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Verfahren zur Extraktion von Tetracyclinen
Die Erfindung betrifft die Extraktion von Chlortetracyclin- und/oder Tetracyclinantibiotika aus diese Antibiotika enthaltenden Kulturbrühen.
Es ist bereits bekannt, Chlortetracyclin aus Gärmaischen durch ein Verfahren zu extrahieren, bei dem
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aktiven Mittels extrahiert wird. Das Extraktionsverfahren unter Verwendung von organischen Lösungsmitteln wurde bisher nur auf die die Antibiotika enthaltenden Filtrate und nicht auf die Kulturbrühe selbst angewendet.
Es wurde bisher nicht für möglich gehalten, das Chlortetracyclin direkt aus der Brühe zu extrahieren, da man annahm, dass die Mycelfeststoffe auf irgendeine Weise eine Bindung des Chlortetracyclins hervorrufen und so die leichte Extraktion durch ein Lösungsmittel verhindern. Aus diesem Grunde wurde bei allen bekannten Verfahren immer zuerst die Brühe filtriert und dasChlortetracyclin aus dem Filtrat extrahiert.
Dasselbe gilt auch für die Extraktion von Tetracyclin aus tetracyclinhaltigen Brühen sowie für die gemeinsame Extraktion beider Antibiotika aus der gleichen Brühe, da bekanntlich sowohl Chlortetracyclin als auch Tetracyclin bei einer S. aureofaciens-Fermentation gebildet werden.
Es wurde nun gefunden, dass es unter bestimmten Bedingungen möglich ist, Chlortetracyclin und/oder Tetracyclin direkt aus der Brühe zu extrahieren, ohne die Brühe zur Entfernung der Mycelfeststoffe vorher zu filtrieren, wie dies bisher für notwendig erachtet wurde.
Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Extraktion vonChlortetracyclin- und/oder Tetracyclin- antibiotika aus einer diese Antibiotika enthaltenden Gärbrühe, bei welchem a) die Brühe zum Löslichmachen der darin enthaltenen Antibiotika auf einen PH-Wert zwischen etwa 0, 5 und 2, 5 angesäuert wird, b) derCalcium- undMagnesiumionengehalt der Brühe auf einen Wert zwischen etwa 10 und 45 mg/g Antibiotikum in der Brühe eingestellt wird, c) der Brühe eine quaternäre Ammoniumverbindung der Formel
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zugesetzt wird, in der R einen niederen Alkylrest oder den Benzylrest, 1\ eine lange Paraffinkette und R3 und R4 niedere Alkylreste bedeuten, wobei R und R4 auch zusammen eine 2-wertige Kohlenstoffkette mit 2-5 Kohlenstoffatomen bedeuten können.
d) der pH-Wert der Brühe auf zwischen etwa 5, 5 und 11 eingestellt wird und e) ein mit Wasser nicht mischbares polares organisches Lösungsmittel zur Extraktion der Antibiotika aus der so behandelten Brühe zugesetzt wird.
Neben dem Vorteil der direkten Extraktion der Antibiotika aus der Brühe bringt die Erfindung den weiteren Vorteil mit sich, dass gegenüber der Extraktion von Chlortetracyclin und/oder Tetracyclin aus
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dem die Antibiotika enthaltendenFiltrat erhöhte Ausbeuten erhalten werden können, wobei die Steigerung 101o und mehr beträgt. Diese Ausbeutesteigerung ist zum Teil auf die Ausschaltung der Behandlung des Filterkuchen mit heisser Säure zurückzuführen, die bei den bisher bekannten Verfahren zur Entfernung der Reste von Antibiotikum aus dem Kuchen nötig war und immer eine Zerstörung der Antibiotika in gewissem Umfang herbeiführt.
