-
Verfahren zur Herstellung kristalliner Ammoniumsalze der Penicilline
Es ist bekannt, daB Kulturen gewisser Schimmelpilze von der Art des Penicillium
notatum und Penicillium chrysogenum einen Wirkstoff enthalten, der das Wachstum
pathogener Organismen unterdrückt. Dieser Wirkstoff ist allgemein als Penicillin
bekannt, und seine Isolierung aus dem Kulturmittel mit nachfolgender Reinigung und
chemischen Untersuchungen haben gezeigt, daß das Penicillin keine einheitliche chemische
Substanz ist. Zur Zeit sind vier verschiedene chemische Körper isoliert worden,
die als Penicillin F, G, X und K bezeichnet werden.
-
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von kristallinen
Ammoniumsalzen der genannten Penicilline. Bei der Gewinnung der Penicilline aus
den Kulturmitteln, in denen sie gebildet werden, und beim Reinigen der auf diese
Weise erhaltenen rohen Penicilline wird von ihren gewöhnlichen chemischen und physikalischen
Eigenschaften Gebrauch gemacht. Die freien Penicilline sind organische Säuren, die
unlöslich in Wasser und löslich in einer Anzahl organischer Lösungsmittel sind.
Sie sind fähig, Salze zu bilden, die löslich in Wasser, aber unlöslich in organischen
Lösungsmitteln sind. Demzufolge kann das Penicillin, das als Salz in dem Kulturmittel
enthalten ist, durch Ansäuern und Extraktion mit organischen Lösungsmitteln sowie
nachfolgender Neutralisation gewonnen werden. Dieses Verfahren kann wiederholt werden,
um die
Reinheit der Penicillinzubereitungen@zu verbessern. In gewissen
Fällen kann die Reinigung durch Behandeln der wäßrigen Penicillinsalzlösungen oder
der organischen Lösungen der freien Säuren mit Kohle o. dgl. unterstützt werden.
Die sich ergebende wäßrige Lösung der Penicillinsalze, gewöhnlich der Natriumsalze,
wird dann einer Gefriertrocknung unterworfen. Derartige Produkte zeigen im allgemeinen
eine Wirksamkeit von 5oo bis iooo Einheiten pro Milligramm, aber sie enthalten noch
eine Anzahl von Verureinigungen, die bei dem therapeutischen Gebrauch der Produkte
zu beachten sind.
-
Diese Verunreinigungen können teilweise dadurch entfernt werden, daß
die Penicillinsalze in Form von kristallinen Ammoniumsalzen zur Abscheidung gebracht
werden. Das folgende Verfahren ist hierfür vorgeschlagen worden.
-
Die wäßrige Lösung der Penicillinsalve wird angesäuert und mit Chloroform
extrahiert. Die abgetrennte wäßrige Lösung wird nochmals mit Chloroform extrahiert
und im Vakuum konzentriert. Trockenes Benzol wird zu der Chloroformlösung ,hinzugefügt
und trockenes gasförmiges Ammoniak einige Minuten durch die Lösung hindurchgeschickt,
wodurch ein Niederschlag der Ammoniu.msalze der Penicilline in Form von Kristallen
bewirkt wird. Die Kristalle werden dann mit Petroläther gewaschen, abgetrennt und
getrocknet. Die auf diese Weise erhaltenen Kristalle enthalten noch gewisse Verunreinigungen,
welche die Kristalle färben.
-
Es ist vorzugsweise Gegenstand der vorliegenden Erfindung, höhere
Ausbeuten an Ammoniumpenicillinsalzkristallen zu erhalten, die einen höheren Reinheitsgrad
aufweisen.
-
Bei der Herstellung kristalliner Amtnoniumpenicillinsalze wird von
den Grundsätzen des bekannten Verfahrens der Herstellung kristalliner Ammoniumsalze
Gebrauch gemacht, wie es oben geschildert wurde. Das Verfahren gemäß der Erfindung
unterscheidet sich aber von diesem dadurch, daß die Ausfällung der Ammoniumsalze
in einem organischen Lösungsmittel durchgeführt wird, das mit Wasser mischbar ist.
