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Verfahren zur Gewinnung von Tetracyclin aus angesäuerten
Gärbrühen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Tetracyclin aus angesäuerten Gärbrühen, die Tetracyclin zusammen mit Nebenprodukten enthalten.
Bei der Entwicklung technisch brauchbarer Verfahren zur Abtrennung von Tetracyclin aus der Gär- brühe treten erfahrungsgemäss beträchtliche Schwierigkeiten auf. Trotz der ähnlichen Struktur von Chlortetracyclin und Tetracyclin lassen sich die bekannten Verfahren, die bei der Reinigung von Chlortetracyclin zufriedenstellende Ergebnisse liefern, nicht ohne weiteres für die Reinigung von Tetracyclin verwenden. So liefert z.
B. das Verfahren zur Gewinnung von Chlortetracyclin nach der USA-Patentschrift Nr. 2, 655, 535, welches in einer Extraktion des Chlortetracyclins aus der Gärbrühe mit n-Butanol bei einem pH-Wert von etwa 1, 3, einer Konzentrierung des Butanolextraktes und der Gewinnung des Chlortetracyclins aus diesem Extrakt als Säuresalz besteht, bei der Anwendung auf Tetracyclin nur sehr geringe Ausbeuten in der Grössenordnung von 2cp/o eines Produktes geringer Qualität. Dies ist offenbar darauf zurückzuführen, dass bei der Gewinnung des Tetracyclins aus dem sauren Butanolextrakt ein starker Abbau des Tetracyclins und die Bildung stark gefärbter Verunreinigungen erfolgen, die zusammen mit dem Tetracyclin anfallen. Aus diesem Grunde kann dieses Verfahren zur Reinigung von Tetracyclin nicht angewendet werden.
Beim Verfahren nach der vorliegenden Erfindung gelingt es, diese Nachteile zu beheben, indem man zunächst die Calciumionenkonzentration durch Zusatz von löslichen Oxalaten weitge-
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Mengen von ungefähr 1/2 bis 3 Mol je Mol Tetracyclin zusetzt, den pH-Wert der Lösung auf ungefähr 8 - 12 einstellt, sodann das Tetracyclin mit einem mit Wasser nicht mischbaren, organischen Lösungsmittel, insbesondere einem niedrigmolekularen, aliphatischen Alkohol, wie Butanol oder einem Keton, wie Methylisobutylketon extrahiert und aus der organischen Phase Tetracyclin isoliert.
Man erhält auf diese Weise hohe Ausbeuten an reinem Tetracyclin.
Das erfindungsgemässe Verfahren wird vorzugsweise so durchgeführt, dass man zunächst die Gärbrühe mit einer starken Mineralsäure, z. B. Salzsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure auf einen pH-Wert zwischen 0,5 und 3,0, vorzugsweise zwischen etwa 1 und 2, einstellt, um das gesamte Tetracyclin in Lösung zu bringen und dann zur Abtrennung des in Lösung gegangenen Tetracyclins filtriert. Da ein beträchtlicher Anteil der wirksamen Substanz im Filterkuchen zurückbleibt, wird dieser mit angesäuertem Wasser bei einem pH-Wert von etwa 2,0 extrahiert.
Die erhaltenen Filtrate werden vereinigt und weiterverarbeitet, wobeidieCaleiumionenkonzentration entweder bereits in der vorhergehenden Stufe oder nunmehr im Filtrat durch Zusatz von Oxalsäure oder Ammonoxalat weitgehend vermindert werden muss, um die Bildung eines schweren Niederschlages von Tetracyclin während der Extraktionsstufe, der sich in dem Lösungsmittel nicht leicht löst, zu vermeiden. Anderseits kann reines Tetracyclin nicht mit dem organischen Lösungsmittel extrahiert werden, wenn keine Calciumionen zugegen sind. Offensichtlich wird aus Calciumionen, Tetracyclin und quaternärer Ammoniumverbindung ein Komplex gebildet, der bei der Extraktion leicht in die Lösungsmittelphase geht.
