 12,5 g Kochsalz zu und versetzt die Lösung mit 45 ccm Butanol. Die
Mischung wird gut verrührt, die Schichten werden in der Zentrifuge getrennt, ,und
die wäßrige Schicht wird mit weiteren 15 ccm Butanol ausgezogen. Die Butanolschicht
wird mit 5 ccm gesättigter wäßriger Kochsalzlösung nachgewaschen und der Butanolauszug
im Vakuum b:ei-einer 40° nicht übersteigenden Temperatur zur Trockne eingedampft.
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Der trockene Butanolrückstand wird in io ccm Methanol gelöst, und
in die methanolische Lösung. werden unter Kühlung langsam 1,5 ccm konzentrierte
Salzsäure unter Ribren eingetragen. Nach mehrstündigetn Stehen wird der entstandene
Kristallbrei von Oxytetracyclinhydrochlorid abgesaugt .und mit wenig Methanol und
Äther nachgewaschen.
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Man erhält o,95 g eines kristallinen Produktes mit .einem Gehalt von
921/9 5-Oxytetracyclinhydrochlorid. Beispiel 2 Zu 1 1 einer vom Mycel befreiten
und geklärten Kulturlösung, die einen Gehalt von i g 5-Oxytetracyclin aufweist,
gibt man nach Einstellung des pg-Wertes auf 1,5 3,8 ccm e i.ner 2Qo/oigen Ferrisulfatlösung,
läßt die Lösung io Minuten stehen, gießt unter Rühren 54 com einer 5o/aigen N-Oleyl-N-methyltauridlösung
dazu und schleudert nach 5 Minuten den Niederschlag ab.
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Der abgeschleuderte Niederschlag wird in 5o ccm i/2 n-Salzsäure aufgeschlämmt.
Man fügt 6 g Diaminoäthantetraessigsäure zu, stellt Aden pH-Wert der Lösung auf
2 ein, setzt 12,5 g Kochsalz zu und versetzt die Lösung mit 45 ccm Butanol. Nach
gutem Durchmischen werden die Schichten in der Zentrifuge getrennt, und d ie wäßrig-
Schicht wird mit weiteren 15 ccm Butanol äusgezogen. Die Butanolschicht wird .mit
5 ccm gesättigter wäßriger Kochsalzlösung nachgewaschen und der Butanolauszug im
Vakuum bei einer 40° nicht übersteigenden Temperatur zur Trockne eingedampft.
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Der trockene Butanolrückstand wird in io ccm Methanol gelöst, und
in die methanolisch.e Lösung werden unter. Kühlung langsam 1,5 ccm konzentrierte
Salzsäure unter Rühren eingetragen. Nach mehrstündigem Stehen -der Lösung wird der
entstandene Kristallbrei von 5-Oxytetracyclinhydrochlorid abgesaugt und mit wenig
Methanol `und Äther-nachgewaschen. Man erhält o,95 g kristallines 5-Oxytetracyclinhydrochlorid
(Reinheitsgrad 92 1/o,). Beispiel 3 i 1 vom Mycel befreite, geklärte Kulturlösung
mit einem Gehalt von i g 5-Oxytetracyclin wird mit konzentrierter Salzsäure auf
den pH-Wert von 1,5 eingestellt, dann werden 3 ccm einer 2oo/oigen Ferrichloridlösung
zugegeben und nach io Minuten 24 ccm einer 5o/oigen Natriumdodecylsulfatlösung unter
Rühren eingetragen. Nach 5 Minuten Stehen wird der entstandene Niederschlag a)bgeschleudert.
Der abgeschleuderbe Niederschlag wird in 5o ccm Wasser aufgeschlämmt. Man fügt 2,4
g Pyrophosphorsäure zu, stellt den pH-Wert der Lösung mit starker Natronlauge auf
2 ein, setzt 12,5 g Kochsalz zu und versetzt :die Lösung mit 45 ccm Butanol. Nach
gutem Durchmischen werden die Schichten in der Zentrifuge getrennt, und die wäßri:g:e
Schicht wird mit weiteren 15 ccm Butanol ausgezogen. Die ButanoIschicht wird mit
5 ccm gesät tigber wäßriger Kochsalzlösung nachgewaschen und der Butanolauszug im
Vakuum bei einer 40° nicht übersteigenden Temperatur zur Trockne eingedampft.
