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Verfahren zur Reinigung von Keimdrüsenhormonen Die bisher bekanntgewordenen
Verfahren zur Herstellung der weiblichen Keimdrüsenhormone bedienen sich zur Reinigung
der Rohextrakte der Tatsache, daß die weiblichen Keimdrüsenhormone zur Gruppe der'
Phenole gehören und deshalb schwachsaure Eigenschaften besitzen. Man schüttelt deswegen
entweder die Lösungen der rohen Keimdrüsenhormonextrakte mit Alkalien verschiedener
Konzentration aus oder man behandelt die roher Extrakte mit verdünnten Alkalien
und extrahiert sodann aus diesen Lösungen die schwachsauren Hormone.
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Diese Verfahren haben verschiedene Nachteile. Die schwache Azidität
der weiblichen Keimdrüsenhormone bringt es mit sich, daß nicht nur die Alkalien
diese Stoffe aus den Lösungen in organischen Lösungsmitteln extrahieren, sondern
es werden auch umgekehrt die Hormone mit organischen Lösungsmitteln aus ihren alkalischen
Lösungen aufgenommen. Es ist deshalb schwer, eine quantitative Extraktion der Hormone
zu erzielen. Ein weiterer Umstand, der sich sehr unangenehm bemerkbar macht, liegt
darin, daß alle weibliches Keimdrüsenhormon enthaltenden Extrakte Gemische mit Säuren,
insbesondere mit Fettsäuren, vorstellen. Es ist aber bekannt, daß die Salze dieser
Säuren zum Teil als solche in den verwendeten örganischen Lösungsmitteln löslich
sind, so daß die erhaltenen Extrakte niemals die schwachsauren Hormone allein enthalten;
vielmehr sind diese stets mit mehr oder weniger großen Mengen von fettsauren Salzen
verunreinigt. Alle weiteren Operationen werden durch diese Beimengung stark erschwert,
da die fettsauren Salze in ihre Lösungen an sich schwer lösliche Stoffe aufnehmen,
wodurch wieder die an sich in Wasser unlöslichen Hormone in Lösung gehalten werden.
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Bei der entsprechenden Gewinnung des männlichen Keimdrüsenhormons
aus Harn liegen die Schwierigkeiten darin, daß es nur schwer gelingt, diesen neutralen
Stoff von seinen phenolischen und sauren Begleitern abzutrennen.
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Es wurde nun die Beobachtung gemacht, daß alle diese Schwierigkeiten
beseitigt werden können, wenn man an Stelle von wässerigen Alkalien trockene Alkalien,
z. B. Hydroxyde oder Carbonate vorzugsweise der Alkali- und Erdalkalireihe, zu den
Reinigungen verwendet.
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Das neue Verfahren hat den großen Vorteil, daß es eine bequeme Trennung
der wahren Säuren und der schwachsauren phenolischen Keimdrüsenhormone voneinander
und von den neutralen Hormonen und Begleitstoffen ermöglicht, je nachdem ob man
mit wasserfreien Carbonaten oder Hydroxyden arbeitet. Es besteht
darin,
daß man z. B. Rohextrakte, welche die weiblichen Keimdrüsenhormone enthalten, gegebenenfalls
nach einer ausgiebigen Hydrolyse, in einem organischen nicht dissoziierenden Lösungsmittel,
beispielsweise Äther oder Benzol, aufnimmt und sodann mit gepulvertem, wasserfreiem
Natriumcarbonat, zweckmäßig unter Rühren, behandelt. Die freien Säuren, auch die
Fettsäuren, werden durch diese Behandlung gebunden. An Stelle des Natriumcarbonats
kann indiesemFalle auchCalciumoxydoder-hydroxyd Verwendung finden. NachvollständigerBindung
der Säuren auf dem beschriebenen Wege wird vom Ungelösten abfiltriert, die Hormonlösung
darauf beispielsweise mit gepulvertem Natriumhydroxyd versetzt und unter Rühren
eine Zeit lang gekocht; dabei werden die weiblichen Keimdrüsenhormone von dem Ätznatron
in Form ihrer Salze gebunden. Wenn nach weiterer Zugabe von gepulvertem Ätznatron
keine durch Verfärbung dieses Pulvers bemerkbare Abscheidung von Substanz aus der
Lösung mehr erfolgt, wird der Rückstand von der Lösung durch Filtrieren getrennt.
Man wäscht mit dem verwendeten Lösungsmittel gründlich nach, trocknet zur Entfernung
desselben und löst sodann den pulverigen Rückstand in Wasser auf. Die weitere Verarbeitung
kann in verschiedener Weise erfolgen. Man kann durch einfaches Ansäuern sämtliche
an das Ätznatron gebundene Substanzen im Gemenge in Freiheit setzen und die Reindarstellung
der Hormone dann durch Verarbeitung des erhaltenen Niederschlages ausführen.
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Zur Gewinnung des männlichen Keimdrüsenhormons verarbeitet man die
abgetrennten organischen Lösungen.
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Da aber außer manchen Keimdrüsenhormonen noch andere phenolartige
Körper sowie Phenole als solche von dem Ätznatron gebunden werden, empfielt sich
der folgende Weg der Aufarbeitung des Ätznatronanteiles: Man löst das Gemenge der
Natronsalze in Wasser auf und filtriert vom Ungelösten beispielsweise über Glaswolle
ab. Die Mutterlauge wird dann ohne weiteres mit beispielsweise Äther gründlich ausgeschüttelt,
an welchen sie die am schwächsten sauren Substanzen abgibt. Durch Sättigen der Mutterlauge
mit Kohlensäure werden weitere Substanzen abgeschieden, welche durch Extraktion
gewonnen werden können. In der bicarbonatischen Mutterlauge bleiben sodann nur mehr
Spuren der phenolisc hen Hormone zurück.
