DE1617795C3 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Gewinnung des antimykotisch wirkenden Antibiotikums Nystatin aus Gärflüssigkeiten, in denen es erzeugt wurde.

Die Herstellung von Nystatin auf biologischem Wege unter Verwendung von Streptomyces noursei ist in der USA.-Patentschrift 2 797 183 beschrieben.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung von Nystatin aus Gärflüssigkeiten durch Extraktion des Mycels mit Lösungsmitteln oder Lösungsmittelgemischen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man das Mycel mit einem Gemisch aus Wasser, einem niederen aliphatischen Alkohol, einer Säure und einem organischen Amin, das einen pH-Wert von etwa 6 bis 6,5 aufweist, extrahiert und aus dem erhaltenen Extrakt das Nystatin abtrennt.

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird das Mycel von der Gärflüssigkeit abgetrennt und sofern nicht ein feuchtes Mycel verwendet wird, mit einem Gemisch aus Wasser, einem niederen aliphatischen Alkohol, vorzugsweise Methanol, einer Säure, wie Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure oder Citronensäure, vorzugsweise einer Mineralsäure, wie Schwefelsäure, und einem organischen Amin behandelt. Als organisches Amin kann ein primäres Amin, z. B. ein niederes Alkylamin, wie Methylamin, ein niederes Hydroxyalkylamin, wie Äthanolamin, ein sekundäres Amin, z. B. ein Dialkylamin, wie Dimethylamin und Diäthylamin, ein niederes Di-(hydroxyalkyl)-amin, ein niederes Alkyl- niederes Hydroxyalkylamin, wie Methyläthanolamin, und vorzugsweise ein tertiäres Amin, z. B. ein Trialkylamin und insbesondere ein niederes Tri-(hydroxyalkyl)-amin verwendet werden. Die Säure und das Amin werden in solchen Mengenverhältnissen verwendet, daß die erhaltene wäßrig-alkoholische Lösung einen pH-Wert im Bereich von etwa 6 bis etwa 6,5 aufweist. Mit Hilfe dieser alkoholischen Lösung wird das Nystatin aus dem Mycel herausgelöst und aus dieser Lösung gewonnen.

Die zugegebene Menge des Alkohols ist nicht von entscheidender Bedeutung. Es sollen mindestens etwa 2,0 ml Alkohol je Gramm feuchtes Mycel verwendet werden, um eine möglichst vollständige Extraktion des Nystatins aus dem Mycel in die wäßrig-alkoholische Lösung sicherzustellen. Um große Lösungsmittelmengen nach der Extraktionsstufe nicht abtrennen zu müssen, werden in der bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens nicht mehr als etwa 2,5 ml Alkohol je Gramm Mycel verwendet.

Die Menge des zugesetzten Amins ist nicht von entscheidender Bedeutung; die bevorzugte Konzentration des Amins beträgt etwa 0,02 ml bis etwa 0,05 ml je ml Alkohol. Die verwendete Menge der Säure wird auf einen solchen Wert eingestellt, daß der vorstehend genannte, gewünschte pH-Wertbereich erhalten wird. Auch die verwendete Menge des Wassers ist nicht von entscheidender Bedeutung. Vorzugsweise werden jedoch nicht mehr als etwa 0,25 ml Wasser je ml Alkohol während der Extraktionsstufe verwendet. Der Alkohol, das Amin und die Säure werden dem

ίο Mycel zur Auflösung und Extraktion des Nystatins zugegeben. Nachdem sich das Nystatin vollständig gelöst hat, was gegebenenfalls durch Rühren oder Schütteln beschleunigt werden kann, wird das extrahierte Mycel abfiltriert oder abgeschleudert und verworfen. Um sicherzustellen, daß sämtliches Nystatin aus dem Mycel abgetrennt ist, kann das Mycel mit weiteren Mengen Alkohol gewaschen werden.