Hierfür sind die mit Wasser mischbaren Ketone vorzugsweise zu verwenden, und von
diesen Ketonen ergibt Aceton die besten Resultate. Bei der Verwendung von Aceton
ergeben sich Kristalle von großer Reinheit, und die Ausbeuten wachsen ebenfalls
im Vergleich zu denjenigen an, die sich bei der Anwendung der %-on anderen Autoren
vorgeschlagenen :Methoden ergeben.. Es können jedoch auch andere Ketone, wie z.
B. Butanon, Anwendung finden.
-
Beispiele für andere mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel
sind aliphatische Alkohole, wie Äthanol, Propanol und Butanol, die ebenfalls bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren Anwendung finden können.
-
Verschiedene Fermentationsmet'hoden sind für die Herstellung von rohen
Lösungen der Penicilline in der zur Verfügung stehenden Literatur beschrieben worden,
und durch sorgfältige Auswahl der Schimmelpilzstämme, durch den Gebrauch geeigneter
Kulturlösungen und durch günstige Arbeitsbedingungen sind Werte erhalten worden,
die bis zu 8oo Einheiten pro Milliliter gehen.
-
Nach der Fermentation und Filtration zum Entfernen der Mycelmasse
wird die filtrierte Penicillinlösung einer Vorkonzentration und einer Vorreinigung
in der üblichen Art und Weise durch abwechselndes Eintragen der Penicilline in ein
organisches Lösungsmittel und in eine verdünnte wäßrige alkalische Lösung oder Suspension
unterworfen, oder es findet ein Absorptionsmittel Anwendung, aus dem die Penicilline
nacheinander extrahiert werden. Kombinationen dieser beiden Konzentrierungs- und
Reinigungsmethoden, können ebenfalls verwendet werden. Auf diese Weise wird eine
rohe wäßrige Lösung der Salze der Penicilline erhalten, die im Mittel ungefähr iooo
Einheiten pro Milligramm im Festen enthält. Solch eine Lösung wird vorzugsweise
als Ausgangsmaterial für die Herstellung der kristallinen Ammoniumpenicillinsalze
verwendet.
-
Die rohe und gekühlte Penicillinlösung wird erst mit einem organischen
Lösungsmittel, wie Chloroform, unter gleichzeitiger Ansäuerung geschüttelt, um die
Penicillinsäuren in Freiheit zu setzen. Dies geschieht vorzugsweise bei einer Wasserstoffionenkonzentration
von ungefähr a. Die Chloroformfraktion enthält nun alle Penicilline, ausgenommen
von etwas Penicillin 1. Sie wird dann durch ein wasserabsorbierendes Mittel filtriert,
um etwa emulgiertes Wasser zu entfernen und anschließend mit einem wasserfreien
organischen Lösungsmittel gemischt, das mit Wasser mischbar .ist. Dies geschieht
vorzugsweise in einem Betrag von l"/2 seines Volumens. Gasförmiges Ammoniak wird
unter Schütteln durch die Lösung geleitet, bis die Wasserstoff-ionenkonzentration,
gemessen mit einer Glaselektrode, ungefähr 5 bis 9 erreicht. Der vorzugsweise verwendete
pH-Wert, innerhalb der angegebenen Grenzen, hängt von der Menge und der Art der
Verunreinigungen der rohen Lösung ab. Wenn verhältnismäßig unreine Lösungen verwendet
werden, wird der p11-Wert auf ungefähr 7 eingestellt, weil bei diesem Wert sich
Kristalle von größerer Reinheit ergeben, als es bei Verwendung eines .höheren pH-Wertes
der Fall ist. Schon eine vorhergehende Neutralisation bewirkt eine Kristallisation
der freien Penicillinsäure als Ammoniumsalz. Die Salze «-erden in Ausbeuten von
8o bis iooo/o erhalten.
-
Obgleich die so erhaltenen Ammoniumsalzkristalle weniger Verunreinigungen
enthalten, als die bisher hergestellten, sind sie im allgemeinen noch schwachgelb.