Die Erfindung bringt daher nicht nur wirtschaftliche Vorteile, da dabei eine Stufe der bekannten Verfahren, die man bisher für unerlässlich gehalten hat, eingespart wird, sondern sie lässt sich gleichzeitig auch leicht durchführen und ergibt hohe Ausbeuten an reinem Material ; die Ausbeuten übertreffen sogar diejenigen, die bei der Extraktion von Chlortetracyclin oder Tetracyclin aus dem angesäuerten Filtrat gewöhnlich erhalten werden.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung liegt darin, dass man dabei nicht mit so grossen Wassermengen zu arbeiten braucht wie bei den bekannten Verfahren. Um das Maximum an Wirkstoffen in ein wässeriges Filtrat überzuführen, muss eine Wassermenge verwendet werden,. die das 2 1/2-fache des Brühvolumens beträgt und selbst dann wird eine vollständige Extraktion noch nicht erreicht. Es ist offensichtlich, dass bei Fermentationen in grosstechnischem Massstab die Gewinnung des Chlortetracyclins oder Tetracyclins aus einem derartigen wässerigen Filtrat mit einem ausserordentlichen Aufwand verbunden ist.
Ferner ist von besonderem Vorteil, dass das erfindungsgemässe Verfahren in hohen Ausbeuten zu praktisch reinem Material, nämlich zu einem Material von pharmazeutischem Reinheitsgrad, d. h. mit einer Reinheit von 95 bis 971o führt. Die höhere Reinheit kann auch auf die Behandlung mit einem Reduktionmittel zurückgeführt werden, wie dies weiter unten näher erläutert werden soll. Bei dem nach den bisher bekannten Verfahren gebildeten Chlortetracyclin und Tetracyclin sind gewöhnlich zwei Umkristallisationen aus saurem Butanol erforderlich, um das Material auf die festgelegten Reinheitswerte zu bringen.
Das nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltene reine Chlortetracyclin kann, und hierin besteht ein weiterer Vorteil der Erfindung, direkt ohne vorheriges Umkristallisieren oder Reinigen zu Tetracyclin reduziert werden.
Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens im Rahmen einer Extraktion von Chlortetracyclin aus einer Chlortetracyclin enthaltenden Brühe besteht die erste Verfahrensstufe im Ansäuern der Brühe zum Löslichmachen des darin enthaltenen Chlortetracyclins. Die Brühe wird mit einer beliebigen starken Mineralsäure, wie Salzsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure u. dgl. auf einen PH-Wert von etwa 0, 5 bis 2, 5 und vorzugsweise von 1, 3 bis 1, 4 angesäuert. Diese Behandlung mit Säure wird bei Zimmertemperatur durchgeführt. Die angesäuerte Brühe wird eine kurze Zeit zum Löslichmachen des Chlortetracyclins gerührt und dann mit einer bestimmten Menge an Oxalsäure oder Ammoniumoxalat versetzt, um den Calcium- und Magnesiumionengehalt der Brühe auf eine vorbestimmte Höhe einzustellen.
In diesem Zusammenhang sei erwähnt, dass sich gezeigt hat, dass das noch zu beschreibende Trägerextraktionsverfahren bei der Extraktion von Chlortetracyclin aus der Brühe nicht gut durchführbar ist, wenn nicht der Calcium - und Magnesiumionengehalt der Brühe auf einen bestimmten Wert sehr genau eingestellt wird. Es wurde gefunden, dass bei der Einstellung des Calcium- und Magnesiumionengehaltes der Brühe auf etwa 10-45 mg/g in der Brühe vorhandenen Chlortetracyclins eine befriedigende Extraktion der Antibiotika aus der Brühe erzielt werden kann. Wenn erheblich über oder unter diesen Grenzen liegende Mengen dieser Ionen in der Brühe zurückbleiben, erfolgt nur eine unzureichende Extraktion der Wirkstoffe.
Die Ursachen hiefür sind noch nicht vollständig geklärt, doch wurde beobachtet, dass reines Chlortetracyclin in Abwesenheit von Calciumionen nicht mit organischen Lösungsmitteln extrahiert werden kann und dass in Gegenwart einer zu grossen Menge Calciumionen in der Brühe während der Extraktion ein schwerer Niederschlag von Chlortetracyclin gebildet wird, der in dem organischen Lösungsmittel nur schwer in Lösung geht. Wenn jedoch der Magnesium- und Ca1ciumionengehalt der Brühe auf einen Wert innerhalb der oben angegebenen Grenzen eingestellt wird, verläuft die Extraktion des Chlortetracyclins durch das organische Lösungsmittel glatt und führt zu guten Ausbeuten an reinem Material.
