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Verfahren zur Reinigung und Gewinnung von Aureomycin Die Erfindung
betrifft die Reinigung von rohem Aureomycin sowie seine Gewinnung und ist eine Verbesserung
des Verfahrens nach Patent 869679, welches die Herstellung von Aureomycin durch
Beimpfen eines wäßrigen Nährmediums mit einer Kultur von Streptomyces aureofaciens
betrifft, wobei man eine Züchtung unter aeroben Bedingungen stattfinden läßt und
das Aureomycin aus der Fermentierungsflüssigkeit gewinnt.
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von rohem Aureomycin,
welches das Extrahieren einer wäßrigen sauren Lösung desselben mit Butanol in Gegenwart
eines Salzes, Abscheidung der Butanolschicht und Gewinnung des Aureomycins daraus
umfaßt. Die Wirkung des Salzes, welche in der Vergrößerung des Verteilungskoeffizienten
eines in Wasser derart löslichen Materials, wie es das Aureomycin ist, besteht,
ist ein bemerkenswertes Phänomen. Bezüglich verschiedener Theorien über den Aussalzeffekt
sei verwiesen auf Penrose S. Albright (vgl. Journal of the American Chemical Society,
59, 2o98 [i937]).
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Die Extraktion kann unter variierenden Säurebedingungen durchgeführt
werden. Die günstigsten Verteilungskoeffizienten werden zumeist bei -einem ziemlichen
Säuregrad erhalten, jedoch ist bei solchen sauren Lösungen die Korrosion häufig
ein wichtiges
Problem,' so .daß ein wirtschaftliches Gleichgeeicht
angestrebt werden muß zwischen dem Ansteigen der Korrosion und dem Ansteigen der
Acidität einerseits und den weniger günstigen -Verteilungskoeffizienten andererseits,
die bei der Erniedrigung der Acidität erhalten -werden. _ Die Auswahl des px-Bereichs
hängt weitgehend- von den wirtschaftlichen Bedingungen, insbesondere der Korrosion
ab. Da die übliche therapeutische Praxis Aureomycin als Hydrochlorid verlangt, so
wird es am zweckmäßigsten durch Verwendung eines Chlorids bei einem ziemlich niedrigen
px-Wert ausgesalzen, so daß das Aureomycin als Hydrochlorid gewonnen wird.
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Bei der Extraktion sind mehrmaliges Extrahieren und Extraktion im
Gegenstrom geeignete Hilfsmittel. Eine gefüllte Säule oder ändere Mittel, wie ein
Podbielniak-Extraktor oder eine Zentrifuge,können ebenso benutzt werden wie die
Abscheidung nach dem spezifischen Gewicht der Phasen bei der Extraktion.
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Die Temperatur, bei der die Extraktion stattfindet, wird teilweise
sowohl durch die Bedingungen der benutzten Apparatur als auch der Lösungsmittel
bestimmt. Temperaturen von 55° C insbesondere mit saureren Lösungen verursachen
keine unerwünschte Zersetzung des Aureomycins während der Behandlung, und da die
Lösungen in der Wärme weniger viskos sind, so ist eine raschere Extraktion möglich,
jedoch wächst dabei auch die Korrosionsgeschwindigkeit. Zimmertemperatur ist für
Operationen- im kleinen Maßstab zweckmäßig, und Temperaturen unter Zimmertemperatur
sind zufriedenstellend.
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Nach der Extraktion und Abscheidung des Extraktes von der wäßrigen
Schicht kann das Lösungsmittel wenigstens teilweise durch Destillation entfernt
werden. Normalerweise wird Vakuum vorgezogen, so daß die Temperatur nicht hoch genug
ansteigt, um Zersetzung zu verursachen.- Es ist vorzuziehen, jedoch nicht unbedingt
notwendig, daß die Temperatur unter etwa 50° C bleibt. Das Lösungsmittel wird 'so
-weit entfernt, bis das Aureorriycin in.der dann existierenden Form genügend konzentriert
ist; -um- beim- Erkalten auszukristallisieren, in welcher Foren es dann gewonnen
werden kann. Der Konzentrationsgrad hängt notwendigerweise von der Menge des bei
der Extraktion verwendeten Lösungsmittels. -und den vorliegenden Konzentrationen
ab, jedoch für wirtschaftliche Ansätze liegt er häufig für viele Bedingungen in
der Nähe von 1/1o mit den Grenzen von 5 bis 25 °/o des ursprünglichen Volumens.
