DE830995C - Verfahren zur Trennung von Penicillinsalzen - Google Patents

Description

• Verfahren zur Trennung von Penicillinsalzen 1)ie Erfindung bezieht sich auf die Trennung von Penicillinsalzen und hat ein neues und verbessertes Verfahren für diesen Zweck zum Gegenstand. Es ist ferner Gegenstand der Erfindung, hochaktive Penicillinzubereitungen zu erzeugen, die reich an Penicillin G sind. Weiterhin ist es Gegenstand der Erfindung, das Penicillin G vom Penicillin F und K zu trennen.
• Der weitere Inhalt der Erfindung und deren Vorteile gehen aus der folgenden Beschreibung hervor, in welcher im einzelnen erklärt ist, worin die neuen und erfinderischen Merkmale des Verfahrens bestehen und wie dieses Verfahren in die Praxis umgesetzt werden kann.
• Es ist bekannt, -daß Kulturen gewisser Schimmelpilze von der Art des Penicillium notattim und Penicillium chrysogenum einen Wirkstoff enthalten, der das Wachstum pathogener Organismen unterdrückt. Dieser Wirkstoff ist im allgemeinen als Penicillin bekannt, und seine Abtrennung aus dem Kulturmittel mit der nachfolgenden Reinigung sowie chemische Untersuchungen haben ergeben, daß das Penicillin kein einheitlicher chemischer Stoff ist. Zur Zeit sind vier verschiedene chemische Substanzen festgestellt worden, nämlich Penicillin F, G, R und K.
• Bei der Gewinnung dieser Penicilline aus dem Kulturmittel, in dem sie gebildet werden, und bei der Reinigung der so gewonnenen rohen Penicilline wird von ihren gewöhnlichen chemischen und physikalischen Eigenschaften Gebrauch gemacht. Die freien Penicilline sind organische Säuren, die in Wasser unlöslich, jedoch in einer Anzahl von organischen Lösungsmitteln löslich sind. Sie haben die Fähigkeit, Salze zu bilden, die wasserlöslich, aber unlöslich in organischen Lösungsmitteln sind. Dementsprechend können die Penicilline, die als Salze in den Kulturmitteln enthalten sind, durch Ansäuern und Extraktion mit organischen Lösungsmitteln und nachfolgender Neutralisation -gewonnen werden. Dieses Verfahren kann wiederholt werden, um die Reinheit der Penicillinzubereitungen zu verbessern. In einigen Fällen wird die Reinigung auch durch ein Behandeln der wässerigen Penicillinsalzlösungen oder organischen Lösungen der freien Säuren mit Holzkohle o. dgl. unterstützt. Die erhaltene wässerige Lösung der Penicillinsalze, im allgemeinen der Natriumsalze, wird dann einer Gefriertrocknung unterworfen. Derartige Produkte weisen im allgemeinen eine Stärke von 5oo bis iooo Einheiten pro Milligramm auf, aber sie enthalten noch eine Anzahl von Verunreinigungen, die ;ich beim therapeutischen Gebrauch der Produkte störend bemerkbar machen.
• Diese Verunreinigungen können teilweise dadurch beseitigt werden, (laß man die Penicillinsalze in Form von kristallinen Ammoniumsalzen niederschlägt. Die Ammoniumsalze können dadurch gebildet werden, daß ein Strom von trockenem Amnioniakgas durch eine Lösung der freien Penicilliiisäui-eti'in einer Mischung von Chloroform und Benzol hindurchgeleitet wird.
• Das Ergebnis der obenerwähnten Reinigungsprozesse ist ein Gemisch der Salze der verschiedenen Penicilline. Werden organische Lösungsmittel, wie z. B. Chloroform, für die Extraktion der freien Penicilline verwendet, so enthält das Gemisch der kristallisierten Salze nicht das Salz des Penicillin \, weil das letztere nicht in Lösungsinitteln, wieChloroforin, löslich ist. Deshalb besteht (las Gemisch gewöhnlich aus den Salzen des Penicillin F. G und K.
• In letzter Zeit haben alle Untersucher danach getrachtet, eine Penicillinzubereitung zu gewinnen, @lie reich an Penicillin G ist, weil dieses spezifische Penicillin eines der wirksamsten für viele Zwecke ist. Obgleich der Gehalt an Penicillin G (fier Salzmischung durch gewisse Kulturmittel, durch spezifische Schimmelpilzrassen und durch günstige Wachstumsbedingungen angereichert werden kann, enthält die kristallische Salzmischung immer beinerkenswerte Anteile von Penicillin F und K, die für viele Zwecke unerwünscht sind.