NachBeendigung der Ausfällung der gewünschten Ionenmenge zur Einstellung des Calcium- und Magnesiumgehaltes der Brühe auf den richtigen Grad wird die so behandelte Brühe mit einer geeignetenMenge einer quaternären Ammoniumverbindung, wie im folgenden eingehender erläutert, versetzt. Die Menge an quaternärer Ammoniumverbindung kannganz allgemeinzwischen etwa 1/2Mol dieser Verbindung/Mol Chlortetracyclin bis etwa 3 Mol der quaternären Verbindung/Mol Chlortetracyclin liegen. Die Brühe wird dann gerührt und ihr pH-Wert mitNatriumhydroxyd auf etwa 5, 5-11 und vorzugsweise etwa 8, 4-8, 6 eingestellt.
Danach wird das Gemisch unter Rühren mit einem organischen Lösungsmittel in einer Menge von vorzugsweise etwa l o oder mehr des Brühvolumens versetzt. Man kann bis zu 50o und darüber an Lösungsmittel verwenden, doch wird, soweit bisher beobachtet werden konnte, mit grösseren Mengen kein besonderer Vorteil erzielt, vielmehr wird das Verfahren dann unwirtschaftlich. Das Gemisch wird gerührt
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einige der gefärbten Verunreinigungen, die nonnalerweise durch Filtrieren der angesäuerten Brühe entfernt werden, bei dem erfindungsgemässen Verfahren mitgeschleppt und verleihen dem kristallinen Produkt ein grünliches oder bräunliches Aussehen.
Dieser einzige Nachteil der direkten Extraktion der Brühe kann leicht durch Behandlung deslösungsmittelextraktes mit einem Reduktionsmittel, wie Natriumhydrosulfit, ausgeschaltet werden. Diese Behandlung wird vorzugsweise unter sauren Bedingungen durchgeführt.
Der Methylisobutylketonextrakt wird daher nach Zusatz von Wasser auf einen pH-Wert zwischen etwa 1 und 4, und vorzugsweise von etwa 1, 8 mit Hilfe von Schwefelsäure eingestellt. Dabei darf zum Ansäuern keine Säure verwendet werden, die eine vorzeitige Kristallisation des Produktes verursachen würde. Dann wird Natriumhydrosulfit in einer Menge von etwa 0, 3 bis 0, 6 g/100 ml zugesetzt. Dieser Bereich ist insofern ziemlich kritisch, als ein Überschuss unter Umständen eine Braunfärbung des Endproduktes verursachen kann. Das so behandelte Gemisch wird dann vor der weiteren Verarbeitung eine kurze Zeit lang stark gerührt.
Nach Ansäuern mit Hilfe von konzentrierter Salzsäure bis zu einem pH-Wert von etwa 0, 5 werden etwa 0, 5 gNatriumchlorid/100 ml Methylisobutylketonextrakt zugesetzt, um die Chlorionenmenge zuzuführen, die auf Grund der Tatsache, dass das vorhergehende Ansäuern mit Schwefelsäure durchgeführt wurde, noch fehlt. Das Gemisch wird dann altern gelassen und die Kristalle werden gewonnen, wie dies oben in Verbindung mit der Isolierungsstufe beschrieben wurde.
Selbstverständlich können ausser Natriumhydrosulfit bei dem erfindungsgemässen Verfahren auch andere Reduktionsmittel Verwendung finden, z. B. Schwefeldioxyd, Natriumsulfit usw.
Die im vorstehenden in Verbindung mit Chlortetracyclin enthaltenden Brühen beschriebenen Extraktions-und Isolierungsmassnahmen können praktisch ohne Abänderung auf die Gewinnung von Tetracyclin aus Tetracyclin enthaltenden Brühen sowie auf die Gewinnung beider Antibiotika aus der gleichen Brühe angewendet werden.- Die allgemeinen Extraktionsbedingungen, d. h. pH-Wert-Lösungsmittelverhältnis, Trägermengen usw. haben sich praktisch als die gleichen erwiesen, wie sie im einzelnen in Verbindung mit der Extraktion von Chlortetracyclin direkt aus der Brühe angegeben wurden.