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Der trockene Butanolrückstand wird in io ccm Methanol gelöst, und
in die methanolische Lösung werden unter Kühlung langsam 1,5 ccm kornzentrierte
Salzsäure unter Rühren eingetragen. Nach mehrstündigem Stehen. der Lösung wird der
entstandene Kristallbrei von 5-Oxytetracyclinhydrorihlorid abgesaugt und mit wenig
Methanol und Äther nachgewaschen. Man erhält o,8 g kristallines 5-OxytetTacyclinhydrochlorid
(Reinheitsgrad gi,5o/o). Beispiel 4 1 1 vom Mycel befreite, geklärte Kulturlösung
mit einem Gehalt von 1 g 7=Chlortetracyclin.wird mit konzentrierter Salzsäure auf
.einen pH-Wert von 1,5 eingestellt, dann werden 3 ccm einer 2oo/oigen Forrnclüoridlösung
zugegeben und nach io Minuten 24 ccm einer 5o/oigen Natriumdodecylsulfatlösung unter
Rühren eingetragen. Nach 5 Minuten Stehen wird der entstandene Niederschlag abgeschleudert.
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Der abgeschleuderte Niederschlag wird in 50 ccm 1/2 n-Salzsäure
aufgeschlämmt. Man fügt 6 g Diaminoäthantetraessigsäure-zu. Aufschlämmungstell-t
den pH-Wert der Lösung auf 2 ein, setzt 12,5 g Kochsalz zu und versetzt die Lösung
mit 45 ccm Butanol. Die Mischung wird gut durchgerührt, die Schichten werden in
der Zentrifuge getrennt, und die wäßrige Schicht wird mit weiteren 15 ccm Butanol
ausgezogen. Die Butanolschicht wird mit 5 ccm gesättigter wäß.riger Kochsalzlösung
nachgewaschen
und der Butanolauszug im Vakuum bei einer 40° nicht
übersteigenden Temperatur zur T_ rockne eingedampft.
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Der trockene Butanolrückstand wird in io ccm Methanol gelöst, und
in die methanolische Lösung werden unter Kühlung langsam 1,5 ccm konzentrierte Salzsäure
unter Rühren eingetragen. Nach mehrstündigem Stehen wird der Kristallbrei von 7-Chlortetracyclinhydrochlori@d
abgesaugt und mit %venig Methanol und Äther nachgewaschen. Man erhält o,8 g kristallines
7-C:hlortetracyclin'hydrochlori.d (Reinheitsgrad gi °!o). Beispiel 5 1 1 vom Mycel
befreite, geklärte Kulturlösung mit einem Gehalt von i g Tetracycl,in wird mit konzentrierter
Salzsäure auf den pH-Wert von 1,5 eingestellt, dann werden 3 ccm einer 2o°/oigen
Ferrichloridlösung zugegeben ,und nach io Minuten 24 ccm einer 5°loigen Natrium-dodecylsulfatlösung
unter Rühren eingetragen. Nach 5 Minuten Stehen wird der entstandene Niederschlag
abgeschleudert.
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Der abgeschleuderte Niederschlag wird in 5o ccm 1/2 n-Salzsäure aufgeschlämmt.
Man fügt der Aufschlämmung 1,5 g Nitriloessigsäure zu, stellt den p$ Wert der Lösung
auf 2 ein, setzt 12,5 g Kochsalz zu und versetzt die Lösung mit 45 ccm Butanol.
Die Mischung wird gut durchgerührt, die Schichten werden in der Zentrifuge .getrennt,
und die wäßrige Schicht wird mit weiteren 15 ccm Butanol ausgezogen. Die Butanolschicht
wird mit 5 ccm gesättigter wäßriger Kochsalzlösung nachgewaschen und der Butanolauszug
im Vakuum bei einer 40° nicht übersteigenden Temperatur zur Trockne eingedampft.
Der trockene Butanolrückstand wird in io ccm Methanol gelöst, und in die methanolische
Lösung wenden unter Kühlung langsam 1,5 ccm konzentrierte Salzsäure unter Rühren
eingetragen. Nach mehrstündigem Stehen .der Lösung wird der entstandene Kristallbrei
von Tetracyclinhydrochlorrd abgesaugt und mit wenig Methanol und Äther nachgewaschen.
Man erhält o,8 g kristallines Tetracyclinhydrochlorid (Reinheitsgrad 89,911/o,).