DE545267C

DE545267C - Verfahren zur getrennten Gewinnung der in der Nebennierenrinde enthaltenen Hormone

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Publication number: DE545267C
Application number: DE1930545267D
Authority: DE
Original assignee: Labopharma Dr Laboschin G M B
Current assignee: Labopharma Dr Laboschin G M B
Priority date: 1930-08-07
Filing date: 1930-08-07
Publication date: 1932-02-27

Description

Verfahren zur getrennten Gewinnung der in der Nebennierenrinde enthaltenen Hormone Man hat bereits Neb.ennierenrinde mit Äther extrahiert und hierauf den Rückstand mit Alkohol ausgezogen (vgl. z. B. Science, 1930, Seite 76). Hierbei wurde aber keine Trennung der in der Nebennierenrinde enthaltenen Hormone erzielt.

Es wurde gefunden, daß in der Nebennierenrinde drei Wirkstoffe von verschiedener Wirkungsweise enthalten sind. Durch Versuche ist festgestellt worden, daß diese drei Wirkstoffe aus einem den Phosphatidspiegel des Blutes steigernden Hormon (im folgenden mit Hormon A; bezeichnet), einem den Cholesterinspiegel im Blut senkenden Hormon (im: folgenden mit Hormon B bezeichnet) und einem den Phosphatidspiegel des Blutes senkenden Hormon (im folgenden mit Hormon C bezeichnet) bestehen. Um nun diese Substanzen voneinander zu trennen, kann man von ihren verschiedenen Löslichkeitseigenschaften Gebrauch machen, die sich aus nachstehender Tabelle ergeben:

Hormon A Hormon B Hormon C

in Wasser . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . unlöslich unlöslich löslich

in Methylalkohol . . .. . . .. . . . .. ... . unlöslich löslich löslich

in Äthylalkohol . . . . . . . . . . . . . . . . . . unlöslich löslich löslich

in Äther . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . löslich löslich unlöslich

in Petroläther und Aceton. . . . . . .. . löslich löslich unlöslich

Gemäß der Erfindung erfolgt nun die Trennung der in der Nebennierenrinde voT-handenen Hormone in der Weise, daß man zunächst der Nebennierenrinde durch eine Extraktion mittels Acetons das Hormon A und den größten Teil des Hormons B entzieht. Aus dem Rückstand wird mittels Alkohols der Rest des Hormons B und das gesamte Hormon C gewonnen.