Es wurde nun gefunden, dass die Löslichkeitsverhältnisse für Calciumoxalat unter den Verfahrensbedingungen offenbar so liegen, dass in der Lösung eine zur Bil-
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dung des in dem organischen Lösungsmittel löslichen Komplexes ausreichende Calciummenge verbleibt und dass eine erheblich bessere Extraktion erzielt wird, als dies bei der vollständigen Entfernung des Calciums der Fall wäre.
Das vom Calciumüberschuss befreite saure Filtrat wird dann mit einer geeigneten Menge, zweckmä- ssig 1/2-3 Mol je Mol Tetracyclin, einer quaternären Ammoniumverbindung, d. h. eines Alkyltrimethylammonium- oder eines Dialkyldimethylammoniumhalogenids der vorgenannten Zusammensetzung und einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, wie n-Butanol oder vorzugsweise Methylisobutylketon, vermischt und der PH- Wert des Filtrats durch Zugabe von Natronlauge auf den pH-Bereich von 8 bis 12, vorzugsweise 9 bis 10, eingestellt.
Das Tetracyclin tritt aus der wässerigen Phase in die Lösungsmittelphase über. Die Verteilung des Tetracyclins liegt stark auf der Seite des organischen Lösungsmittels, so dass im Verhältnis zum Volumen der wässerigen Lösung nur ein kleines Volumen des Lösungsmittels zur vollständigen Überführung ausreicht.
Im allgemeinen hat es sich gezeigt, dass eine etwa 5 bis etwa 501o betragende Menge an organischem Lösungsmittel mit gutem Erfolg verwendet werden kann. Vorzugsweise werden etwa 10 bis etwa 20% verwendet, doch ergibt sich die obere Grenze lediglich aus wirtschaftlichen Überlegungen. Die das Tetracyclin enthaltende Lösungsmittelphase wird dann in üblicher Weise von der wässerigen Phase abgetrennt, die die Verunreinigungen enthält.
Bei der Extraktionsstufe können verschiedene organische Lösungsmittel verwendet werden. Zu den bevorzugten Lösungsmitteln gehören u. a. die mit Wasser nicht mischbaren niedermolekularen aliphatischen Alkohole, wie Butanol, Amylalkohol u. dgl., doch können auch Lösungsmittel wie Chloroform verwendet werden. Gewöhnlich sind die bevorzugten organischen Lösungsmittel polar und mit Wasser nicht mischbar. Methylisobutylketon ist besonders bevorzugt, da es sich als ausserordentlich selektives Lösungsmittel für Tetracyclin erwiesen hat.
Es wurde ferner gefunden, dass die unter der Handelsbezeichnung"Arquad"bekannten quaternären Ammoniumverbindungen (Alkyltrimethylammonium- oder Dialkyldimethylammoniumchloride, die durch
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stens 8 Kohlenstoffatomen und R'eine Alkylgruppe mit 2 - 20 Kohlenstoffatomen bedeuten, dargestellt werden können, Fa. Amour and Company) besonders wirksame Trägermittel für das hier beschriebene Lösungsmittelextraktionsverfahren darstellen. Im folgenden werden einige Beispiele der im Handel erhältlichen Präparate, die bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens mit Vorteil angewendet werden können, tabellarisch aufgeführt.