Bereiche außerhalb können natürlich auch durch Einstellen der Extraktionsverhältnisse
verwendet werden, so daß sich eine bei diesen Bereichen leicht zu handhabende Aureomycinkonzentration
ergibt. Das Konzentrat kann dann gerührt und die Kristalle gewonnen werden. Etwaiges
Wasser wird mit dem Destillat abgehen, und der Rückstand ist im wesentlichen wasserfreies
Butanol. Die Kristalle können durch Filtrieren, Zentrifugieren, Dekantieren oder
irgendeine andere Art der Abscheidung entfernt, in einem geeigneten Lösungsmittel
gewaschen und gewonnen werden. Es wird eine verbesserte Ausbeute erhalten, wenn
das Konzentrat und die Waschlösung gekühlt werden. Waschen zuerst mit Äthanol, dann
mit Wasser und wieder mit Äthanol ergibt verhältnismäßig reine K=istalle,.'ohne
daß ein unverhältnismäßig großer Teil des Materials gelöst würde. Andere Lösungsmittel,
wie Methanol, die höheren Alkohole, Ketone usw. können auch verwendet werden und
werden die meisten Verunreinigungen aus den Kristallen entfernen. Das Produkt wechselt
normalerweise beim Waschen seine Farbe von ursprünglich dunkelbraun in ein helles
Gelb. Das Wasser entfernt die anorganischen Salze, welche etwa anwesend sein können.
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Salz kann bis zur Grenze seiner Löslichkeit vorhanden sein, jedoch
erweist sich häufig eine geringere Menge als praktischer. Die relative Wirksamkeit
der verschiedenen Lösungsmittel und der verschiedenen Salze kann aus den Beispielen,
die deren Verteilungskoeffizienten zeigen, ersehen werden. Bei Natriumchlorid erscheint
eine Menge von 3 bis 30 °j, besonders günstig.
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Die Menge des Lösungsmittels ist nicht besonders kritisch, und es
werden bessere Resultate bei Verwendung von größeren Volumina und Anwendung von
Mehrfach-, Gegenstrom- oder anderer besonders wirksamer Extraktionsmethoden erhalten.
Mit Butanol erhält man anscheinend bei mehrfacher oder Gegenstromextraktion von
2o bis 6o Volumprozent wirtschaftlich zufriedenstellende Ausbeuten- und mit 400,16-einen
zweckmäßigen und ökonomischen Kompromiß zwischen Ausbeute und Kosten für das Lösungsmittel.
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Die Erfindung -soll durch die folgenden Beispiele näher erläutert
werden, wobei die Wirksamkeit der verschiedenen Verteilungssysteme und gewisse spezifische
Gewinnungen, welche kommerziell besonders vorteilhaft sind, gezeigt werden. Änderungen
der in den Beispielen angegebenen Konzentrationen, Temperaturen und Zeiten liegen
-selbstverständlich im Bereich der Erfindung.
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Beispiel i Zu einer Fermentierungsmaische, welche lösliche Calciumsalze
enthält, wurde so viel z5°/Qiges Natriumhydroxyd zugegeben,. daß der pg-Wert auf
8,5 stieg. Die festen Substanzen wurden durch Filtration entfernt und wurden mit
einer verdünnten Säure, z. B. Schwefelsäure, bei einem pH-Wert von 1,4 zu einem
Volumen aufgeschlämmt, das annähernd 25 °/o des ursprünglichen Volumens der Maische
beträgt. Die Aufschlämmung wurde filtriert und wieder mit demselben Volumen Wasser
extrahiert, welches mit Schwefelsäure auf einen pn-Wert von 1,5 angesäuert war.