Aus dem Acetonextrakt werden zunächst durch Fällung die Pliosphatide und durch Verseifung die Fette entfernt. Der unverseifbare Anteil, der die Hormone ,4 und B enthält, wird mit Alkohol behandelt, durch den das Hormon B gelöst wird, während das HormonA ungelöst zurückbleibt. Der alkoholunlösliche Anteil wird in Äther oder Petroläther aufgenommen, durch mehrmaliges Eindampfen sowie erneutes Lösen in diesen Lösungsmitteln gereinigt und kann schließlich nach Verdampfung der Lösungsmittel. in Olivenöl gelöst werden.
Aus der alkoholischen Lösung, die das Hormon B enthält, wird das Cholesterin durch. Fällung entfernt. Nach Einengung der alkoholischen Lösung wird der Rückstand durch Aufnehmen in Äther oder Petroläther gereinigt. Der nach Verdampfung dieser Lösungsmittel erhaltene Rückstand kann; gegebenenfalls nach Reinigung durch Hochvakuumdestillation, zur Verwendung in Olivenöl gelöst werden.
Die Abtrennung des Hormons C erfolgt gemäß der Erfindung in der Weise, daß man den alkoholischen Extrakt. nach Einengung des Alkohols gleichzeitig `mit' Wasser und Äther behandelt und aus dem wäßrigen Anteil durch Zusatz von alkoholischer Bleisalzlösung den Wirkstoff ausfällt. Der hierbei erhaltene Bleiniederschlag wird nach Abtrennung in Wasser suspendiert und die Lösung entbleit. Die erhaltene wäßrige Lösung des Wirkstoffes kann durch Erhitzen in an, sich bekannter Weise sterilisiert werden.
Die Reste des Hormons B werden dadurch abgetrennt, daß man den durch gleichzeitige Behandlung des eingeengten alkoholischen Extraktes mit Äther und Wasser gewonnenen ätherischen Anteil von den Phosphatiden befreit, das Lösungsmittel im Vakuum vertreibt und den Rückstand durch Lösen in Petroläther reinigt. Nach Abdampfen des Lösungsmittels kann der Rückstand, gegebenenfalls nach Reinigung durch Hochvakuumdestillation, mit den nach vorstehender Vorschrift gewonnenen Lösungen des Hormons B vereinigt werden. Beispiele i. Von frischen Nebennieren wird die Rindersubstanz möglichst schnell und sorgfältig vom Mark abpräpariert, zerkleinert und im Vakuum bei 45- bis 5o° C getrocknet. Die getrocknete harte Masse wird gepulvert und mit einer Mischung von 5 Teilen Aceton auf einen Teil Äther bei Zimm-mertemperatur in Kohlensäureatmosphäre dreimal je 2 Tage lang extrahiert, wobei auf 500 g Ausgangssubstanz etwa 11 Lösungsmittel kommt. Der gewonnene Extrakt wird im Vakuum bei 40° C eingeengt und mit reichlich Wasser verdünnt. Hierauf wird Kochsalz bis zur Sättigung zugesetzt und das Gemisch im Scheidetrichter mit Äther ausgeschüttelt. Die ätherische Phase wird im Vakuum eingeengt, und durch Zusatz -von Aceton und einigen Tropfen gesättigter alkoholischer Magnesiumchloridlösung wird die Hauptmenge der Phosphatide zur Fällung gebracht. Die von dem Niederschlag durch Zentrifugieren abgetrennte ätherische Lösung wird mit Alkohol verdünnt und mit Natriumäthylat (i g Na auf i g Trockensubstanz) 5 Stunden unterm Rückflußkühler in Stirkstoffatmosphäre ge--.köcht. Sodann wird das Lösungsmittel im Vakuum eingeengt, zum Rückstand reichlich Wasser zugesetzt und mit Trichloräthylen oder Dichloräthylen ausgeschüttelt. Hierdurch wird das die Wirkstoffe enthaltende Unverseifbare in Lösung gebracht, während das Verseifte fast vollkommen zurückbleibt. Die milchig getrübten Extrakte werden zur Klärung mit wasserfreiem Natriumsulfat geschüttelt und- nach dem Filtrieren irr Vakuum zur Trockne gebracht. Zur vollkommenen Befreiung- von Seifenresten wird der Rückstand unter Zusatz von granuliertem Cälciumchlorid in Leichtpetroläther aufgenommen und das Filtrat hiervon wieder im Vakuum eingedunstet. Der Rückstand wird in einer Stickstoffatmosphäre so oft mit Methylalkohol ausgekocht, bis sich der Alkohol nach 3 Minuten langem Kochen nicht mehr färbt. Das Ungelöste wird nach Abtrennung von der Lösung in Äther oder Petroläther aufgenommen, eine geringe- Trübung durch Abzentrifugieren entfernt und sodann das Lösungsmittel im Vakuum wieder verjagt. Der hierbei gewonnene Rückstand wird in Leichtpetroläther oder Benzol gelöst und mit dem drei- bis vierfachen Volumen Aceton versetzt. Nach i 2stündigem Stehen im Eisschrank unter Luftabschluß wird die klar gewordene Flüssigkeit von einem an den Gefäßwänden haftenden Niederschlag abgegossen. Die Petroläther-Aceton-Lösung wird sodann im Vakuum zur Trockne gebracht.
