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Verfahren zur Abtrennung des antirachitisch wirkenden Bestandteils
aus bestrahltem 7-Dehydrocholesterin Man weiß (vgl. »Annalen der Chemie« Bd.
520, S. 98 ff .), d:aß sich durch Bestrahlung von 7-Dehydrochol.esterin
mit ultraviolettem Licht ein antirachitisch wirksames Produkt bildet. Nur dieses
Ergebnis der pharmakologischen Prüfung des in Rede stehenden Produktes ist bisher
bekannt. Über seine chemischen und physikalischen Eigenschaften mußte dagegen erst
durch eingehende Untersuchungen Klarheit geschaffen werden, die die Grundlage für
die im folgenden beschriebene Erfindung bilden. Bei diesen Untersuchungen wurde
zunächst festgestellt, daß das bestrahlte 7-Dehydrocholesterin ein nach Art und
Dauer der Bestrahlung in der Zusammensetzung wechselndes Gemisch mehrerer Lichtumwandlungsprodukte
darstellt. Die Abtrennung des antirachitisch wirksamen Bestandteils aus diesem Gemisch
ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
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Es wurde festgestellt, daß man den antirachitisch wirksamen Bestandteil
aus bestrahltem 7 -Dehy drocholesterin dadurch abtrennen kann, daß man das Gemisch
der Bestrahlungsprodukte a) mit Maleinsäureanhydri.d oder dessen Homologen bei Raumtemperatur
in indifferenten Lösungsmitteln stehenläßt, -die sauer reagierenden Umsetzungsprodukte
abtrennt, die bleibenden neutral reagierenden Anteile gewinnt und b) nach üblichen
Verfahren verestert, das Gemisch der Ester auf Grund der unterschiedlichen Löslichkeiten
seiner Bestandteile trennt, die den wirksamen Bestandteil enthaltenden Anteile verseift,
c) und sie so oder in veresterter Form einer weiteren Reinigung nach der Methode
der chromatographischen Adsorptionsanalyse unterwirft, wonach im Falle des Arbeitens
mit Estern wieder verseift wird.
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Es wurde weiter gefunden, daß die unter a bis c genannten Reinigungsverfahren
auch in beliebig anderer Reihenfolge als der genannten durchgeführt werden können.
Es kommt ganz auf die Art der im einzelnen angewendeten Verfahren an, ob es vorteilhaft
ist, die oben angegebene Reihenfolge der Teilstufen des Verfahrens oder eine andere
zu benutzen. Es ist z. B. besonders praktisch, wie angegeben, die Fraktionierung
auf adsorptionsanalytischem Wege nach der Reinigung über E.sterderivate vorzunehmen,
wenn man den hei dein letztgenannten Verfahren
benutzten Ester
für die Adsorption weiterverwenden kann. Es kann aber vorteilhaft sein, den umgekehrten
Weg zu gehen, wenn man mit einem Ester arbeitet, der erst bei höherer Reinheit kristallisiert,
und wenn man diese Reinheit durch das adsorptiori's ,. analytische Verfahren erreichen
kann.
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Je nach den Anforderungen, die man an die Reinheit des Endproduktes
stellt; und je nach den Eigenschaften des angewendeten Ausgangsmaterials (dessen
Zusammensetzung mit den Bestrahlungsbedingungen stark variiert) ist es auch möglich,
bei beliebiger Reihenfolge der obengenannten Reinigungsstufen eine oder zwei derselben
wegzulassen, so daß sich also im letzteren Falle das Verfahren in der Anwendung
einer dieser Stufen erschöpft. -Es seien einige Bemerkungen zu den einzelnen Verfahrensstufen
gemacht, die natürlich nicht nur bei der Anwendung der betreffenden Stufe allein,
sondern auch bei ihrer Kombination mit den anderen angegebenen Verfahren zu beachten
sind.
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Die Umsetzung des rohen oder v orgereinigten Bestrahlungsproduktes
mit Maleinsäureanhydrid oder seinen Homologen (z. B. Citraconsäureanhydri:d) soll
bei Raumtemperatur erfolgen, da bei erhöhter Temperatur auch der wirksame Bestandteil
reagiert und eine Abtrennung nicht erreicht wird. Als indifferente Lösungsmittel
für diese Reaktion kommen vor allem Benzol, Benzin und andere Kohlenwasserstoffe
in Frage.
