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Verfahren zur getrennten Gewinnung der in der Nebennierenrinde enthaltenen
Hormone Man hat bereits Neb.ennierenrinde mit Äther extrahiert und hierauf den Rückstand
mit Alkohol ausgezogen (vgl. z. B. Science, 1930, Seite 76). Hierbei wurde
aber keine Trennung der in der Nebennierenrinde enthaltenen Hormone erzielt.
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Es wurde gefunden, daß in der Nebennierenrinde drei Wirkstoffe von
verschiedener Wirkungsweise enthalten sind. Durch Versuche ist festgestellt worden,
daß diese drei Wirkstoffe aus einem den Phosphatidspiegel des Blutes steigernden
Hormon (im folgenden mit Hormon A; bezeichnet), einem den Cholesterinspiegel im
Blut senkenden Hormon (im: folgenden mit Hormon B bezeichnet) und einem den Phosphatidspiegel
des Blutes senkenden Hormon (im folgenden mit Hormon C bezeichnet) bestehen. Um
nun diese Substanzen voneinander zu trennen, kann man von ihren verschiedenen Löslichkeitseigenschaften
Gebrauch machen, die sich aus nachstehender Tabelle ergeben:
| Hormon A Hormon B Hormon C |
| in Wasser . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . unlöslich
unlöslich löslich |
| in Methylalkohol . . .. . . .. . . . .. ... . unlöslich löslich
löslich |
| in Äthylalkohol . . . . . . . . . . . . . . . . . . unlöslich
löslich löslich |
| in Äther . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . löslich
löslich unlöslich |
| in Petroläther und Aceton. . . . . . .. . löslich löslich unlöslich |
Gemäß der Erfindung erfolgt nun die Trennung der in der Nebennierenrinde voT-handenen
Hormone in der Weise, daß man zunächst der Nebennierenrinde durch eine Extraktion
mittels Acetons das Hormon A und den größten Teil des Hormons B entzieht. Aus dem
Rückstand wird mittels Alkohols der Rest des Hormons B und das gesamte Hormon C
gewonnen.
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Aus dem Acetonextrakt werden zunächst durch Fällung die Pliosphatide
und durch Verseifung die Fette entfernt. Der unverseifbare Anteil, der die Hormone
,4 und B enthält, wird mit Alkohol behandelt, durch den das Hormon B gelöst
wird, während das HormonA ungelöst zurückbleibt. Der alkoholunlösliche Anteil wird
in Äther oder Petroläther aufgenommen, durch mehrmaliges Eindampfen sowie erneutes
Lösen in diesen Lösungsmitteln gereinigt und kann schließlich nach Verdampfung der
Lösungsmittel. in Olivenöl gelöst werden.
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Aus der alkoholischen Lösung, die das Hormon B enthält, wird das Cholesterin
durch.
Fällung entfernt. Nach Einengung der alkoholischen Lösung
wird der Rückstand durch Aufnehmen in Äther oder Petroläther gereinigt. Der nach
Verdampfung dieser Lösungsmittel erhaltene Rückstand kann; gegebenenfalls nach Reinigung
durch Hochvakuumdestillation, zur Verwendung in Olivenöl gelöst werden.
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Die Abtrennung des Hormons C erfolgt gemäß der Erfindung in der Weise,
daß man den alkoholischen Extrakt. nach Einengung des Alkohols gleichzeitig `mit'
Wasser und Äther behandelt und aus dem wäßrigen Anteil durch Zusatz von alkoholischer
Bleisalzlösung den Wirkstoff ausfällt. Der hierbei erhaltene Bleiniederschlag wird
nach Abtrennung in Wasser suspendiert und die Lösung entbleit. Die erhaltene wäßrige
Lösung des Wirkstoffes kann durch Erhitzen in an, sich bekannter Weise sterilisiert
werden.