Der erhaltene Wirkstoff (HormonA) geht im Vakuum unter o,oi mm Druck zwischen 61 und 68°C urzersetzt über. Er zeigt deutlich saure Reaktion. Die Reaktion nach Liebermann-Burchardt mit Essigsäureanhydrid und konzentrierter Schwefelsäure ergibt nur eine Braunfärbung ohne Fluoreszenz. Die Analyse stimmt auf eine Zusammensetzung von der Formel C22H3603. Wird dieses Präparat z. B. Kaninchen eingespritzt, so gehen die Phosphatidwerte im Blutplasma in die Höhe, während der Cholesteringehalt unverändert bleibt.
2. Die in Beispiel i durch Behandlung des unverseifharen Rückstandes mit heißem Methylalkohol erhaltene Lösung wird zur Fällung des Cholesterins mit warmer i %iger alkoholischer Digitoninlösung versetzt. Der hierbei entstehende Niederschlag wird nach 24stündigem Absitzenlassen durch Absaugen entfernt. Das Filtrat wird im Vakuum eingeengt und sodann in Äther oder Leichtpetroläther aufgenommen. Diese Lösungen werden ebenfalls stark eingeengt und sodann mit Aceton verdünnt. Nach vollkommener Verdampfung des Acetons im Vakuum. kann der Rückstand zur vollkommenen Reinigung mit Hilfe von Äther in einen Destillationskolben hineingebracht werden. Der Äther wird verdampft.
Der gewonnene Wirkstoff geht im Hochvakuum von o,oi mm bei i 3o bis z35° C über. Er stellt eine hellgelbbraune Masse dar, die bei gewöhnlicher Temperatur glasig erstarrt, bei tiefen Temperaturen Kristalle absetzt. Er löst sich nicht in Wasser, dagegen gut in Alkohol, Aceton, Petroläther und anderen neutralen organischen Lösungsmitteln. Die Analyse ergab einen Gehalt von 78,89 % C, t i,89 0,o H und 9,i3 0'o O. Der Wirkstoff verbindet sich nicht mit Digitonin; die Reaktion nach Liebermann-Burchardt ergibt einen braunen Ton mit intensiver grüner Fluoreszenz. Der Wirkstoff bringt beim Kaninchen eine sehr erhebliche Senkung des Blutcholesterins zustande, während der Phosphatidgelialt vollkommen unberührt bleibt.
3. Die mit Aceton bzw.einem Aceton-Äther-Gemisch vorbehandelte Rindensubstanz wird getrocknet, fein gemahlen und mit dem vierfachen Volumen 96o'oigen Alkohols 5 Tage bei Zimmertemperatur ausgezogen. Der abfiltrierte alkoholische Extrakt wird im Vakuum eingeengt und mit Äther vermischt. Hierbei entsteht ein dicker flockiger Niederschlag. Zu der Alkohol-Äther-Mischung wird weiter Äther portionsweise zugefügt undjedesmal umgeschüttelt, bis bei weiterem Zusatz keine Trübung der Flüssigkeit mehr eintritt. Der Niederschlag wird durch Zusatz von Wasser gelöst und die wäßrige Lösung von der ätherischen im Scheidetrichter getrennt. Die wäßrige Lösung wird mit Natronlauge gegen Lakmus neutralisiert, im Vakuum von Ätherresten befreit und bei etwa 5o° C auf 1/.i des Volumens eingeengt. Dann wird mit dem drei- bis vierfachen Volumen Methylalkohol verdünnt und gesättigte methylalkoholische Bleiacetatlösung so lange zugefügt, bis weiterer Zusatz keine Trübung der überstehenden Flüssigkeit mehf hervorruft. Nach 24stündigem Stehen wird der Niederschlag abzentrifugiert und sodann in mit Salpetersäure schwach angesäuertem Wasser suspendiert, wobei fast alles in Lösung geht. Hierauf wird das Blei durch Zusatz von Schwefelwasserstoff gefällt und durch Filtration entfernt. Im Filtrat wird der überschüssige Schwefelwasserstoff durch einen Kohlendioxydstrom ausgetrieben. Die Lösung wird sodann gegen Lakmus neutralisiert und im Vakuum auf einen berechneten Gehalt an Wirkstoff eingeengt. Die klare gelbbraune Lösung kann durch Erhitzen auf 8o° C sterilisiert werden.
Wird der Wirkstoff z. B. einem Kaninchen eingespritzt, so geht der Phosphatidgehalt des Blutplasmas zurück, während der Cholesteringehalt unverändert bleibt. .
4. Der bei Beispiel 3 durch gleichzeitige Behandlung des eingeengten alkoholischen Extraktes mit Äther und Wasser gewonnene ätherische Anteil wird im Vakuum bis zur Sirupkonsistenz eingeengt und durch reichlichen Zusatz von Aceton und einigen Tropfen gesättigter alkoholischer Magnesiumchloridlösung von den Phosphatiden befreit. Der Niederschlag der Phosphatide wird durch Abzentrifugieren von der Lösung entfernt. Sodann wird im Vakuum das Lösungsmittel vertrieben und der Rückstand in Petroläther aufgenommen. Nach Abdampfen des Lösungsmittels im Vakuum kann der Rückstand gegebenenfalls nach Reinigung durch Hochvakuumdestillation, wie in Beispiel 2 angegeben, in Olivenöl gelöst und mit der nach Beispiel e erhaltenen Lösung vereinigt werden.