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Die Reinigung über die Ester auf Grund ihrer verschiedenen Löslichkeiten,
also z. B. durch Urnkristallisieren, Umfällen oder Verteilen in verschiedenen Lösungsmitteln,
bietet in vielen Fällen den besonderen Vorzug, daß dabei im Bestrahlungsprodukt
noch vorhandenes unverändertes 7-Dehydrocholesterin als sch-,verlöslicher Ester
abgeschieden werden kann und sich dadurch die umständlichere und kostspielige besondere
Abscheidung des Ausgangsmaterials mit Digiton:in erübrigt. Dies gilt insbesondere
für den Fall des Arbeitens mit dem Allöphansäureester (der vorzugsweise durch Einleiten
von Cyansäuregas in die Lösung des zu reinigenden Präparates in einem indifferenten
Lösungsmittel, vor allem Kohlensvassierstoff, gewonnen werden kann), und für die
Fraktionierung solcher Esterderivate, die als Säurekomponente die zur Trennung der
Bestrahlungsprodukte des Ergosterins bewährten Abkömmlinge der Benzoesäure (z. B.
3, 5-Dinitrobenzoesäure und ihr 4-Methylderivat) enthalten. Auch diese Säuren geben
mit 7-Delxydrocholesterin sehr schwerlösliche Ester. Die Fraktionierung der Ester
der Allophansäure (die natürlich auch mit Allophansäurechlorid gewonnen werden können)
zeichnet sich noch dadurch aus, daß dabei besonders leicht (in schwerlöslichen Anteilen)
ein reines Produkt erhalten wird, das der Allophansäureester eines neuen antirachitischen
Vitamins und das erste .kn. reiner Form dargestellte Derivat dieses '.Vitamins ist.
Der genannte Ester schmilzt bei 173 bis 17d.°, läßt sich aus Aceton umkristallisieren
und liefert auf die Formel Ces H,1s 03N2 passende Analysenwerte, Das freie Vitamin
läßt sich daraus leicht durch Verseifung gewinnen. Über seine Eigenschaften wird
unten noch gesprochen werden. Im übrigen wurde durch die soeben besprochene Reinigungsstufe
der vorliegenden Erfindung erstmalig bewiesen, daß der wirksame Bestandteil des
Bestrahlungsproduktes des 7-Dehydrocholesterins ein Alkohol ist.
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Bei der Anwendung der chromatographischen Adsorptionsanalyse, die
auf den russischen Chemiker Tswett zurückgeht und die in letzter Zeit besonders
für die Fraktionierung von -Naturprodukten Bedeutung gewonnen hat, auf den Gegenstand
der Erfindung können sowohl Fraktionen mit freien als auch solche mit veresterten
Alkoholgruppen angewendet werden. Als Adsorptionsmittel haben sich die verschiedenen,
für den in Rede stehenden Zweck geeigneten Formen des Aluminiumoxyds (z. B. hergestellt
nach Brockmann) besonders bewährt. Bei der Verwendung von Estern wurde dabei beobachtet,
daß im wesentlichen nur die Verunreinigungen von dem Adsorptionsmittel festgehalten
werden, so daß sich der gesuchte Vitaminester im Filtrat findet.
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Zur Kontrolle der in den einzelnen Verfahrensstufen erreichten Reinigungseffekte
sowie zur Feststellung, wo sich das Vitamin bei der Aufteilung der Rohpräparate
nach der Erfindung befindet, dient die Prüfung der Einzelfraktionen im Tierversuch
auf antirachitische Wirkung. Für die Ausarbeitung passender Trennungsverfahren tut
auch die Messung der Ultraviolettabsorption gute Dienste, da das neue antirachitische
Vitamin ein Maximum der Absorption bei 265 mu zeigt.
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Das UV-Spektrum des Verfahrensproduktes der Erfindung ist demjenigen
des Vitamins D2 außerordentlich ähnlich. Im wie üblich durchgeführten Rattenversuch
ist das neue antirachitische Vitamin mindestens so wirksam wie Glas Vitamin D2.