• Die vorliegende Erfindung beruht auf der Beobachtung, daß die Löslichkeit der Alkalimetallsalze der Penicilline, insbesondere der Natriumsalze, wesentlich in organischen Lösungsmitteln differiert, die finit Wasser mischbar sind. Während die Natrium- und Kaliumsalze der Penicilline alle löslich in den genannten Lösungsmitteln in Gegenwart einer gewissen Menge Wasser sind, nimmt die Löslichkeit der genannten Salze des Penicillin G stark ab, wenn der Wassergehalt unter einen bestimmten Wert sinkt.
• Das Verfahren entsprechend der Erfindung besteht in der Zufügung eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels zu einer Lösung der Gemische der Alkalisalze der Penicillinsäuren. Dieser Zusatz erfolgt in einem Betrag, der genügt, um einen Niederschlag von Kristallen zu bewirken, die vorzugsweise aus den Alkalimetallsalzen des Penicillin G bestehen, während der Hauptanteil der _1lkalimetallsalze der anderen 1'enicillinsäuren dabei in Lösung bleibt.
• Das Verfahren sei im Hinblick auf die Verwendung von Aceton als eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels beschrieben. Die \N atriumsalze von Penicillin F, G und K sind alle in Aceton löslich, das über io°/o Wasser enthält. Wenn das Aceton 9% Wasser enthält, werden wenig Kristalle nach 24 Stunden gebildet und mit dem Abnehmen des Gehalts an Wasser wächst der Betrag des kristallischen \ iederschlages. Unter .31/o Wasser ergibt sich eine sehr gute Ausbeute an Kristallen, und es wurde gefunden, daß die niedergeschlagenen Kristalle vorzugsweise aus den \ atriunisalzen von Penicillin G bestehen. Ähnliche, jedoch nicht ganz. so günstige Resultate werden mit den Kalitinisalzen der Penicilline erzielt.
• Naturgemäß hängt die Löslichkeit von der Reinheit der Alkalimetallsalze a1), und die besten Ergebnisse werden mit den reinsten Salzen erhalten. Wird die Wirksamkeit der Alkalisalzpräparate als 'Maß für die Reinheit genommen, so ergeben Präparate, die eine Aktivität unter ungefähr 5oo Einheiten pro Milligrainin aufweisen, normalerweise keine Resultate, die für praktische Zwecke geeignet sind. In der Weise jedoch, in der die Resultate mit einem Anwachsen der Reinheit der Salzmischung verbessert werden, wie es vorzugsweise durch eine intensivere Reinigung der Salzmischung erzielt wird, werden Aktivitäten weit über 5oo Einheiten pro Milligramm erzielt, wenn (las Gemisch einer fraktionierten Kristallisation gemäß der Erfindung unterworfen wird. In der vorzugsweisen Anwendung der Erfindung bei Verwendung einer Mischung von .\Ikalimetallsalzen der Penicilline ergibt sich eine. Aktivität über iooo Einheiten pro Milligramm, vorzugsweise über i6oo bis 1700 Einheiten pro 'Milligramm.
• Bei Verwendung einer einzigen fraktionierten Kristallisation in organischen Lösungsmitteln, die mit Wasser mischbar sind, ergibt sich gewöhnlich, daß in den Kristalleu der Alkalisalze des Penicillin G eine bestimmte Menge von Alkalisalzen der anderen Penicilline enthalten ist, die während der Kristallisation eingeschlossen wurden. Diese letzteren Salze können jedoch durch wiederholte Fraktionierung entfernt werden. Werden die Natriumsalze verwendet, so, genügt häufig für praktische Zwecke eine einzige Fraktionierung, wenn eine Salzmischung verwendet wird, die eine Aktivität von ungefähr i joo Einheiten pro Milligramm, auf die Trockensubstanz berechnet, verwendet wird, und wenn Aceton als Fraktionierungsmittel Anwendung findet. Werden Kaliumsalze verwendet, so sind normalerweise zwei oller mehrere Fraktionierungen erforderlich und selbst dann sind die Ergebnisse nicht so erfolgversprechend.