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<tb>
<tb>
ARQUADS <SEP> *'"Mittlere <SEP> Zusammensetzung <SEP> der <SEP> aktiven <SEP> Bestandteile
<tb> Substituent <SEP> Kohlenstoff- <SEP> Arquad <SEP> Arquad <SEP> Arquad <SEP> Arquad <SEP> Arquad <SEP> Arquad
<tb> kettenlänge <SEP> 12 <SEP> 16 <SEP> 18 <SEP> c <SEP> S <SEP> 2C <SEP> 2HT
<tb> Octyl <SEP> 8---8%-8%
<tb> Decyl <SEP> 10---9%-9%
<tb> Dodecyl <SEP> 12 <SEP> 90% <SEP> - <SEP> - <SEP> 47% <SEP> - <SEP> 47%
<tb> Tetradecyl <SEP> 14 <SEP> 9% <SEP> - <SEP> - <SEP> 18% <SEP> - <SEP> 18%
<tb> Hexadecyl <SEP> 16 <SEP> - <SEP> 90% <SEP> 6% <SEP> 8% <SEP> 10% <SEP> 8% <SEP> 30%
<tb> Octadecyl <SEP> 18 <SEP> - <SEP> 6% <SEP> 93% <SEP> 5% <SEP> 10% <SEP> 10% <SEP> 70%
<tb> Octadecenyl <SEP> 18 <SEP> 1r1/0 <SEP> 41o <SEP> 10/0 <SEP> 5% <SEP> 35%
<tb> Octadecadienyl <SEP> 18----45%
<tb>
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Die Verbindungen Arquad 2C und 2HT sind Dialkyldimethylammoniumchloride,
alle übrigen sind Al- kyltrimethylammoniumchloride.
Das bevorzugt verwendete Präparat, mit dem die besten Ergebnisse erzielt wurden, ist Arquad 16, das ein Monoalkyltrimethylammoniumchlorid sein soll, bei dem sich die Alkylgruppen. aus 90% Hexadecyl, 61o Octadecyl und 4% Octadecenyl zusammensetzen. Aus noch ungeklärten Gründen scheint die vorgenannte quaternäre Ammoniumverbindung bei der Reinigung von Tetracyclin ganz besonders selektiv zu wirken.
Das beschriebene Trägerextraktionsverfahren führt zu einer ausgezeichneten Abtrennung von Tetracyclin aus der Gärbrühe. Es ist nicht völlig sichergestellt, jedoch sehr wahrscheinlich, dass das Tetracyclin in der Lösungsmittelphase wirklich als Calcium-Tetracyclin-Arquad-Komplexverbindung vorliegt,
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da wie bereits erwähnt, eine bestimmte Calciumionenmenge erforderlich ist, damit die Extraktion erfolgt, wobei die Wirkung des Arquads in der noch nicht geklärten Bindung des Tetracyclins besteht, durch die der Übertritt aus der wässerigen in die Lösungsmittelphase erleichtert wird.
Aus dem Lösungsmittelextrakt kann Tetracyclin auf verschiedene Weise, z. B. durch Zugabe eines niedermolekularen aliphatischen Alkohols, wie Propanol- (2), Butanol u. dgl. oder eines Glykoläthers z. B. 2-Äthoxyäthanol, und anschliessendes Ansäuern mit Salzsäure als Hydrochlorid gewonnen werden.
Neutrales Tetracyclin kann. man direkt aus dem Lösungsmittelextrakt durch Zugabe von Wasser in Mengen von ungefähr 5 bis 50% des Losungsmittelvolumens und Einstellen des PH-Wertes auf 3 - 7 iso- lieren.
Eine besonders bevorzugte Arbeitsweise zur Isolierung von Tetracyclin aus dem organischen Lösung- mittelextrakt besteht inder auch an anderer Stelle beschriebenen Abscheidung als Tetracyclin-Harnstoffverbindung. Zu diesem Zweck wird der Tetracyclin enthaltende Lösungsmittelextrakt mit wässeriger Harnstofflösung versetzt, das Gemisch gerührt und durch Zusatz von Säure auf einen PH Bereich zwischen 2, 5 und 6, 0 eingestellt. Tetracyclin fällt als Harnstoffverbindung aus und kann dann in verschiedener an sich bekannter Weise zu Tetracyclin weiterverarbeitet werden.