Es wurde jedoch gefunden, dass im Gegensatz zu Chlortetracyclin, das durch direkte Extraktion der Brühe erhalten wurde und zur Erzielung eines Produktes von befriedigendem Aussehen der Behandlung mit einem Reduktionsmittel bedarf, bei Tetracyclin eine derartige Behandlung nicht erforderlich ist. Bei der Extraktion von Tetracyclin direkt aus der Brühe wird, wenn sie unter den oben beschriebenen bevorzugten Arbeitsbedingungen durchgeführt wird, im allgemeinen ein Produkt von befriedigendem Aussehen bereits ohne Behandlung mit einem Reduktionsmittel erhalten. Dies ist insbesondere dann der Fall, wenn die Brühe kurz nach der Beendigung der Fermentation verarbeitet wird und nicht vor der Extraktion bereits längere Zeit gestanden hat.
Tetracyclin kann aus dem Lösungsmittelextrakt durch direktes Ansäuern zur Gewinnung von Tetracyclinhydrochlorid in praktisch der gleichen Art und Weise, wie sie in Verbindung mit dem bevorzugten Verfahren zur Gewinnung von Chlortetracyclin aus dem Lösungsmittelextrakt beschrieben wurde, isoliert werden. Ausserdem kann man das Tetracyclin als freie Base isolieren, indem man den Methylalkylketonextrakt von Tetracyclin mit angesäuertem Wasser bei einem pH-Wert im Bereich von 1, 5 bis 2, 0 in Berührung bringt, die gebildete, das Tetracyclin enthaltende wässerige Phase von der Lösungsmittelschicht abtrennt, den pH-Wert der wässerigen Phase auf einen Wert zwischen 2 und 4 einstellt und das neutrale Tetracyclin durch Kristallisation aus der wässerigen Phase gewinnt. Dieses Verfahren ist zur Erzielung von Produkten mit guten Farbwerten besonders geeignet.
Bei einem weiteren Verfahren zur Isolierung von Tetracyclin aus dem Lösungsmittelextrakt, das im Rahmen der vorliegenden Erfindung mit Vorteil angewandt werden kann, wird der Lösungsmittelextrakt mit wässerigem Harnstoff in Berührung gebracht und das Tetracyclin als eine Tetracyclinharnstoffverbindung abgetrennt, aus der das reine Tetracyclin leicht freigesetzt werden kann. Dieses an anderer Stelle eingehender beschriebene Verfahren ist zur Isolierung von Tetracyclin aus dem Lösungsmittelextrakt sehr geeignet.
Die bei den vorstehend beschriebenen IsolierungsverfahrenerhaltenenAntibiotikumkristalle weisen gewöhnlich einen Gehalt von 97 bis 1000/0 an reinem neutralem Tetracyclin auf und können durch ein einfaches einstufiges Verfahren, bei dem das neutrale Tetracyclin in Butanol, 2-Äthoxyäthanol und Salzsäure aufgeschlämmt wird, weiter gereinigt und in Tetracyclinhydrochlorid übergeführt werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.
Beispiel l : Direkte Extraktion von Chlortetracyclin aus der Brühe.
3 kg Chlortetracyclinbrühe mit einem Wirkstoffgehalt von 5800 y/ml werden durch Zugabe von SSiger Schwefelsäure auf pH 1, 4 eingestellt. Nach 30minütigem Rühren werden 75 g Ammoniumoxalatmonohydrat zugegeben. Das Gemisch wird 45 Minuten gerührt, hierauf mit 54 ml Arquad-16 in Form
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einer 50% gen Lösung in Isopropanol versetzt und der PH-Wert mit 25goriger Natronlauge auf 8,5 eingestellt. Dann wird die Brühe unter 20minütigem starkem Rühren mit 600 ml Methylisobutylketon extrahiert.
Nach Zugabe von 120 g Filterhilfe (Hyflo) wird das Gemisch filtriert. Das Filtrat wird 3 Stunden stehengelassen, wonach die Lösungsmittelschicht abgetrennt wird. Der Filterkuchen wird erneut in 450 ml Methylisobutylketon aufgeschlämmt, abfiltriert und mit 50 ml Methylisobutylketon gewaschen. Die ver- einigtenLösungsmittelextrakte ergeben insgesamt ein Volumen von 980 ml mit einem Wirkstoffgehalt von 16000 y/ml, entsprechend einer Ausbeute von 90, 2go.
