DE586246C - Verfahren zur Gewinnung von Wuchshormonen bzw. deren Estern - Google Patents

Description

• Verfahren zur Gewinnung von Wuchshormonen bzw. deren Estern Es ist bekannt, daß in Pflanzen, z. B. in den Blattspitzen der Gräser wie auch in Nährlösungen von Pilzen, Algen und Bakterien, Stoffe enthalten sind, die das Wachstum der PRanzen regeln und daher als Wuchshormone bezeichnet werden. Man hat auch schon aus pflanzlichen Organismen sexualhormonartig wirkende Stoffe extrahieren können. Die in den Pflanzen enthaltenen Wirkstoffe hat man z. B. mit Hilfe der dekapitierten Koleoptile des keimenden Hafers nachweisen können. Bei der einseitigen Einwirkung der wirksamen Stoffe zeigt die Koleoptile bei weiterem Wachstum eine Krümmung. Die dadurch bewirkte Winkelabweichung von der Senkrechten dient als Maßstab für die Beurteilung der Wirksamkeit. In den folgenden Ausführungen wird unter einer Avena-Einheit (A. E.) diejenige Menge wirksamer Substanz verstanden, die die Spitze der dekapitierten Haferkoleoptile bei einseitiger Darreichung derart beeinflußt, daß sich nach zweistündigem Wuchs gegenüber der Senkrechten eine Winkelabweichung von ro° zeigt.
• Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung der Wuchshormone unter gleichzeitiger Trennung von unwirksamen und anderen wirksamen, insbesondere sexualhormonartig wirkenden Stoffen. Sie bedient sich u. a. der neuen Erkenntnis, daß nicht nur in pflanzlichen Bestandteilen und- in den Nährlösungen von Pilzen, Algen und Bakterien Wuchsstoffe enthalten sind, sondern daß man Wuchsstoffe in besonders `reichem Maße auch in den Schlempen der Gärungsindustrie und in menschlichem und tierischem Harn findet und besonders unter'Verwendung der letztgenannten Ausgangsstoffe mit gutem Ergebnis gewinnen kann. Als besonders ergiebig an Wuchshormon hat sich der Harn solcher Individuen erwiesen, deren physiologischer Zustand von dem normalen abweicht, z. B. der Harn von Tuberkulosekranken und von trächtigen Individuen.
• Erfindungsgemäß gelingt es, die Wuchsstoffe aus den genannten Ausgangsmaterialien in weitgehend angereicherter Form zu gewinnen und zugleich von anderen wirksamen Stoffen abzutrennen, wenn man die Ausgangsstoffe nach Zusatz von Säure mit Wasser oder einem organischen Lösemittel extrahiert, nötigenfalls den Extralot in einer mit Wasser mischbaren organischen Flüssigkeit aufnimmt und aus der so erhältlichen Lösung die Wuchsstoffe durch schwache Alkalien -etwa von der Wasserstoffionenkonzentration w äßriger Alkalicarbonat- oder -bicarbonatlösungen - extrahiert. Bei der letztgenannten Extraktion bleiben andere, nur in starken Alkalien lösliche Wirkstoffe, z: B. die sexualhormonartig wirkenden -Substanzen, ungelöst. Statt mit schwachen Alkalien der gekennzeichneten Art zu extrahieren, kann man auch so vorgehen, daß man zunächst eine Extraktion mit stärkeren Alkalien vornimmt und nachträglich die nur in starkem Alkali löslichen Stoffe durch Abstumpfen der Alkalität etwa bis -zu der Wasserstoff ionenkonzentration von Alkalicarbonat- oder Alkalibicarbonatlösungen ausfällt. Aus den so erhältlichen wäßrigen Lösungen kann man die Wuchsstoffe nach dem Ansäuern durch Extraktion, z. B. mit Äther, abtrennen und dann einer weiteren Reinigung unterwerfen. Eine solche weitere Reinigung erfolgt z. B. zweckmäßig in der Weise, daß man den aus der angesäuerten wäßrigen Lösung erhaltenen Extrakt nach Entfernen des Lösemittels mit Kohlenwasserstoff en, wie Petroläther oder Benzin, behandelt. Bei dieser Behandlung geht ein beträchtlicher Anteil von Begleitstoffen in Lösung. Eine Anreicherung der Wuchsstoffe erzielt man auch in der Weise, daß man ihre wäßrig-alkoholische Lösung wiederholt mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösemittel, wie z. B. Benzol, ausschüttelt. Dabei geht die Hauptmenge der