Zur Abtrennung des Nystatins wird das Filtrat, gegebenenfalls vereinigt mit Waschlösungen, eingedampft, der Rückstand wird mit Wasser und einem wassermischbaren Keton, wie Aceton versetzt. Das erhaltene Gemisch wird dann auf etwa 45 bis 55° C, vorzugsweise auf etwa 50 bis 52° C erhitzt und abkühlen gelassen. Aus der Lösung scheidet sich praktisch reines Nystatin kristallin aus und wird abfiltriert. Die Erfindung wird durch die Beispiele erläutert.

Beispiel 1
(a) Abtrennung des Mycels

Eine Nystatin enthaltende Gärflüssigkeit, die bei der Vergärung eines wäßrigen, Soyabohnenmehl-Melasse enthaltenden Nährmediums mit Streptomyces noursei erhalten wurde, wird mit 4 Gewichtsprozent Diatomeenerde als Filtrierhilfe versetzt. Das erhaltene Gemisch wird filtriert, und das Mycel wird gewonnen.

(b) Extraktion des Nystatins aus dem Mycel

Das in Stufe (a) erhaltene Mycel wird in etwa 10 Volumteilen Methanol aufgeschlämmt. Die Aufschlämmung wird mit Schwefelsäure auf pH 3 eingestellt, 7 Minuten geschüttelt, mit Triäthylamin neutralisiert und filtriert. Das Filtrat wird auf etwa V20 seines ursprünglichen Volumens eingedampft, und die erhaltene Aufschlämmung wird nach dem Verdünnen mit einem gleichen Volumen 40%igem wäßrigem Aceton bei 45°C zur Kristallisation gebracht. Die Kristalle werden abzentrifugiert, in 40%igem wäßrigem Aceton wieder auf geschlämmt, nochmals abzentrifugiert, wieder in Aceton aufgeschlämmt, erneut abzentrifugiert und getrocknet. Das erhaltene Nystatin hat eine Aktivität von etwa 4000 Einheiten/mg. Sein Aschegehalt beträgt weniger als 1%

Beispiel 2

Eine Extraktionslösung wird durch Zugabe von 2 Volumprozent Triäthylamin zu Methanol und anschließende Zugabe von 40%iger wäßriger Schwefelsäure bis zum pH-Wert 6 hergestellt. Das in Stufe (a) vom Beispiel 1 erhaltene Mycel wird dann zu der Triäthylaminsulfatlösung in Methanol gegeben, so daß die Endkonzentration an Methanol etwa 90% beträgt. Das Gemisch wird 30 Minuten kräftig geschüttelt. Danach wird der pH-Wert auf 6,8 mit Triäthylamin eingestellt und das Gemisch filtriert. Der Filterkuchen wird mit 90%igem wäßrigem Metha-

nol (10% des Extraktionsvolumens) gewaschen und dann verworfen.

Das Filtrat und die Waschlösung werden vereinigt und auf etwa V20 des Ursprungsvolumens eingedampft. Hierbei wird praktisch sämtliches Methanol entfernt. Das Konzentrat wird mit 2 Volumteilen 60%igem wäßrigem Aceton versetzt. Das Gemisch wird, je nachdem ob es sauer oder alkalisch reagiert, durch Zugabe von Triäthylamin bzw. Schwefelsäure auf pH 6,5 eingestellt, eine Stunde auf 50 bis 52° C erhitzt, innerhalb 60 bis 90 Minuten auf Raumtemperatur abkühlen gelassen und dann bei Raumtemperatur 5 bis 5 Stunden stehengelassen. Hierbei scheidet sich das Nystatin kristallin ab.

Die Kristalle werden abfiltriert, mit 5 ml 40%igem wäßrigem Aceton je Gramm feuchtes Produkt aufgeschlämmt, dann mit 10 ml Aceton je Gramm feuchtes Produkt versetzt und in üblicher Weise unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält kristallines Nystatin in einer Ausbeute von 75 bis 90%, bezogen auf die ursprünglich im Mycel vorhandene Aktivität. Das Produkt besitzt eine Aktivität von etwa 4500 Einheiten/mg und ist etwa 48 Stunden bei einer Temperatur von 100⁰C stabil.