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Die Reste des Hormons B werden dadurch abgetrennt, daß man den durch
gleichzeitige Behandlung des eingeengten alkoholischen Extraktes mit Äther und Wasser
gewonnenen ätherischen Anteil von den Phosphatiden befreit, das Lösungsmittel im
Vakuum vertreibt und den Rückstand durch Lösen in Petroläther reinigt. Nach Abdampfen
des Lösungsmittels kann der Rückstand, gegebenenfalls nach Reinigung durch Hochvakuumdestillation,
mit den nach vorstehender Vorschrift gewonnenen Lösungen des Hormons B vereinigt
werden. Beispiele i. Von frischen Nebennieren wird die Rindersubstanz möglichst
schnell und sorgfältig vom Mark abpräpariert, zerkleinert und im Vakuum bei 45-
bis 5o° C getrocknet. Die getrocknete harte Masse wird gepulvert und mit einer Mischung
von 5 Teilen Aceton auf einen Teil Äther bei Zimm-mertemperatur in Kohlensäureatmosphäre
dreimal je 2 Tage lang extrahiert, wobei auf 500 g Ausgangssubstanz etwa
11 Lösungsmittel kommt. Der gewonnene Extrakt wird im Vakuum bei 40° C eingeengt
und mit reichlich Wasser verdünnt. Hierauf wird Kochsalz bis zur Sättigung zugesetzt
und das Gemisch im Scheidetrichter mit Äther ausgeschüttelt. Die ätherische Phase
wird im Vakuum eingeengt, und durch Zusatz -von Aceton und einigen Tropfen gesättigter
alkoholischer Magnesiumchloridlösung wird die Hauptmenge der Phosphatide zur Fällung
gebracht. Die von dem Niederschlag durch Zentrifugieren abgetrennte ätherische Lösung
wird mit Alkohol verdünnt und mit Natriumäthylat (i g Na auf i g Trockensubstanz)
5 Stunden unterm Rückflußkühler in Stirkstoffatmosphäre ge--.köcht. Sodann wird
das Lösungsmittel im Vakuum eingeengt, zum Rückstand reichlich Wasser zugesetzt
und mit Trichloräthylen oder Dichloräthylen ausgeschüttelt. Hierdurch wird das die
Wirkstoffe enthaltende Unverseifbare in Lösung gebracht, während das Verseifte fast
vollkommen zurückbleibt. Die milchig getrübten Extrakte werden zur Klärung mit wasserfreiem
Natriumsulfat geschüttelt und- nach dem Filtrieren irr Vakuum zur Trockne gebracht.
Zur vollkommenen Befreiung- von Seifenresten wird der Rückstand unter Zusatz von
granuliertem Cälciumchlorid in Leichtpetroläther aufgenommen und das Filtrat hiervon
wieder im Vakuum eingedunstet. Der Rückstand wird in einer Stickstoffatmosphäre
so oft mit Methylalkohol ausgekocht, bis sich der Alkohol nach 3 Minuten langem
Kochen nicht mehr färbt. Das Ungelöste wird nach Abtrennung von der Lösung in Äther
oder Petroläther aufgenommen, eine geringe- Trübung durch Abzentrifugieren entfernt
und sodann das Lösungsmittel im Vakuum wieder verjagt. Der hierbei gewonnene Rückstand
wird in Leichtpetroläther oder Benzol gelöst und mit dem drei- bis vierfachen Volumen
Aceton versetzt. Nach i 2stündigem Stehen im Eisschrank unter Luftabschluß wird
die klar gewordene Flüssigkeit von einem an den Gefäßwänden haftenden Niederschlag
abgegossen. Die Petroläther-Aceton-Lösung wird sodann im Vakuum zur Trockne gebracht.
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Der erhaltene Wirkstoff (HormonA) geht im Vakuum unter o,oi mm Druck
zwischen 61 und 68°C urzersetzt über. Er zeigt deutlich saure Reaktion. Die Reaktion
nach Liebermann-Burchardt mit Essigsäureanhydrid und konzentrierter Schwefelsäure
ergibt nur eine Braunfärbung ohne Fluoreszenz. Die Analyse stimmt auf eine Zusammensetzung
von der Formel C22H3603. Wird dieses Präparat z. B. Kaninchen eingespritzt, so gehen
die Phosphatidwerte im Blutplasma in die Höhe, während der Cholesteringehalt unverändert
bleibt.
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2. Die in Beispiel i durch Behandlung des unverseifharen Rückstandes
mit heißem Methylalkohol erhaltene Lösung wird zur Fällung des Cholesterins mit
warmer i %iger alkoholischer Digitoninlösung versetzt. Der hierbei entstehende Niederschlag
wird nach 24stündigem Absitzenlassen durch Absaugen entfernt. Das Filtrat wird im
Vakuum eingeengt und sodann in Äther oder Leichtpetroläther aufgenommen. Diese Lösungen
werden ebenfalls stark eingeengt und sodann mit Aceton verdünnt. Nach vollkommener
Verdampfung des Acetons im Vakuum. kann der Rückstand zur vollkommenen Reinigung
mit Hilfe von Äther in einen Destillationskolben hineingebracht
werden.