Wuchsstoffe in das mit Wasser nicht mischbare Lösemittel über. Zur Reinigung der die Wuchsstoffe enthaltenden Fraktionen kann man sich auch der Fällung mittels Metallsalzen bedienen. Bleiacetat fällt z. B. das Wuchshormon bei alkalischer Reaktion. Aus der Fällung können die Wuchsstoffe nach dem Ansäuern durch Extraktion, z. B. mit Äther, wieder abgetrennt werden. Calciumacetat fällt aus der wäßrigen Lösung im wesentlichen Verunreinigungen aus, so daß der Wirkstoff aus dem Filtrat in weitergereinigter Form gewonnen werden kann. Eine weitere Reinigung des Wirkstoffes kann durch dessen Umwandlung in ein in Alkalien nicht mehr lösliches neutrales Produkt bewirkt werden, indem man in der für Veresterung üblichen Weise eine starke Säure, etwa Chlorwasserstoff, z. B. in alkoholischer Lösung auf die Wuchshormone einwirken läßt. Schüttelt man so behandelte Fraktionen wiederum mit schwachen Alkalien, wie Alkalicarbonat oder -bicarbonat aus, wird der wirksame Stoff von der alkalischen Lösung nicht mehr aufgenommen. Es hinterbfeibt ein neutrales Produkt von hoher Wirksamkeit. Durch Vakuumdestillation lassen sich daraus wiederum höher wirksame, teils kristallinische Fraktionen gewinnen, die der Verseifung unterworfen werden können. Aus den kristallinischen Fraktionen konnten durch Umkristallisieren Kristalle vom Schmelzpunkt z72° erhalten werden, von denen i mg etwa 3o # ios Avena-Einheiten enthält. Das kristallinische Produkt ist stickstofffrei, es enthält etwa 68,60[o Kohlenstoff und etwa ioo/o Wasserstoff und hat vielleicht laktonartigen Charakter. Es ist löslich in den üblichen organischen Lösemitteln, unlöslich jedoch in Petroläther, Ligroin und Benzol und wenig löslich in Wasser. Beispiel 1 Zoo 1 Schwangerenharn werden nach Ansäuern mit Schwefelsäure erschöpfend mit Benzol extrahiert. Die Benzolläsung wird mit einer 5o/oigen Natriumbicarbonatlösung ausgeschüttelt. Nach Ansäuern der erhaltenen Lösung extrahiert man mit Äther. Man erhält nach Entfernen des Äthers einen Rückstand von etwa 8o g mit insgesamt etwa 2 # iol Avena-Einheiten (A. E.) entsprechend etwa 25 ooo A. E. im Milligramm.
• Zur weiteren Reinigung extrahiert man den Rückstand mit siedendem Petroläther und erhält dabei eine unlösliche Fraktion mit etwa 130 ooo A. E. im Milligramm. Aus der 6o°,!oigen alkoholischen Lösung dieser Fraktion erhält man durch Benzolextraktion ein Produkt mit 24o ooo A. E. im Milligramm. Das so gereinigte Produkt wird wieder in 6oo%igem Alkohol gelöst und zweckmäßig bei schwach alkalischer Reaktion mit einer gesättigten Lösung von Bleiacetat gefällt. Aus dem Niederschlag erhält man nach dem Ansäuern und Extrahieren mit Äther ein Produkt mit i - los A. E. im Milligramm, während durch eine weitere Fällung des in Wasser gelösten Produktes mit Calciumacetat ein unwirksamer Niederschlag und ein wirksames Filtrat zu erhalten sind. Aus dem letzteren kann ein Produkt mit etwa i o5o ooo A. E. im Milligramm zurückgewonnen werden. Diese Fraktion wird nunmehr mit einer 3o joigen Lösung von Chlorwasserstoff in Methylalkohol i Stunde gekocht. Dann wird der Alkohol abgedampft, der Rückstand in Äther aufgenommen und die ätherische Lösung mit Alkalibicarbonat- bzw. Alkalicarbonatlösung ausgeschüttelt. Die Hauptmenge des Wuchsstoffes bleibt nunmehr in der ätherischen Lösung. Nach Entfernen des Äthers erhält man eine Fraktion, von der i mg 1430 ooo A. E. enthält. Wird dieses Produkt einer Hochvakuumdestillation bei o,i mm Druck unterworfen, erhält man eine Reihe von Fraktionen, von denen die bei 125 bis 13o° übergehende kristallisiert und im Milligramm mehr als 5 # ioo A. E. enthält. Durch wiederholtes Umkristallisieren mittels 4o°Joigen Aceton erhält man daraus Kristalle vom Schmelzpunkt 172,°, die in 1 mg 3 # 1o? - A. E. enthalten und die oben beschriebenen Eigenschaften zeigen.