-
Gemäß der Erfindung können jedoch diese letzten Spuren von Verunreinigungen
leicht durch Umkristallisation aus einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel
entfernt werden. Als solche können beispielsweise aliphatische Ketone, wie z. B.
Aceton oder Butanon, oder ein mit Wasser mischbarer aliphatischer Alkohol, wie z.
B. Äthanol, Propanol und Butanol, oder :Mischungen dieser Lösungsmittel verwendet
werden.
Zu diesem Zweck werden die Kristalle der Ammoniumsalze in
einer Mischung eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels und Wasser
gelöst, wobei vorzugsweise i/2 Gewichtsteil Wasser und ein bis 2 Gewichtsteile des
organischen Lösungsmittels. bezogen auf das Gewicht der Kristalle, verwendet werden,
während die Lösung einer leichten Erwärmung unterworfen wird. Dann wird zusätzlich
noch das mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel zugegeben, um eine Konzentration
desselben von ungefähr go% zu erzielen. Dies bewirkt die Umkristallisation, und
nach einer Kühlung unter o° C werden farblose Ammoniumsalzkristalle niedergeschlagen.
Nach dem Verdampfen des organischen Lösungsmittels kann die ?Mutterlauge durch die
obenerwähnte Arbeitsweise auf reine Kristalle aufgearbeitet werden.
-
Die folgenden Beispiele zeigen im einzelnen vorzugsweise Anwendungen
des Verfahrens gemäß der Erfindung.
-
Beispiel i iooo ml einer rohen Lösung von Penicillin= salzen, die
eine Aktivität von ungefähr 130000
Einheiten pro Milliliter und eine Reinheit
von ungefähr iooo Einheiten pro Milligramm des Festen aufweisen und die ein p" von
6,5 besitzt, wird mit 5oo ml Chloroform unter Zugabe von .2n-Schwefelsäure bis zu
einem PH von 2 geschüttelt. Die Chloroformfraktion wird abgetrennt, emulgiertes
Wasser wird mit 5o bis ioog wasserfreiem Natriumsulfat entfernt und die Fraktion
filtriert. 825 ml Aceton wird zur filtrierten Lösung zugegeben, und durch diese
wird gasförmiges Ammoniak hindurchgeleitet, bis ein PH von 7,8 erreicht ist. Die
kristallisierten Ammoniumsalze der Penicilline werden auf einem Saugfilter abgetrennt,
mit Aceton und Äther gewaschen und getrocknet.
-
Die Ausbeute beträgt 73 g entsprechend 93,7%, und die Kristalle zeigen
eineAktivität von ungefähr 165o Einheiten pro Milligramm.
-
Beispiele 739 kristallinenAmmoniumsalze des Penicillins, die
entsprechend dem Beispiel i hergestellt sind, werden in i io ml Aceton und 36,5
ml Wasser ,gelöst, während die Lösung auf ungefähr 5o° C erhitzt wird. Zur Lösung
werden 220 ml Aceton zugefügt, worauf die Ammoniumsalze unmittelbar in großen Nadeln
zu kristallisieren beginnen. Das Kristallisationsgemisch verfestigt sich zu einem
festen Kristallkuchen, der 24 Stunden auf -io' C gehalten wird. Die Kristalle werden
abgenutscht und zunächst mit. 5o ml Aceton (95%) bei - io° C, dann mit 200 ml Aceton
und endlich mit Äther gewaschen und getrocknet.
-
Die Ausbeute beträgt 54,6 g entsprechend 74,8%, und die farblosen
Kristalle zeigen eine Wirksamkeit von 17oo Einheiten pro Milligramm.
-
Das Aceton wird aus der Mutterlauge verdampft, die bei der Abtrennung
der umkristallisierten Kristalle anfällt, und der erhaltene Rest wird wiederum der
Umkristallisation in der oben beschriebenen Art und Weise unterworfen. Diese Umkristallisation
ergibt eine zusätzliche Ausbeute an Kristallen, die sich auf ungefähr 7 g beläuft.
-
Die gemäß der Erfindung hergestellten Ammoniumsalze werden vorzugsweise
als Zwischenprodukt für die Herstellung für die Alkalimetallsalze verwendet.