Claims

PATENTANSPRÜCHE: i. Verfahren zur getrennten Gewinnung der in der Nebennierenrinde enthaltenen Hormone, dadurch gekennzeichnet, daß man die im Vakuum getrocknete zerkleinerte Rindensubstanz unter Vermeidung einer Oxydation mit Aceton, gegebenenfalls unter Zusatz von Äther, in bekannter Weise extrahiert, aus dem gewonnenen Extrakt sodann die Phosphatide durch Fällung sowie die Pettsäureverbindungen durch Verseifung entfernt und den gewonnenen unverseifbaren Rückstand mit heißem Alkohol in an sich bekannter Weise behandelt, worauf man den alkoholunlöslichen Anteil in Äther oder Petroläther aufnimmt und durch mehrmaliges Eindampfen sowie erneutes Lösen in diesen Lösungsmitteln reinigt (Hormon p ).
2. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß man aus der durch eine an sich bekannte Behandlung des unverseifbaren Rückstandes mit heißen Alkoholen erhaltenen Lösung die Cholesterinreste durch Fällung entfernt, die alkoholische Lösung einengt und den Rückstand durch Aufnehmen in Äther oder Leichtpetroläther und gegebenenfalls durch Hochvakuumdestillation reinigt (Hormon B).
3. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß man die mit Aceton oder einem Aceton-Äther-Gemisch vorbehandelte Rindensubstanz mit Alkohol auszieht und den Extrakt nach Einengung des Alkohols gleichzeitig mit Wasser und Äther behandelt, worauf man aus dem wäßrigen Anteil durch Behandlung mit alkoholischer Bleisalzlösung die Wirkstoffe ausfällt, den erhaltenen bleihaltigen Niederschlag nach Abtrennung in wäßriger Suspension durch Säure zerlegt und , das.- Blei durch Fällung entfernt (Hormon C): q.. Verfahren : nach Anspruch z und 3, dadurch gekennzeichnet, daß man den durch gleichzeitige Behandlung des eingeengten alkoholischen Extraktes mit Äther und Wasser gewonnenen ätherischen Anteil von den Phosphatiden befreit, das Lösungsmittel im Vakuum vertreibt und den Rückstand durch Lösen in Petroläther reinigt, worauf man nach Abdampfen des Lösungsmittels den Rückstand gegebenenfalls einer Hochvakuumdestillation unterwirft und mit dem . nach Anspruch a erhaltenen Rückstand vereinigt (Hormon B).