Bei der Beinweiche junger Hühner erweist es sich jedoch wirksamer als die rattenäquivalente
Dosis Vitamin D2. Diese Eigenschaft kommt auch dem natürlich vorkommenden antirachitischen
Faktor im Lebertran sowie dem bestrahlten Cholesterin zu, die sich dadurch von dem
aus Ergosterin durch Bestrahlung gewonnenen
Vitamin D2 unterscheiden,
die aber. bis heute noch nicht rein dargestellt worden sind. Bei sehr starker Überdosierung
ruft das nach der Erfindung gewonnene Vitamin bei Mäusen das gleiche Vergiftungsbild
hervor wie das Vitamin D aus bestrahltem Ergosterin und das aus Fischleberölen.
Sehr ausgeprägt ist' dabei .die starke Verkalkung der Organe bei Verabfolgung hoher,
aber noch nicht eigentlich toxischer Dosen. Beispiele i. Eine Lösung von io g bestrahltem
7-Dehydrocholesterin in So ccm Benzol wird mit 3 g Citraconsäureanhydrid versetzt
und io Tage lang unter Luftausschluß bei Raumtemperatur aufbewahrt. Danach wird
die Lösung bei niedriger Temperatur im Vakuum zur Trockne verdampft und der Rückstand
in 200 ccm luftfreiem Methanol gelöst. Nach Zusatz von Zoo ccm 25 °/oiger methylalkoholischer
Kalilauge wird das Ganze 2 Stunden lang in. einer Stickstoffatmosphäre auf 5o° erwärmt
und weitere 16 Stunden bei Raumtemperatur sich selbst überlassen. Das ausgeschiedene
Kristallisat, das im wesentlichen aus Ausgangsmaterial besteht, wird unter Luftau:sschluß
abgesaugt und mit luftfreiem Methanol gewaschen. Ausbeute: a,8 g. Filtrat und Waschmethanol
werden mit i 6oo ccm Wasser versetzt und dreimal mit je 5oo ccm niedrigsiedendem
Petroläther ausgeschüttelt. Aus der alkalischen Lauge fällt nach Zusatz von
300 ccm 16°/oi,ger Schwefelsäure das Addukt eines Bestrahlungsproduktes mit
Citraconsäure aus. Es wird abgesaugt, gründlich Mit Wasser gewaschen und im Vakuum
bei Raumtemperatur getrocknet. Ausbeute: r g. Der Schmelzpunkt des Rohproduktes
liegt bei etwa 12o°. Die vereinigten Petrolätherlösungen werden mit Wasser gewaschen,
getrocknet, filtriert und eingedampft. Das Ausziehen mit Petroläther sowie die weitere
Verarbeitung der Petrolätherlösung wird unter vollständigem Luftausschluß durchgeführt.
Der Rückstand der Petrolätherlösung im Gewicht von 5 g wird in 25 ccm luftfreiemt
Benzol gelöst und nach Zusatz von 8 ccm Pyridin und 5 g 3, 5-Dinitro-4-methyl-i-benzoylchlorid
2 Stunden lang in einer Kohlensäureatmosphäre auf 75° erhitzt. Das in üblicher Weise
aufgearbeitete Material wird in 4o ccm siedendem Aceton gelöst. Nach dem Erkalten
wird von i g auskristallisiertem 7-Dehydrocholesteryl-3, 5-dinitro-4-methyl-i-benzoat
abgetrennt, das nach einmaligem Umkristallisieren aus Aceton völlig rein erhalten
wird: tiefgelbe Nadeln vom Schmelzpunkt 2oi°, 121 D in Chloroform = - 43'.
Das Acetonfiltrat wird vorsichtig im. Vakuum zur Trockne verdampft, der Rückstand
in ioo ccin Normalbenzin gelöst. Diese Lösung wird unter Luftausschluß durch eine
Säule von Aluminiumoxyd filtriert (Aluminiumoxyd standardisiert nach Brockmann gemischt
mit dem gleichen Gewicht gepulverten Quarzsandes, Höhe der Säule 30 cm, Durchmesser
2 cm). Es wird mit ioo ccm Normalbenzin nachgewaschen. Im Filtrat befinden sich
75'/, des eingesetzten Esters.