Die flüssigen Filtrate wurden vereinigt und 17 Gewichtsprozent, bezogen auf das
ursprüngliche Volumen, an Natriumchlorid zugegeben. Hierzu wurden q.o Volumprozent
Butanol gegeben und der Butanolextrakt nach einer genügend langen Zeit und nach
kräftigem Rühren zwecks Verteilung des Aureomycins zwischen dem Wasser und dem Butanol
abgetrennt. Der Butanolextrakt wurde bei einer Temperatur von nicht mehr als 5o°
C auf 1j5 seines ursprünglichen Volumens eingedampft und dann, nach dem Ansäuern
-mit Salzsäure auf einen pH-Wert von i, abgekühlt. ' Das Aureomycinhydrochlorid,
welches sich daraus in Kristallform abschied, wurde durch Filtration entfernt, mit
Wasser, mit Äthanol
und wieder mit Wasser gewaschen, wobei man eine
gute Ausbeute an verhältnismäßig reinem Aureomycin als Hydrochlorid erhielt.
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Um die optimalen Salzkonzentrationen bei einer bestimmten Acidität
zu ermitteln, wurde der Wert des Verteilungskoeffizienten
E = C Las"ngsmittel
I CWasser bestimmt. Man ließ Aureomycin als Hydrochlorid bei Zimmertemperatur mit
gleichen Volumina Butanol, das mit Salzwasser gesättigt war, und Salzwasser, das
mit Butanol gesättigt war, ins Gleichgewicht kommen. Der Verteilungskoeffizient
wurde durch Analyse der Lösungsmittel und der wäßrigen Schichten bestimmt, wobei
man die unten angeführten Mengenverhältnisse feststellte:
| Verteilungskoeffizient |
| Konzentration |
| CButanoZ |
| Na Cl . x = Cyy@aa |
| 9/10o ccm ptt = 2,8 ,I PH = 1,5 I
PH = I |
| o ......... 1,3 |
| 2 ......... 2,8 4,4 15 |
| 6 ........ 3,0 7,3 28 |
| io ......... 2,9 10,0 41 |
| 15 ......... 3,2 13'3 38 |
| 20 ......... 3,0 21,1 |
| 30 ......... 2,8 |
Beispiel 2 3o 1 fermentierte Maische wurden durch Zugabe einer Kalkaufschlämmung
auf einen pH-Wert von 8,7 eingestellt. Die resultierende Aufschlämmung wurde mittels
einer Filterhilfe auf der Platte und der Rahmenfilterpresse filtriert. Der Filterkuchen
.wurde dann mit 61 Wasser aufgeschlämmt, das auf einen pH-Wert von 1,4 eingestellt
war, was etwa 58o ccm 6 n-Salzsäure erforderte. Die Temperatur stieg auf 50° C.
Nach 15 Minuten langem Rühren wurde die Aufschlämmung filtriert. Der Filterkuchen
wurde mit weiteren 61 Wasser, die mit Salzsäure auf einen pil-Wert von 1,3 angesäuert
waren, wieder extrahiert, filtriert und die Extrakte vereinigt. Zu den vereinigten
wäßrigen Extrakten- wurden 2295 g Natriumchlorid und 1350 ccm n-Butylalkohol gegeben.
Die Wasser-Alkohol-Mischung wurde 15 Minuten lang gerührt, absetzengelassen und
die Schichten getrennt. Die wäßrige Schicht wurde mit demselben Volumen Butanol
noch dreimal erneut extrahiert. Die vier Butanolextrakte wurden vereinigt und im
Vakuum bei einer 50° C nicht übersteigenden Temperatur bis auf ein Volumen von
300 ccm konzentriert. Bei diesem Punkt bildete sich eine beträchtliche Kristallmenge.