• 11s ein geeignetes organisches Lösungsmittel, das mit Wasser mischbar ist, sei für den Zweck der Fraktioilierung gemäß der Erfindung Aceton erwähnt, aber Versuche haben ergeben, dal auch andere aliphatische Ketone, wie z. B. Butanon, ge-Ilraticht werden können. Obgleich aliphatische Ketone und vorzugsweise Aceton gemäß der Erfindung verwendet werden, so ist diese jedoch nicht auf den Gebrauch dieser Ketone beschränkt. Alle Ketone, die mit Wasser mischbar sind, die als Lösungsmittel für die Alkalisalze der Penicilline in Gegenwart des bestimmten Betrages von Wasser wirken, fällen das :\lkalisalz des Penicillin G bei einer entsprechenden Verminderung des Wassergehaltes aus und bewirken so die Fraktionierung. :\ndere Ketone, wie sie dem Fachmann bekannt sind, können gemäß der Erfindung ebenfalls Verwendung finden, wenn das verwendete Keton die erforderlichen Eigenschaften besitzt.
• I?s sei erwähnt, daß sich für den Zweck der Ertindung andere organische Lösungsmittel, die mit Wasser misclil>ar sind, verwenden lassen. Von diesen sei beispielsweise auf die aliphatischen :1lkoluile verwiesen. Propatiol und Butanol sind l@eispic-le für geeignete aliphatische Alkohole, welche dieselbe fraktionierende Wirkung wie die Ketone zeigen.
• .\tidererseits ist gefunden worden, das Äthylalkohol unter normalen Verhältnissen keine zufriedenstellen(leit Resultate ergibt.
• Die genaue Konzentration des mit Wasser mischl)aren organischen Lösungsmittels, welche die Fraktionierung bewirkt, hängt von der Natur des gew@ililten L<isungsmittels ab und kann durch I?xileritilettte bestimmt werden. In der vorausgehenden Beschreibung sind die Verhältnisse in bezug auf Aceton angegeben. Wenn Aceton zu einer \@-ässerigen Lösung der Natriumsalze der Penicilline zugegeben wird, um eine Konzentration derselben voll ungefähr 97% zu erzielen, so enthalten die niedergeschlagenen Kristalle 98% Penicillili (3, was eine genügende Fraktionierung für die Praxis darstellt. Durch wiederholte Fraktionierungen können jedoch Kristalle erzielt werden, die annähernd ioo% Penicillin G enthalten.
• Gemäß der Erfindung wird vorzugsweise eine gesättigte Lösung der _\lkalimetallsalze für die Fraktionierung verwendet. Es werden auch dann gute Resultate erzielt, wenn in einer solchen gesättigten Lösung Salze verschiedener Herkunft verwendet werden, wenn die Lösung aus den entsprechenden :\mmoniumsalzen hergestellt ist.
• Die folgenden Beispiele zeigen die Gewinnung von gesättigten l.ösiiiigen Gier Natrium:alze der 1'eilicillinsätlren au: den entsprechenden .\mmonittnisalzeii. lieisi) iel t j4.fi g kristallisierte .\innloniumllenicillinsalze, die eine Aktivität von 1700 internationalen Einheiten pro llilligramin zeigen. werden in iio ml Wasser gelöst und auf .3'C gekühlt. Die resultierende Lösung wird mit i to ml i>eroxydfreiem .'Wier unter Zufiigull<- voll 90 ml 2n-Schwefelsäure geschüttelt. Die Ätherfraktion wird abgetrennt und das emulgierte Wasser mit 25 g wasserfreiem Natriumsulfat entfernt. Nach dem Filtrieren wird die klare Lösung mit einer Lösung von 13,6 g Natriumbikarbonat in 1614 ml Wasser gemischt. Der Äther wird durch leichtes Erwärmen und Schütteln verdampft. Während des Erwärmens entweicht auch der Hauptanteil des frei werdenden Kohlendioxyds. Der Rest des Kohlendioxyds wird im Vakuum entfernt.