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Nach vorsichtigem Entfernen des Lösungsmittels und Aufnehmen des Rückstandes
in Acetonmethanol läßt sich das 3, 5-Dinitro-4-methpl-i-benzoat des Vitamins in
kristallisierter Form abscheiden. Der Ester wird durch Umkristallisieren aus Acetonmethanol
gereinigt und schmilzt bei i22°. Die spezifische Drehung für die 2 °/oige Chloroformlösung
beträgt -E- io6°. Bei der Elementaranalyse werden auf die Formel C35 H48 O8 N2 passende
Werte erhalten.
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3 g dieses Esters werden durch Kochen (2o Minuten) mit 3o ccm 5 °/aiger
methylalkoholischer Kalilauge verseift. Die heiß vom Kaliumsalz der Methyl-dinitrobenzoesäure
abfiltrierte Flüssigkeit wird, auf - 20° abgekühlt. Nach 2tägiger Aufbewahrung bei
dieser Temperatur wird das auskristallisierte Vitamin D3 abgesaugt und aus go °/oigein
Aceton bei - 15° umkristallisiert. Das Vitamin bildet farblose Nädelchen vom Schmelzpunkt
81 bis 83° und der spezifischen Drehung in Aceton [a] D - + 84°. Die an der
Ratte ermittelte antirachitisch wirksame Grenzdosis beträgt o,o25 y, der an der
Maus bestimmte Giftgrenzwert liegt bei i5o y.
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2. io g bestrahltes 7-Dehydrocholesterin werden in So ccm Benzol gelöst.
Die mit 3 g Maleinsäureanhydrid versetzte Lösung bleibt verschlossen 5 Tage bei
Raumtemperatur stehen. Die weitere Verarbeitung erfolgt zunächst nach den Angaben
des Beispiels i. Der Rückstand der Petrolätherlösung, welcher die neutralen, nicht
mit Maleinsäureanhydrid in Reaktion getretenen Anteile enthält, wird in i So ccin
trockenem Benzol gelöst. In die mit E:i,s-Kochsalz-Mischung gekühlte Benzollösung
wird Cyansäuredampf eingeleitet, der durch thermische Zersetzung von iog Cyanursäure
gewonnen wird. Nach zweitägiger Aufbewahrung bei o° wird nochmals die gleiche Menge
Cyansäuregas eingeleitet. Das Reaktionsgemisch bleibt 3 Tage bei o° und einen weiteren
Tag bei Raumtemperatur sich selbst überlassen. Dann wird das Ungelöste abgesaugt
und gründlich mit trockenem Benzol gewaschen. Das so abgetrennte Material besteht
im wesentlichen aus Polymerisationsprodukten der Cyansäure, denen etwas 7-Dehydrocholesterylallophanat
beigemengt ist. Filtrat und Waschbenzol werden vorsichtig im Vakuum abgedampft,
der Rückstand in
siedendem Aceton gelöst. Nach 24stündigem. Aufbewahren
bei o° hat sich das Allophanat des Vitamins ausgeschieden. Es wird abgesaugt, mit
Aceton gewaschen und im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet. Ausbeute: i g. Der
Ester wird durch Umlosen aus Aceton gereinigt; er schmilzt bei 173 bis r74° und
wird zur Gewinnung des Vitamins in üblicher Weise verseift.
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3. Eine Lösung von io g 7-Dehydrocholesterin in 7oo ccm Benzol wird
2 Stunden lang mit Magnesiumfunken bestrahlt und anschließend im Vakuum auf das
halbe Volumen eingeengt. In diese Lösung wird im Abstand von 2 Tagen zweimal aus
je 2o g Cyanursäüre hergestelltes Cyansäuregas eingeleitet. Die weitere Behandlung
ist die gleiche wie im Beispiel 2. Die Ausbeute an reinem Vitaminallophanat vom
Schmelzpunkt 173 bis 174° beträgt 1,2 g.