Der Äther wird verdampft.
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Der gewonnene Wirkstoff geht im Hochvakuum von o,oi mm bei i 3o bis
z35° C über. Er stellt eine hellgelbbraune Masse dar, die bei gewöhnlicher Temperatur
glasig erstarrt, bei tiefen Temperaturen Kristalle absetzt. Er löst sich nicht in
Wasser, dagegen gut in Alkohol, Aceton, Petroläther und anderen neutralen organischen
Lösungsmitteln. Die Analyse ergab einen Gehalt von 78,89 % C, t i,89 0,o H und 9,i3
0'o O. Der Wirkstoff verbindet sich nicht mit Digitonin; die Reaktion nach Liebermann-Burchardt
ergibt einen braunen Ton mit intensiver grüner Fluoreszenz. Der Wirkstoff bringt
beim Kaninchen eine sehr erhebliche Senkung des Blutcholesterins zustande, während
der Phosphatidgelialt vollkommen unberührt bleibt.
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3. Die mit Aceton bzw.einem Aceton-Äther-Gemisch vorbehandelte Rindensubstanz
wird getrocknet, fein gemahlen und mit dem vierfachen Volumen 96o'oigen Alkohols
5 Tage bei Zimmertemperatur ausgezogen. Der abfiltrierte alkoholische Extrakt wird
im Vakuum eingeengt und mit Äther vermischt. Hierbei entsteht ein dicker flockiger
Niederschlag. Zu der Alkohol-Äther-Mischung wird weiter Äther portionsweise zugefügt
undjedesmal umgeschüttelt, bis bei weiterem Zusatz keine Trübung der Flüssigkeit
mehr eintritt. Der Niederschlag wird durch Zusatz von Wasser gelöst und die wäßrige
Lösung von der ätherischen im Scheidetrichter getrennt. Die wäßrige Lösung wird
mit Natronlauge gegen Lakmus neutralisiert, im Vakuum von Ätherresten befreit und
bei etwa 5o° C auf 1/.i des Volumens eingeengt. Dann wird mit dem drei- bis vierfachen
Volumen Methylalkohol verdünnt und gesättigte methylalkoholische Bleiacetatlösung
so lange zugefügt, bis weiterer Zusatz keine Trübung der überstehenden Flüssigkeit
mehf hervorruft. Nach 24stündigem Stehen wird der Niederschlag abzentrifugiert und
sodann in mit Salpetersäure schwach angesäuertem Wasser suspendiert, wobei fast
alles in Lösung geht. Hierauf wird das Blei durch Zusatz von Schwefelwasserstoff
gefällt und durch Filtration entfernt. Im Filtrat wird der überschüssige Schwefelwasserstoff
durch einen Kohlendioxydstrom ausgetrieben. Die Lösung wird sodann gegen Lakmus
neutralisiert und im Vakuum auf einen berechneten Gehalt an Wirkstoff eingeengt.
Die klare gelbbraune Lösung kann durch Erhitzen auf 8o° C sterilisiert werden.
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Wird der Wirkstoff z. B. einem Kaninchen eingespritzt, so geht der
Phosphatidgehalt des Blutplasmas zurück, während der Cholesteringehalt unverändert
bleibt. .
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4. Der bei Beispiel 3 durch gleichzeitige Behandlung des eingeengten
alkoholischen Extraktes mit Äther und Wasser gewonnene ätherische Anteil wird im
Vakuum bis zur Sirupkonsistenz eingeengt und durch reichlichen Zusatz von Aceton
und einigen Tropfen gesättigter alkoholischer Magnesiumchloridlösung von den Phosphatiden
befreit. Der Niederschlag der Phosphatide wird durch Abzentrifugieren von der Lösung
entfernt. Sodann wird im Vakuum das Lösungsmittel vertrieben und der Rückstand in
Petroläther aufgenommen. Nach Abdampfen des Lösungsmittels im Vakuum kann der Rückstand
gegebenenfalls nach Reinigung durch Hochvakuumdestillation, wie in Beispiel 2 angegeben,
in Olivenöl gelöst und mit der nach Beispiel e erhaltenen Lösung vereinigt werden.