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Bei dem Verfahren der Schweizer Patente 113 835 und 117 282 wird bereits
Keimdrüsenhormone enthaltendes Material mit Alkalien in trockenem sowie in gelöstem
Zustande behandelt, doch werden bei diesen Verfahren nicht wie bei vorliegendem
Verfahren die Wirkstoffe als schwer oder unlösliche Alkalisalze abgeschieden, sondern
nur die Verunreinigungen entfernt und die wirksame Substanz mit einem Lösungsmittel.
extrahiert. Es besteht also zwischen den Verfahren der prinzipielle Unterschied,
daß die Alkalien, die einerseits zur direkten Gewinnung der EVirkstoffe führen,
andererseits, da sie lediglich zur Entfernung von Unreinigkeiten dienen, nur an
einer indirekten Gewinnnng der Wirkstoffe teilhaben. Beispiel i 5oo g eines durch
Extraktion von alkalisch und sauer hydrolysiertem Stutenharn mit Butylalkohol erhaltenen
Extrakts werden in 31 Äther gelöst und sodann mit ioo g fein gepulvertem, wasserfreiem
Natriumcarbonat unter Rühren 2 Stunden zum Sieden erhitzt. Von dem Natriumcarbonat
wird abfiltriert und das Filtrat wieder unter Rühren durch 2 Stunden mit3ogfein
gepulvertem Calciumoxyd oder 6o g Calciumhydroxyd, dem man zur Wasserverbindung
eine entsprechende Menge wasserfreien Calciumsulfats zugibt, versetzt und wieder
2 Stunden gekocht. Man filtriert nun ab. Sowohl derNatriumcarbonatsrückstand wie
der Calciumoxydrückstand werden mit Wasser ausgerührt und mit Salzsäure kongosauer
gemacht. Nach vollständigem Auflösen der anorganischen Salze scheiden sich die in
dem Rohpräparat enthaltenen Säuren in Form eines dunkel gefärbten Öles ab, das beim
Erkalten kristallinisch erstarrt.
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Die filtrierte ätherische Lösung wird darauf mit ioo g fein gepulvertem
Natriumhydroxyd, dem man- 5o g wasserfreies, fein gepulvertes Natriumsulfat zugesetzt
hat, unter Rühren weitere 2 Stunden zum Sieden erhitzt. Dabeifärbt sich das weiße
N atriumhydroxydpulver dunkelbraun, während die Lösung fast vollständig entfärbt
wird. Es empfiehlt sich, diese Behandlung mit einer geringeren Menge Ätznatron,
beispielsweise 5o g, zu wiederholen. Man filtriert nunmehr die ätherische Lösung
von dem Rückstand ab. Sie enthält die sogenannten neutralen Substanzen, wie Cholesterin
u. ä., und kann zur Gewinnung dieser Stoffe verwendet werden. Der braun gefärbte
Ätznatronrückstand wird nach entsprechender Waschung mit Äther und Abdampfen desselben
mit etwa 5oo ccm Wasser versetzt. Dabei geht der größte Teil des Niederschlages
in Lösung. Es bleibt nur eine verhältnismäßig geringe Menge bräunlich gefärbter
Substanz zurück. Aus der klarfiltrierten alkalischen Lösung fällt beim Versetzen
mit Säure ein Öl aus. Nach Ablassen desselben mit überhitztem Wasserdampf, wodurch
die niedrigen Phenole, welche bekanntlich in jedem Harn enthalten sind, entfernt
werden, erstarrt der Rückstand beim Abkühlen zu einer halbkristallinischen Masse.
Aus dieser können nach an sich bekannten Methoden die weiblichen Keimdrüsenhormone
in kristallisierter Form erhalten werden.
Beispiel 2 Zoo g des nach
dem Patent 584 211 aus Stutenharn erhaltenen, mitPhthalsäureveresterten Anteils
der Keimdrüsenhormone werden in 11 Benzol gelöst und mit fein gepulvertem
Calciumhydroxyd 2 Stunden lang gekocht. Nach Filtrieren vom Ungelösten wird die
benzolische Lösung mit 50 g fein gepulvertem Natriumhydroxyd ebenfalls 2
Stunden unter Rühren zum Sieden erhitzt. Die benzolische Lösung ist sodann fast
vollkommen entfärbt und enthält nur mehr stearinartige Stoffe, welche keine Hormoneigenschaften
mehr besitzen. Der unlösliche Rückstand wird mit Wasser aufgenommen, vom Nichtgelösten
abfiltriert und die alkalische Lösung mit, Äther erschöpfend ausgeschüttelt. Durch
Ausschüttelung dieser ätherischen Lösung mit 5 °/oiger Kalilauge und Ansäuern wird
das Delta-Follikelhormon als feines, schwach bräunlich gefärbtes Pulver erhalten.
Beispiel 3 zoo g eines nach Funk aus Männerharn hergestellten Chloroformextraktes
werden in 21 Äther aufgelöst und mit 50 g fein gepulvertem Natriumhydroxyd,
der Flüssigkeit in mehreren Anteilen nach und nach zugesetzt, durch 2 bis 3 Stunden
in der Kälte geschüttelt. Nach Filtrieren wird das Filtrat mit weiteren 2o g fein
gepulvertem Natriumhydroxyd und etwa der gleichen Menge Natriumsulfat am Wasserbad
möglichst unter Rühren 2 Stunden erhitzt. Man filtriert und dampft die ätherische
Lösung zur Trockne. Der Rückstand beträgt etwa 3 bis 5 g und enthält das gesamte
männliche Sexualhormon.