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4. io g nach den Angaben des Beispiels 3 bestrahltes 7-Dehydrocholesterin
werden in r 5o cmg go l/oigem Alkohol gelöst und auf -:20' abgekühlt. Das auskristallisierte
Ausgangsmaterial wird abgesaugt, zweimal mit je 25 cm3 gekühltem go°%igem Alkohol
gewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 1;6 g. Das Filtrat- wird mit einer
Lösung von 3 g Digitonin in 150 cm3 90°/oigem Alkohol erwärmt und nach Absaugen
und Auswaschen des D.igitonidniederschlages auf ein Volumen von ioo ccm eingeengt.
Nach Zugäbe von 4oo cm' luftfreiem Wasser wird erschöpfend mit Petroläther ausgeschüttelt.
Die vereinigten Petrolätherauszüge hinterlassen nach der üblichen Verarbeitung 6,2
g Rückstand, der in Ätherpetroläther mit 3 g Citraconsäureanhydrid 6 Tage lang bei
Raumtemperatur stehengelassen wird. Die Trennung des Reaktionsgemisches in neutrale
und saure Anteile erfolgt nach den Angaben des Beispiels i. Die Neutralfrakt,ion
im Gewicht von 5 g wird in Benzinbenzol 4 : 1 gelöst und wie bei der chromatografischen
Adsorptionsanalyse durch ein Rohr mit 5oo g aktivem Aluminiumoxyd nach Brockmann
geschickt. Der mittlere Teil der Schicht enthält die Hauptmenge des Vitamins. Dieser
Teil wird mit Benzolmethanöl eluiert. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels hinterbleibt
ein Rückstand von 2,5 g, der mit der gleichen Menge 3; 5-Dinitrobenzoylchlorid in
trockenem Pyridin verestert wird. Der hierbei erhaltene Dinitrobenzoesäureester
des Vitamins läßt sich. aus Acetonlösting in gut ausgebildeten gelben Nadeln kristallisieren,
die nach dem Uinkristallisieren aus Aceton bei 129' schmelzen und bei der Analyse
auf die Formel C34H4a O6 N2 passende Werte liefern: Durch Verseifen dieses kristallisierten
Esters erhält man daraus das freie Vitamin, das irn Schutzversuch an der Ratte in
Tagesdosen von o,ö5 y noch antirachitisch vollwirksam ist.
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5. 40 g 7-Dehydrocholesterin werden in Ansätzen zu io g nach den Angaben
des BeisPiels 3 bestrahlt. Die Benzollösungen werden vereinigt, unter Luftausschluß
bei 5o° im Vakuum auf 2oö ccm eingeengt und mit 6o ccm Pyridin und 40 g 3; 5-Dinitrobenzoylchlorid
versetzt. Die Mischung wird in einer Kohlensäureatmosphäre 2 Stünden auf go° erhitzt.
Die weitere Verarbeitung kann unter Gutritt von Luft erfolgen. Die erkaltete Reaktionsmischung
wird mit 21 Äther verdünnt, gut durchgearbeitet und abgesaugt. Der Filterrückstand
wird zuerst mit Benzol, dann mit Äther und schließlich mit Wasser ausgewaschen.
Es werden so 15 g 7-Dehydrochölesteryldinitrobenzoat erhalten. Die Benzol- und Ätherwaschlaugen
werden mit der Mutterlauge vereinigt. Die ätherisch-benzolische Lösung wird mit
5 °/aiger Salzsäure und darauf mit 5 1%iger Natronlauge ausgeschüttelt, mit Wasser
neutral gewaschen und mit Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Vertreiben des Lösungsmittels:
im Vakuum wird ein braunes Öl erhalten, das mit ioo ccm Aceton aufgekocht
wird, wobei ein Teil des Materials ungelöst bleibt. Die erkaltete Lösung wird abgesaugt
und der Filterrückstand mit Aceton nachgewaschen. Auf diese Weise werden weitere
2,2 ;g 7-Dehydrocholesteryldinitrobenzoat isoliert,- worauf das Bestrahlungsprodukt
praktisch frei vom Dinitrobenzoat des Ausgangsmaterials ist. Die Acetonlösung wird
im Vakuum zur Trockne gedampft und der Rückstand in Zoo ccm Normalbenzinbenzol (4
: i) aufgenommen. Zur Abtrennung von Verunreinigungen wird diese Lösung unter schwachem
Vakuum durch eine Säule von 4o mm Durchmesser und etwa i in Länge gesaugt, die mit
i 5oo g einer Mischung aus gleichen Teilen Aluminiumoxyd (standardisiert nach Brockmann)
und Quarzsand beschickt ist: Die Säule wird mit 3 1 Normal- i benzinbenzol (4 :
i) nachgewaschen. Das intensiv gelbe Filtrat wird im Vakuum zur Trockne eingedampft
und der Rückstand unter Erwärmen in 4o ccm Aceton aufgenommen. Aus dieser Lösung
kristallisieren beim i Erkalten spontan 9,o g reines Dinitrobenzoat des Vitamins
vom Schmelzpunkt 135 bis 136°: und der Drehung (a] D = -j- 97° (in
Chloroform). Diese Daten ändern sich beim Umkristallisieren nicht. Die Mutterlauge
liefert 1 nach dem Einengen weitere 1,4,n Vitaminester.