Beispiel 2 : Gewinnung von Chlortetracyclinhydrochlorid. Zu 654 ml des wie in Beispiel 1 beschrieben hergestelltenMethylisobutylketonextraktes mit einem Wirkstoffgehalt von 16000y/ml gibt man 65 ml Wasser und stellt den pH-Wert durch Zugabe von 8 ml konzentrierter Salzsäure auf 0, 5 ein. Das Gemisch wird 17 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt, wonach die gebildeten Kristalle abfiltriert, mit jeweils 15 ml Wasser, 2-Äthoxyäthanol und Isopropanol gewaschen und 16 Stunden bei 40 im Vakuum getrocknet werden. Man erhält eine Ausbeute von 9, 74 g Chlortetracyclinhydrochlorid mit einem Wirkstoffgehalt von 987 y/mg, was einer Gesamtausbeute von 82ego, bezogen auf die Brühe, entspricht. Das
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elm"= 0, 13.Beispiel 3 : Behandlung mit einem Reduktionsmittel.
Zu 100 ml des nach Beispiel 1 erhaltenen Methylisobutylketonextraktes mit einem Wirkstoffgehalt von 17800 y/ml gibt man 15 ml Wasser und stellt den pH-Wert mit 25"/oiger Schwefelsäure auf l, 8 ein. Das Gemisch wird mit 0, 3g Natriumhydrosulfit versetzt und 10 Minuten kräftig gerührt, wonach der pH-Wert mit konzentrierter Salzsäure auf 0,5 gebracht wird. Um weitere Chlorionen zuzuführen, versetzt man mit 0, 5 g Natriumchlorid. Das Gemisch wird 20 Stunden gerührt, abfiltriert, mit Wasser, 2-Äthoxyäthanol und Isopropanol gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhält eine Ausbeute von 1,68 g Chlortetracyclinhydrochlorid mit einem Wirkstoffgehalt von 973'Y/mg, was einer Ausbeute von 9'l !/0 in dieser Stufe entspricht.
Das hellgelb aussehende
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EBeispiel 4: Direkte Extraktion von Tetracyclin aus der Kulturbrühe. 2 1 Tetracyclinbrühe mit einem Wirkstoffgehalt von 6200 y/ml werden mit 40 g Oxalsäure versetzt, wodurch ein pH-Wert von 1,5 erreicht wird, und das Gemisch wird 30 Minuten gerührt. Berechnet unter Zugrundelegung des Wirkstoffgehaltes der Brühe werden 24 ml (1 Äquivalent) Arquad 16 in Form einer 50% gen Lösung in Isopropanol zugesetzt. Nach 15minütigem Rühren gibt man 400 ml Methylisobutylketon zu und stellt den pH-Wert mit Natriumhydroxyd auf 9,5 ein. Das Gemisch wird 20 Minuten kräftig gerührt und nach Zugabe von 80 g Filterhilfe (Hyflo) filtriert. Der Lösungsmittelextrakt wird anschliessend von der verbrauchten wässerigen Schicht abgetrennt.
Der Filterkuchen wird erneut in dieser verbrauchten wässerigen Schicht aufgeschlämmt und die Aufschlämmung mit 200 ml frischem Methylisobutylketon versetzt. Nach 30minütigem Rühren wird das Gemisch filtriert und der Extrakt abgetrennt. Die vereinigten Extrakte, die insgesamt 575 ml aus-
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haltenen Methylisobutylketonextraktes werden mit 272 ml Wasser, das vorher mit Natriumhydroxyd auf einen pH'Wert von 9,5 eingestellt wurde, durch 20minütiges Rühren und Abtrennen gewaschen. Der gewaschene Extrakt, 520 ml, weist einen Wirkstoffgehalt von 19450 y/ml auf, was einer Stufenausbeute von 98, 3je entspricht.