• Auf diese Weise wird eine gesättigte Lösung der Natriumsalze der Penicilline erhalten. In dieser Lösung beträgt der Gehalt an Penicillin G ungefähr 840/0 'der aktiven Wirkstoffe, während die verbleibenden 16% durch die Penicilline F und K gebildet werden. Beispiel e io g kristallisierte Ammoniumpenicillinsalze, die eine Aktivität von 1700 internationalen Einheiten pro Milligramm haben, werden in 20 ml Wasser gelöst. Nach dem Zufügen von 20 m1 peroxydfreietn Äther wird die Lösung auf 5° abgekühlt und unter Schütteln ;7 ml 2 n-Schwefelsäure zugefügt. Die Ätherfraktion wird abgetrennt und das emulgierte Wasser durch wasserfreies Natriumsulfat entzogen. Nach dem Filtrieren und Waschen mit io ml Äther wird die klare Lösung mit einer Lösung von 2,52 g Natriumbicarbonat in 3 ml Wasser gemischt. Der Äther wird durch leichtes Erhitzen und Schütteln verdampft. Das verbleibende Kohlendioxyd wird im Vakuum entfernt.
• In der sich ergebenden gesättigten wässerigen Lösung der Natriumsalze der Penicilline beträgt der _ltiteil an Penicillin G ungefähr 72% der wirksamen Bestandteile, während die verbleihenden 28% durch die Penicilline I# und K gebildet werden.
• Die folgenden Beispiele zeigen die Fraktionierung gemäß der Erfindung, wenn gesättigte Lösungen von Natriumpenicillinsalzen verwendet werden. die entsprechend den Beispielen i und 2 dargestellt sind. Beispiel 3 Zu der gesättigten Lösung der Natriumsalze der Penicilline, die nach dem Beispiel i dargestellt sind, werden ioo ml wasserfreien Acetons zugefügt, und die Lösung wird durch Filtrieren in einem Seitz-Filter sterilisiert. Unter fortlaufenden aseptischen Bedienungen werden 2170 ml vom wasserfreien Aceton zugegeben, und die Mischung wird 24 Stunden stehengelassen. Die ausgefallenen Kristalle werden auf einem Saugfilter abgeschieden, mit wasserfreiem Aceton gewaschen und getrocknet. Die Ausbeute beläuft sich auf 449, elltsprechend 1;0.50/0, und die Kristalle zeigen eine Wirksamkeit von ungefähr 165o Einheiten pro Milligramm und enthalten ungefähr 98% Penicillin G. , Die Mutterlauge wird in eine gesättigte wässerige 1'enicillinlösung verwandelt und 300 ml Aceton und 1200 1111 Amylacetat werden zugefügt, wodurch Kristallisation erfolgt. Die Kristalle werden durch Filtration abgetrennt und zunächst mit einer Mischung von Aceton und Amclacetat und dann mit Äther gewaschen und schließlich getrocknet. 1)1e Ausbeute beträgt 8,3 g mit einem Gehalt von ungefähr 85% der Penicilline F und K, w;iltren(l die restlichen t 5 % Penicillin G sind.
• t)tirch Wiederholung der Fraktionierung können liristalle erhalten werden. welche die Penicilline F und K und keinen bemerkenswerten :\ttteil ain Penicillin G mehr enthalten. Beispiel Zur gesättigten Lösung der Natriumsalze der Penicilline, die entsprechend dem Beispiel 2 hergestellt sind, «-erden 25 ml Butanon unter Schütteln zugefügt. Nach der Filtration werden weitere 275 ml Butanon zugesetzt und die Mischung 24 Stunden stehengelassen, die abgeschiedenen Kristalle durch Saugfiltration abgetrennt und mit ßutanon gewaschen und getrocknet.
• Die Ausbeute beläuft sich auf 4,o g. Die Kristalle zeigen eine Wirksamkeit von ungefähr 165o Einheiten pro Milligramm und enthalten 93% Penicillin G.
• Die N atriumsalze der Penicilline F und K können aus der Z-lutterlauge in der gleichen Weise gewonnen werden, wie es im Beispiel 3 beschrieben ist. Bei spiel5 Zur gesättigten Lösung der Natriumsalze der Penicilline, die entsprechend dem Beispiel e hergestellt ist, werden 25 tnl von n-Butanol unter Schütteln zugesetzt. Naclh dem Filtrieren werden weitere 275 ml von n-Butanol zugefügt und die Mischung 24 Stunden stehengelassen. Die gebildeten Kristalle werden auf einem Saugfilter abgetrennt und mit n-Butanol gewaschen und getrocknet.
• Die Ausbeute beläuft sich auf 4,4 g. Die Kristalle zeigen eine Aktivität von ungefähr 165o Einheiten pro Milligramm und enthalten go% Penicillin G.