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6. 31,69 7-Dehydrocholesterin werden in 4oo ccm Benzol gelöst und
in einer Quarzwalze 5 Stunden mit dein Magnesiumfunken i bestrahlt. Nachdem Abdestillieren
des Benzols im Vakuum wird der Rückstand in
5 ccm Pyridin gelöst
und nach Zugabe von 27 g Dinitrobenzoylchlorid a4 Stunden bei
Zimmertemperatur stehengelassen. Hierauf wird mit Wasser verdünnt, nach einiger
Zeit das pyridinhaltige Wasser abgegossen und der Rückstand mehrmals mit Wasser
und zum Schluß mit Methanol gewaschen. Hierauf wird der Rückstand mit etwa 1 1 Äther
ausgezogen und die ätherische Lösung vom Dinitrobenzoat des bei der Bestrahlung
unverändert gebliebenen 7-Dehydrocholesterins abgetrennt. Die ätherische Lösung
wird mit 5 °/Qi,ger Oxalsäure, hierauf mit Sodalösung und schließlich mit Wasser
gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft.
Der Rückstand wird mit i5o ccm Aceton versetzt. Die erhaltene Lösung wird abgekühlt,
wobei sich noch geringe Mengen 7-Dehydrocholesterindinitrobenzoat ausscheiden, das
abfiltriert und mit kaltem Aceton und Äther nachgewaschen wird. Das Filtrat wird
unter vermindertem Druck zur Trockne gebracht und der Rückstand mit 25 ccm
Äthermethanol aufgenommen. Beim Animpfen beginnt nach einiger Zeit die Kristallisation
des Vitamin-D3-Dinitrob,enzoats, die durch Stehenläs.sen der Lösung bei + 2° vervollständigt
wird. Die ausgeschiedenen Kristalle werden abfiltriert und mit Äthermethanol nachgewaschen.
Es werden auf diese Weise 10,7 g Rohprodukt vom Schmelzpunkt 132,5 bis 135° erhalten,
das sich durch Umkristallisieren leicht weiter reinigen läßt. Aus den Mutterlaugen
scheiden sich auch noch kleine Mengen des Vitamin-D3-Esters ab.
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3,5g des Dinitrobenzoats werden mit 35 ccm 5 °/oiger methylalkoholischer
Kalilauge 2o Minuten zum Sieden erhitzt. Das ausgeschiedene Kaliumsalz der Dinitrobenzoesäure
wird abfiltriert und das Filtrat auf - 15° abgekühlt. Nach 24 Stunden hat sich das
Vitamin D3 in feinen Nadeln abgeschieden, die durch Umkristallisieren aus verdünntem
Aceton bei tiefer Temperatur weiter gereinigt werden. Das Vitamin D3 schmilzt bei
81 bis 83'
und besitzt ein optisches Drehungsvermögen von
(in Aceton). Es ist leicht löslich in allen organischen Lösemitteln, unlöslich in
Wasser und durch Digitonin nicht fällbar. Es zeigt ein charakteristisches Adsorptionsmaximum
bei 265 mau (Extinktionskoeffizient e = 5z).