Beispiel 3

Durch Zugabe von 4 Volumprozent Triäthanolamin zu Methanol und anschließende Zugabe von 40%iger wäßriger Schwefelsäure bis zu einem pH-Wert von etwa 6 wird eine Extraktionslösung hergestellt. Das in Stufe (a) vom Beispiel 1 erhaltene Mycel wird dann in die Lösung von Triäthanolaminsulfat in Methanol gegeben, so daß die Endkonzentration an Methanol etwa 80 Volumprozent beträgt. Das Gemisch wird dann 30 Minuten kräftig geschüttelt und anschließend filtriert. Der Filterkuchen wird mit 85%igem wäßrigem Methanol gewaschen (20% des für die Extraktion verwendeten Volumens an Methanol) und dann verworfen.

Das Filtrat und die Waschlösung werden vereinigt und auf V10 ih^fes ursprünglichen Volumens eingedampft. Das Konzentrat wird mit 3 Volumteilen 60 %igem wäßrigem Aceton versetzt und je nachdem, ob das Konzentrat alkalisch oder sauer reagiert, mit Schwefelsäure bzw. Triäthanolamin auf pH 6,5 eingestellt. Das Gemisch wird eine Stunde auf 50 bis 52° C erhitzt, innerhalb 60 bis 90 Minuten auf Raumtemperatur abkühlen gelassen und 5 bis 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das kristalline Produkt wird abfiltriert, mit 6 ml 40 %igem wäßrigem Aceton je Gramm feuchtes Produkt aufgeschlämmt, dann mit 10 ml Aceton je Gramm feuchtes Produkt versetzt und in üblicher Weise im Vakuum getrocknet. Man erhält kristallines Nystatin in Ausbeuten von 90 bis 100%, bezogen auf die ursprünglich im Mycel vorhandene Aktivität. Das Produkt hat eine Aktivität von etwa 5000 Einheiten/mg und ist mindestens 48 Stunden bei 100⁰C stabil.

Beispiel 4

Durch Zugabe von 2,5 Volumprozent Triäthylamin zum Methanol und anschließende Zugabe von fester Citronensäure bis zu einem pH-Wert von 6 wird eine Extraktionslösung hergestellt. Das in Stufe (a) vom Beispiel 1 erhaltene Mycel wird zur Triäthylamincitratlösung in Methanol gegeben, so daß die Endkonzentration an Methanol etwa 90% beträgt. Das Gemisch wird 30 Minuten kräftig geschüttelt, dann wird der pH-Wert mit Methylamin auf 6,8 eingestellt, und das Gemisch wird filtriert. Der Filterkuchen wird mit 90%igem wäßrigem Methanol (10% des Extraktionsvolumens) gewaschen und dann verworfen.

Das Filtrat und die Waschlösung werden vereinigt und auf ¹I₂₀ des ursprünglichen Volumens eingedampft, um das Methanol abzutrennen. Das Konzentrat wird mit zwei Volumteilen 60%igem wäßrigem Aceton versetzt. Je nachdem ob die Lösung sauer oder alkalisch reagiert, wird der pH-Wert mit Triäthylamin oder Citronensäure auf 6,5 eingestellt.

Die Lösung wird eine Stunde auf 50 bis 52° C erhitzt, innerhalb 60 bis 90 Minuten auf Raumtemperatur abkühlen gelassen und dann bei Raumtemperatur 5 bis 6 Stunden stehengelassen.

Da sich abscheidende kristalline Produkt wird abfiltriert, mit 40%igem wäßrigem Aceton in einer Menge von 5 ml je Gramm feuchtes Produkt aufgeschlämmt und filtriert. Das abgetrennte Produkt wird dann in Aceton in einer Konzentration von 10 ml je Gramm feuchtes Produkt aufgeschlämmt, filtriert und in üblicher Weise in Vakuum getrocknet. Nystatin wird in einer Ausbeute von 70 bis 85 %, bezogen auf die ursprünglich im Mycel vorhandene Aktivität, gewonnen. Die Aktivität des Produktes beträgt 3800 bis 4500 Einheiten/mg.