Das bei dem im vorstehenden beschriebenen Isolierungsverfahren erhaltene kristalline Tetracyclin besitzt gewöhnlich eine Reinheit von 97 bis 1001o, (bezogen auf Tetracyclinbase) und kann in üblicher Weise In Tetracyclinhydrochlorid von hoher Reinheit übergeführt werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung :
Beispiel 1 : 21 einer Tetracyclin enthaltenden Gärbrühe mit einer biologischen Aktivität von 5100 y/ml werden mit 25% figer Schwefelsäure auf PH 1, 8 angesäuert, 40 Minuten gerührt und mittels 200 g Hyflosupercel (Kieselgur) abfiltriert. Die festen Bestandteile werden in 1, 5 1 Wasser von 450 auf-
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triert. Die vereinigten Filtrate werden mit 88,2 g Ammoniumoxalat versetzt, 30 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt, 2 Stunden bei 40 stehengelassen, der Niederschlag abfiltriert und mit 50 ml Wasser nachgewaschen. Die so erhaltenen 2, 97 1 wässerigen Extrakte werden mit 300 ml Methylisobutylketon und 15 ml 50% igem Cetyltrimethylammoniumchlorid (Arquad 16) versetzt, worauf das Gemisch mittels 23 ml In-Natronlauge auf PH 8, 8 eingestellt wird.
Nach 20minütigem Rühren werden die beiden Phasen getrennt. Die wässerige Phase wird mit 100 ml Methylisobutylketon, 5 ml 50% igem Cetylttimethylammo- niumchlorid versetzt und auf PH 8, 8 mit 2 ml ln-Natronlauge eingestellt. Das Gemisch wird 20 Minuten gerührt, getrennt und die wässerige Phase nochmals mit weiteren 100 ml des gleichen Lösungsmittels extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte werden mit 40 ml Wasser geschüttelt, das Waschwasser abgetrennt und verworfen und abermals mit 40 ml Wasser gewaschen, wobei vor dem Trennen mit Natronlauge auf pH =11, 5 eingestellt wird.
Die gewaschene Methylisobutylketonlösung wird mit 125 ml Wasser, das mit 5 ml konzentrierter Salzsäure auf PH =1, 6 eingestellt ist, extrahiert und die Extraktion mehrmals mit jeweils 55 ml angesäuertem Wasser vom PH = 1, 6 wiederholt. Die vereinigten wässerigen Extrakte werden zweimal mit 20 ml Chloroform ausgeschüttelt, mit 3,5 ml Butanol versetzt und das Gemisch mit 10 g 80% gem Versene (Äthylendiamintetraessigsaures Natrium Fa. Bersworth, Framingham U. S. A.) auf PH = 5, 8 eingestellt. Nach 6stündigem Stehen bei Zimmertemperatur und weiterem 16stündigem Stehen bei 40 wird das ausgefällte Tetracyclin abfiltriert, zweimal mit 9 ml 5% piger Versenelösung, die mit Salzsäure auf pH 5, 8 eingestellt ist, und zweimal mit 5 ml Wasser gewaschen und im Vakuum bei 40 getrocknet.
Man erhielt eine Ausbeute von 6,55 g Tetracyclinbase mit einer Aktivität von 1032 y/mg.
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eingestellt, 30 Minuten gerührt und 30 Minuten absetzen gelassen. Danach wird die Lösungsmittelphase abdekantiert, filtriert und mit 201o ihres Volumens an Wasser bei PH 10 gewaschen. Nach Abtrennung des Wassers bleiben 32 I Extrakt zurück. Je 11 des Extraktes werden 300 ml 2-Äthoxyäthanol und zur Einstellung auf pH = 1, 8 145 ml konzentrierte Salzsäure zugesetzt, worauf 48 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt wird. Die abgeschiedenen Tetracyclinhydrochloridkristalle werden abfiltriert, mit 0, 5% (Vol/Vol) frischem Lösungsmittel der gleichen Zusammensetzung wie die Mutterlage, dann mit 60 ml Propanol- (2) und schliesslich mit 60 ml Äther gewaschen.
Das Produkt wird 4 Stunden bei 500 im Vakuum getrocknet ; man erhält 30, 9 g rohes Tetracyclinhydrochlorid mit einer biologischen Aktivität von 904 y/mg, was
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