• Beispiel e iooo 1 Schlempe der Preßhefengewinnung werden nach Ansäuern mit Schwefelsäüre@ mit Butylalkohol ausgezogen, die butylalkoholische Lösung wird im Vakuum vom Lösungsmittel befreit und der Rückstand mit peroxydfreiem Äther extrahiert. Die Äther- 1ösung wird mit i°foiger Sodalösung ausgeschüttelt und die alkalische Flüssigkeit nach Ansäuern wiederum mit Äther ausgezogen.
• Der Ätherrückstand enthält 130 - ioß A. E. des wirksamen Stoffes.
• Die weitere Aufarbeitung des Rückstandes erfolgt in der im Beispiel i angegebenen Weise. Man erhält, wie aus der Beschreibung hervorgeht, j e nach der angewandten Methode entweder den im Beispiel i beschriebenen laktonartigen Stoff oder aber die freie Säure, die aus einer Alkoholligroinmischung umkristallisiert werden kann und den Schmelzpunkt 1961' (unkorr.) zeigt. Sie ist drei- bis vieranal wirksamer als der laktonartige Stoff, leicht löslich in Alkohol, Aceton und Äther, schwerer in Wasser, schwer löslich in Benzol.
• Beispiel 3 ioo 1 2°/oiger Wittepeptonlösung werden mit Bacterium Coli beimpft und 3 Tage bei 37° gehalten. Die Mischung wird nun zur Abtötung der Bakterien und zur Zerstörung oxydationsbefördernder Fermente io Minuten auf ioo° erhitzt, die Bakterien werden durch Filtration entfernt und die Lösung im Vakuum stark eingeengt. Nach dem Ansäuern wird mit peroxydfreiem Äther extrahiert und durch Verdunsten der ätherischen Lösung ein Rückstand gewonnen, der ungefähr ii - ios A. E. des wirksamen Stoffes enthält.
• Er kann nach den in den Beispielen i und 2 angegebenen Methoden weitergereinigt werden.

Claims (7)

1. PATENTANSPRÜCHE: i. Verfahren zur Gewinnung von Wuchshormonen bzw. deren Estern, dadurch gekennzeichnet, daß man die pflanzliche Wuchshormone enthaltenden Ausgangsstoffe nach Zusatz von Säure mit Wasser oder organischen Lösemitteln extrahiert, nötigenfalls den Extrakt in einer mit Wasser nicht mischbaren organischen Flüssigkeit aufnimmt und aus der erhältlichen Lösung die Wuchsstoffe durch schwache Alkalien - gegebenenfalls auch durch stärkere Alkalien, die nachträglich abgestumpft werden - -extrahiert und gegebenenfalls die Wuchsstoffq aus der schwach alkalischen Lösung nach dein Ansäuern durch Extraktion abtrennt und einer weiteren Reinigung unterwirft.
2. 2. Ausführungsform des Verfahrens nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß man aus dem nach Anspruch i erhältlichen Extraktrückstand unwirksame Bestandteile durch Ausziehen mit Kohlenwasserstoffen, wie Petroläther oder Benzin, entfernt.
3. 3. Ausführungsform des Verfahrens nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß man die nach Anspruch i oder 2 erhältlichen hormonhaltigen Fraktionen in wäßrigem Alkohol aufnimmt und die Lösung mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösemittel extrahiert. q..
4. Ausführungsform des Verfahrens nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß man die nach Anspruch i bis 3 erhältlichen hormonhaltigen Fraktionen durch Fällungsreaktionen mit Metallsalzen weiterreinigt.
5. 5. Ausführungsform des Verfahrens nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß man die nach Anspruch i bis q. erhältlichen hormonhaltigen Fraktionen in der für die Veresterung üblichen Weise mit starker Säure in Lösung behandelt, die dabei anfallenden neutralen Produkte abtrennt, der fraktionierten Vakuumdestillation unterwirft und gegebenenfalls die wirksamen Fraktionen durch Umkristallisieren weiterreinigt bzw. einer Verseifung unterwirft.
6. 6: Ausführungsform des Verfahrens nach Anspruch i bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man Nährsubstrat von.Pilzen, Algen oder Bakterien als Ausgangsstoff verwendet.
7. 7. Ausführungform des Verfahrens nach Anspruch i bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsstoff Schlempen der Gärungsindustrie verwendet. B. Ausführungform des Verfahrens nach Anspruch i bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsstoff menschlichen oder tierischen Harn verwendet.