Das Lösungsmittel wurde gekühlt, die Kristalle durch Filtration abgetrennt, mit
Wasser, Äthylalkohol und wieder mit Wasser gewaschen und dann im Vakuum getrocknet.
Die Gesamtausbeute betrug 35 %.
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Beispiel 3 Das Beispiel 2 wurde wiederholt, jedoch wurde das Alkalischmachen
durch Verwendung von 25°ioigem Natriumhydroxyd und das Ansäuern durch Verwendung
von 9 n-Schwefelsäure bewirkt. Innerhalb der Fehlergrenzen ergab sich bei der Ausbeute
keine beachtliche Differenz. Dieses Verfahren scheint etwas vorteilhafter wegen
des preislichen Vorteils von Schwefelsäure gegenüber Salzsäure.
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Beispiel 4 6o 1 einer fermentierten Maische wurden auf einen pH-Wert
von i,2 angesäuert, was etwa 1700 ccm 6 n-Salzsäure erforderte. Die Aufschlämmung
wurde unter Verwendung einer Filterhilfe auf einem kontinuierlichen Rötationsvakuumfilter
filtriert und der Mycelkuchen verworfen. Zu dem Filtrat wurden 6 kg Natriumchlorid
und 6 1 n-Butanol gegeben. Nach 15 Minuten langem Rühren ließ man die Schichten
sich durch Absetzenlassen abtrennen, und die Butanolschicht wurde entfernt. Die
wäßrige Schicht wurde noch weitere drei Male unter Verwendung von 6 1 Butanol bei
jedem Mal extrahiert, und die vier Butanolextrakte wurden vereinigt. Der Butanolextrakt
wurde im Vakuum von etwa 28 bis auf ein Volumen von 70o ccm konzentriert, bei welchem
Punkt das Aureomycinhydrochlorid aus der Lösung auskristallisierte. Der Inhalt des
Destillierapparates wurde abgekühlt und die Kristalle abgetrennt, mit Wasser, Äthylalkohol
und wieder mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. Es wurde eine Gesamtausbeute
von etwa 28 °,!o erhalten. Beispiel 5 301 einer fermentierten Maische wurden durch
Zugabe von etwa 130 ccm einer io°/oigen Suspension von Calciumhydroxyd auf einen
pH-Wert von 8,6 gebracht. Die Aufschlämmung wurde durch eine Platte und eine Rahmenfilterpresse
filtriert und der Filterkuchen in 61 Wasser aufgeschlämmt und bei Zimmertemperatur
mit g n-Schwefelsäüre auf einen pH-Wert von 1,5 eingestellt. Nach 15 Minuten langem
Rühren wurde die Aufschlämmung filtriert und der Filterkuchen abgetrennt. Der Filterkuchen
wurde mit weiteren 6 1 Wasser, das mit Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 1,4 gebracht
worden war, wieder extrahiert. Die Aufschlämmung wurde wieder filtriert und die
zwei Extrakte vereinigt. Die vereinigten wäßrigen Extrakte wurden dann bei einer
5o° C nicht übersteigenden Temperatur durch Destillation auf ein Volumen von 3,25
1 eingeengt. Ein während des Einengens gebildeter Niederschlag wurde abfiltriert,
und es wurde gefunden, daß er biologisch unwirksam ist. Er wurde deshalb verworfen.
Zu diesem klaren Filtrat wurden 30o ccm n-Butanol und goo g Natriumchlorid gegeben.
Die Mischung wurde gerührt, das Butanol durch Absetzenlassen abgetrennt und das
Konzentrat noch drei weitere Male mit Butanol extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt
und in einer Vakuumdestillationsapparatur verdampft, bis Aureomycinhydrochlorid
auszufallen begann. Dann wurde der Inhalt des Destillationsapparates abgekühlt und
das Aureomycinhydrochlorid durch Filtration gewonnen. Das Aureomycinhydrochlorid
wurde
mit Wasser, Äthanol und wieder mit Wasser gewaschen und dann getrocknet.