Versuchsbericht

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren läßt sich Nystatin in höheren Ausbeuten, größerer Reinheit und größerer Stabilität als nach bekannten Verfahren erhalten, wie sich aus den nachstehenden Ausführungen ergibt.

Die Beispiele 1, 4 und 6 wurden je zweimal wiederholt. Die Ausbeuten und die Aktivitäten der erhaltenen Produkte sind in Tabelle I zusammengestellt.

Tabelle I

	Beispiel	Bioaktivität (μ/mg)	Ausbeute (%)
50	IA	4780	100
	IB	4850	100
	4A	4900	98
	4B	4700	96
	6A	7450	100
55	6B	5110	100

Ein unmittelbarer Vergleich dieser Ergebnisse mit der USA.-Patentschrift 2 797183 ist nicht möglich, da in dieser Patentschrift keine Ausbeuteangaben enthalten sind. Beim Nacharbeiten des beschriebenen Verfahrens ergaben sich jedoch Ausbeuten von nur etwa 35 bis 50%, was auf Verluste bei den zahlreichen Verfahrensschritten zurückzuführen ist. Auch die Aktivitäten waren wesentlich geringer. Sie lagen unter 2000 μ/mg.

Die Stabilität des nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Produkts wurde bei verschie-

denen Temperaturen und in Abhängigkeit von der Lagerungsdauer untersucht. Wie sich aus Tabellen ergibt, sind die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Produkte bei 100⁰C wesentlich stabiler als nach bekannten Verfahren hergestellte

Produkte. Auch bei niedrigen Temperaturen und bei verschiedener Lagerungsdauer ist die Stabilität des erfindungsgemäß hergestellten Nystatins fast durchwegs besser als die der Vergleichsprodukte. Bei -2O⁰C waren alle Produkte stabil.

	Temperatur	ursprünglich	Verlust	Tabelle	Aktivität	Verlust	(%)	Verlust	(%)	Verlust	(JO
		(μ/mg)	nach 48 Std.		nach 1 Monat		nach 2 Monaten	,	nach 3 Monaten	,
Probe	(0C)	2580		s II	(μ/mg)	12	(μ/mg)	22	(μ/mg)	26
Nr.*	100	—	60			—		26		16
	60	—	—	2070	—	2030	—	1860	—
1	50	—	—	—	—	1910	—	2190	—
	-20	2530	—	2360	17	2600	16	2530	10
	100	—	49	—	—	—	22	—	28
	60	—	—	1955	—	2160	—	2280	—
2	50	—	—	—	—	2010		1830
	-20	2590	—	2350	42	2590	75	2550	**
	100		90	—			64		**
	60			1400		621			**
3	50					891
	-20	4390		2420	14	2520	5		25
	100		15		—		5		18
	60			3840	—	4050	—	3370	—
4	50	—		—	—	4070	—	3650	—
	-20	4450	—	4370	15	4280	7	4650	8
	100	—	21	_	—	—	7	—	21
	60	—	—	3540	—	3930	—	3770	—
5	50	—	—	—		3930		3230
	-20		—	4160		4240		4100

* Die Proben 1, 2 und 3 wurden nach bekannten Verfahren und die Proben 4 und 5 nach dem erfindungsgemäßen Verfahren

hergestellt.
** Dieser Versuch wurde nach 2 Monaten wegen der geringen Aktivität abgebrochen.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Gewinnung von Nystatin aus Gärflüssigkeiten durch Extraktion des Mycels mit Lösungsmitteln oder Lösungsmittelgemischen, d adurch gekennzeichnet, daß man das Mycel mit einem Gemisch aus Wasser, einem niederen aliphatischen Alkohol, einer Säure und einem organischen Amin, das einen pH-Wert von etwa 6 bis 6,5 aufweist, extrahiert und aus dem erhaltenen Extrakt das Nystatin abtrennt.