• Die Natriumsalze der Penicilline F und K können aus der Mutterlauge in der gleichen Weise gewonnen werden, wie es im Beispiel 3 beschrieben ist.
• 1)i1: gesättigte wässerige .Lösung der entsprechenden Kaliumsalzc ist ebenfalls der Fraktionierung unter .\nwettdung von Aceton als Fraktionierungsinittel unterworfen worden, aber die Ergebnisse sind nicht so gut wie diejenigen, die mit den \atriumsalzen erhalten werden. Wenn Ammoniumsalzkristalle für die Herstellung der gesättigten wässerigen Lösung der Kaliumsalze Verwendung finden, ergibt sich ein Gehalt von Penicillin G von ungefähr 34%. Eine Fraktionierung läßt den Gehalt an Penicillin G auf 6201n anwachsen. und eine zweite Fraktionierung bringt ihn auf 770/0. Es werden jedoch ähnliche Resultate wie mit den ,Natriumsalzen erhalten, wenn die Fraktionierung mehrmals wiederholt wird.

Claims (1)

1. PA"i!:\'I'.t@@l;;i 1'.I1!:: i. Verfahren zum Trennen der Penicillitisalze durch Kristallisation. dadurch gekennzeichnet, daß zu einer Löstiiig eifies Gemisches der _\Ikalimetallsalze der Penicillinsäuren ein organisches Lösungsmittel, das finit \\ asser mischbar ist. in eilten Betrag zugesetzt wird. der genügt, um die .Misscheidung von Kristallen zu bewirken, die vorzugsweise aus den Alkali- inetallsalzen des I'eiiicillin (; bestehen, wäh- rend der Hauptatitc#il der Alkalimetallsalze der anderen Penicillinsäuren in Lösung bleibt. 2. Verfahren nach Anspruch r, dadurch ge- kennzeichnet. daß eine Lösung der Alkalimetall- salze der Penicillinsäuren Verwendung findet, die eine Aktivität über ;oo internationale Einheiten pro \I illigrainiii im Festest, vorzugs- weise Tiber iooo internationale Einheiten pro Milligramm iiti Festen, enthält. 3. Verfahren nach Anspruch i oder 2, ge- kennzeichnet durch, die Verwendung eines aliphatischen Ketons, das mit Wasser mischbar ist, wie z. B. Aceton oder Butanon, oder Mischungen derselben als organisches 1_nsutigs- mittel, das mit Wasser mischbar ist. Verfahren nach Anspruch i oder 2, ge- kennzeichnet durch die Verwendung eines aliphatischen Alkohols, der mit Wasser misch- bar ist, wie z. 13. Propanol oder Butanol, oder Mischungen tierselben als organisches Lösungs- mittel, das mit Wasser mischbar ist. . Verfahren nach einem der :#,nsprüche i 1>1s 4. dadurch gekennzeichnet, daß das mit #,\'asser mischbare organische Lösungsmittel in einem Betrag zugesetzt wird, der genügt, um eine Konzentration von ungefähr go%, ins- besondere von c9,5o/o. zu liefern. fi. Verfahren nach einem Gier Atispriiche i bis 5. gekennzeichnet durch die Verwendung einer gesättigten Lösung einer Mischung der Alkalimetallsalze der 1'enicillinsäuren. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche i bis 6, gekennzeichnet durch die Verwendung einer '\lischtiit,' der \atritiinsalze der Peni- cillinsäuren. B. Verfahren nach eiiient der .\itspriiche i bis 7, dadurch gekennzeichnet, <laß die Frak- tionierung so lange %\-icdei-hoilt wird. 1>1s die niedergeschlagenen 1\1-istalle @inesi Gehalt von mindestens <5% a11 1'eiiicillitl G aufweisen. c). Verfahren nach eiitein der Ansprüche i bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß eine ge- sättigte Lösung d"i- Alkalinietallsalze Verwen- dung findet. die aus den entsprechenden kristal- linen :\inmonitinisalzen hergestellt ist. to. \-erfahren nach einem der _\itsprüche i 1>1s 9, dadurch gekennzeichnet. dali die Alkali- salze der Penicillins'iuren. -die in Lösung bleiben, mit Hilfe vom mit \\ asser nicht misch- baren organischen I_ösun(sinitteln, wie Amy1- acetat, ausgefällt Nverden. .