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Beispiel 6 6o 1 fermentierte Maische wurden mit Schwefelsäure auf
einen pH-Wert von 1,5 angesäuert, i 'Stunde gerührt und filtriert. Das Filtrat wurde
auf die Hälfte seines ursprünglichen Volumens, auf 30 1, durch Verdampfen im Vakuum
bei einer 5o° C nicht übersteigenden Temperatur konzentriert. Hierzu wurden 5,=
kg Natriumchlorid gegeben. Die Mischung wurde viermal mit je' 3 1 n-Butanol extrahiert.
Die i21 Extrakte wurden vereinigt und bei einem pH-Wert von 2,2 bis auf
750 ccm bei einer Temperatur von nicht mehr als 45° C konzentriert. Das Konzentrat
wurde mit 12 n-Salzsäure auf einen pH-Wert von 0,7
angesäuert und über Nacht
bei Zimmertemperatur stehengelassen. Die gebildeten Kristalle wurden von der Lösung
abfiltriert, mit Wasser, dann mit Alkohol gewaschen und getrocknet. Es wurde eine
Gesamtausbeute von 7104 des ursprünglichen Aureomycins erhalten. Beispiel 7 ioo
g rohes Aureomycm wurden in io 1 Wasser suspendiert und mit Salzsäure auf einen
pH-Wert von 2,5 angesäuert. Die Mischung wurde 2o Minuten lang unter Zugabe von
5o g Entfärbungskohle gerührt und die Lösung filtriert. Zu dem klaren Filtrat wurden
i,7 kg Natriumchlörid und 11 n-Butylalkohol gegeben. Nach dem Rühren wurden
die Flüssigkeiten absetzen gelassen und die Butanolschicht abgetrennt. Es wurden
noch drei weitere Butanolextrakte hergestellt, die wäßrige Schicht verworfen, die
Butanolextrakte vereinigt und im Vakuum bei einer. 50° C nicht übersteigenden Temperatur
auf 400 ecm konzentriert. Die Mischung wurde mit konzentrierter Salzsäure leicht
angesäuert, abgekühlt und das sich bildende gereinigte Aureomycinhydrochlorid daraus
durch Filtration abgetrennt. Die Kristalle wurden einmal mit Butanol, dann mit Äthanol
.und schließlich mit Wasser gewaschen. Die Reinheit der gewonnenen Kristalle war
bedeutend größer als die des Ausgangsmaterials.
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Viele Salze außer Natriumchlorid ergeben befriedigende Resultate.
Natriumjodid, Natriumbromid und Bariumchlorid sind besonders wirksam beim Aussalzen
des Aureomycins in die Lösungsmittelschicht. Natriumsulfat, Ammoniumsulfat, Kaliumsulfat,
Käliunichlorid, Magnesiumsulfat, Natriumoxalat, Arn,-moniumchlorid und Triäthylamirihydxochlorid
Bind ebenfalls gute Aussalzmittel. Natriumchlorid ist besonders billig und leicht
zugänglich und ist therapeutisch verhältnismäßig unschädlich, so daß beim Zurückbleiben
eines Teiles des Natriumchlorids in dem gereinigten Produkt- keine schädliche Wirkung
entsteht. Auch ist das -Hydrochlorid das therapeutisch bevorzugte Säuresalz und
wird mit einem Chlorid erhalten.
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Es sei erwähnt, daß bei der Gewinnung durch Lösungsmittelextraktion
eine um so größere Fraktion des. wirksamen Mittels gewonnen wird, je mehr Lösungsmittel
verwendet wird. Bei den obigen Beispielen enthält die erste Butanolextraktion eine
verhältnismäßig größere Menge an reinerem Aureomycin und kann gewünschtenfalls allein
gewonnen werden. Jedoch sind unter normalen Arbeitsbedingungen zusätzliche Extraktionen
wirtschaftlich, da sie die Kosten des therapeutischen Produkts reduzieren.