Beispiel 6 : Rückextraktion des gewaschenen Lösungsmittelextraktes mit Wasser. Man versetzt 500 ml des nach Beispiel 5 erhaltenen Methylisobutylketonextraktes mit 1500 ml Wasser und stellt den pH-Wert durch Zugabe von Schwefelsäure auf 1, 2 ein. Nach 30minütigem Rühren werden die Phasen getrennt. Der so erhaltene 165 ml ausmachende wässerige Extrakt weist einen Wirkstoffgehalt von 56000 y/ml auf, was einer Stufenausbeute von 951o entspricht.
Beispiel7 :GewinnungvonneutralemTetracyclin.145mldesnachBeispiel6erhaltenenwässerigen Extraktes werden stufenweise durch Zusatz von neiger Natronlauge auf einen PH-Wert von 1, 6, 2, 0, 2, 6, 3, 0 und schliesslich 3, 6 eingestellt, wobei das Gemisch in jeder Stufe 15-20 Minuten gerührt wird. Nach 16stündiger Alterung unter Rühren bei pH 3, 6 und Zimmertemperatur wird das kristalline Produkt abfiltriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum bei 400 getrocknet. Man erhält so eine Ausbeute von 7, 4 g neutralem Tetracyclin mit einem Wirkstoffgehalt von 1003 y/mg, entsprechend einer Stufenausbeute von 92, 1'%. Das so gewonnene Produkt weist ein hellgelbes Aussehen auf.
Beispiel 8 : Direkte Extraktion von Chlortetracyclin aus der Kulturbrühe. 1500 ml Chlortetra- cyclinbrühe mit einem Wirkstoffgehalt von 6600 y/ml werden mit 25%iger Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 1, 5 eingestellt. Nach Zugabe von 36 g Ammoniumoxalat wird das Gemisch 45 Minuten gerührt und dann mit 26 ml Onamin-RO versetzt. Man gibt 600 ml Methylisobutylketon zu und stellt den
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PH-Wert mit ZS iger Natronlauge auf 8.5 ein. Nach 20minütigem Rühren und Zugabe von 45 g Filterhilfe (Hyflo) wird das Gemisch filtriert. Man lässt das Filtrat absitzen und trennt die Lösungsmittelschicht ab.
Der Filterkuchen wird mit 300 ml Methylisobutylketon aufgeschlämmt und filtriert. Die Filtrate werden vereinigt und die Lösungsmittelextrakte von der wässerigen Phase abgetrennt, wobei man ein Gesamtvolumen von 780 ml mit einem Wirkstoffgehalt von 10250 y/ml erhält, was einer Ausbeute von 77,8% entspricht.
Beispiel 9 : Gewinnung von Chlortetracyclinhydrochlorid. Zu dem nach Beispiel 8 erhaltenen Methylisobutylketonextrakt gibt man 100 ml Wasser und stellt den PH-Wert mit konzentrierter Salzsäure auf
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9 ein. Das GemischPATENTANSPRÜCHE :
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Verfahren zur Extraktion von Chlortetracyclin und/oder Tetracyclin unter Verwendung quaternärer Ammoniumverbindungen, Einstellen des PH-Wertes und selektiver Lösung in einem organischen Lösungsmittel, dadurch gekennzeichnet, dass man a) die diese Antibiotika enthaltende Kulturbrühe direkt auf einen PH-Wert zwischen etwa 0,5 und 2,5, insbesondere auf 1, 3-1, 4 einstellt, um die Antibiotika löslich zu machen, u. zw.
vorzugsweise durch Ansäuern mittels starker Mineralsäuren bei Zimmertemperatur, b) den Calcium- und Magnesiumgehalt der Brühe, vorzugsweise durch Zugabe von Oxalationen, auf etwa 10 - 45 mg/g Antibiotikum in der Brühe einstellt, c) der so behandelten Brühe eine quaternäre Ammoniumverbindung der Formel
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Kohlenstoffatomen bedeuten können, d) den pH-Wert der Brühe auf etwa 5, 5-11, insbesondere auf 8, 4-8, 6, einstellt, und e) zur Extraktion der Antibiotika aus der so behandelten Brühe ein mit Wasser nicht mischbares polares organisches Lösungsmittel zugibt.