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Verfahren zur Gewinnung von Vitamin B12
Die Erfindung bezieht sich
auf die Gewinnung von Vitamin B12 aus Lösungen, welche neben Vitamin B12 noch andere
Verbindungen enthalten, insbesondere aus Kulturflüssigkeiten, wie sie z.B. durch
Fermentierung verschiedener Mikroorganismen unter Einschluß von Streptomyces grisieus
erhalten werden können.
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Vitamin B12 ist ein neues Vitamin der B-Reihe, dessen Isolierung
in kristalliner Form aus Leber durch eine Veröffentlidung von Rickes u. a. in «Science«
v. 16. 4. 48, 107, S. 396 und 397, bekanntgeworden ist.
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Wie aus den Berichten der genannten Autoren in »Science« v. 3. I2.
48, 108, S. 634 und 635, thervorgeht, kommt Vitamin B12 in einer Anzahl von Stoffen
vor. Die Abtrennung des Vitamin B1, aus den Ausgangsstoffen und die Gewinnung in
reiner Form bereitet aber große Schwierigkeiten, da seine Konzentration in den in
Betracht kommenden Stoffen sehr niedrig ist. In gewissen Kulturflüssigkeiten kommt
das Vitamin B12 nur in Mengen vor, die nicht den zehnmillionsten Teil der Flüssigkeit
überschreiten. Die infolge dieser extremen Verdünnung entwickelten Methoden zur
Isolierung und Reinigung von Vitamin B12 sind im industriellen Maßstab sehr schwierig
durchzuführen, zumal sie ganze Serien von Reinigungsstufen umfassen, die eine Spezialtechnik
erfordern, die ihrerseits bei großen Volumen an Ausgangsmaterial nur unter Schwierigkeiten
durchzuführen ist.
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Die größten Schwierigkeiten bei der Isolierung und Reinigung des
Vitamin B12 lagen aber nicht allein darin, daß es in Ausgangsmaterialien, wie den
verschiedenen Fermentierungsflüssigkeiten, nur in außerordentlich geringen Konzentrationen
vorliegt, sondern daß es in diesen Ausgangsmaterialien von Substanzen, die ihm außerordentlich
ähnlich sind, begleitet wird. Wenn auch die bis dahin benutzten Methoden zur Isolierung
von Vitamin B12 im allgemeinen eine Reihe von Reinigungsstufen einschließen, wie
Adsorptionsverfahren, Chromatographie und fraktionierte Fällung, so ist es doch
selbst mit diesen hoch spezialisierten Verfahren nicht möglich, zu verhindern, daß
beim Arbeiten in größerem Maßstab, wo von beträchtlichen Ausgangsmengen ausgegangen
werden muß, diese un,erwünschten, dem Vitamin B12 sehr ähnlichen Substanzen zusammen
mit dem Vitamin B12 in den letzten Reinigungsstufen auskristallisieren.
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Sollte das Vitamin B12 daher in großer Reinheit isoliert und gewonnen
werden, so waren dazu ganze Serien von Umkristallisationen aus Wasser oder einer
Mischung aus Wasser und einem organischen Lösungsmittel erforderlich. Diese bekannten
Verfahren, die Gewinnung von Vitamin B12 sowie seine Abtrennung von den ihm sehr
ähnlichen Nebenprodukten, waren außerdem von beträchtlichen Verlusten an Vitamin
Bl2 begleitet.
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Abgesehen davon, daß es nach den bisherigen Methoden nie möglich
war, aus den Ausgangsmaterialien die gesamte Menge Vitamin Bt2 zu isolieren, wurde
nach ihnen Vitamin B12 nur selten in mehr als go°loiger Reinheit gewonnen. Da dieser
Reinheitsgrad für klinische Zwecke nicht genügt, ist es augenscheinlich, daß hier
ein weites Feld für Verbesserungen der gegenwärtig vorhandenen industriellen Verfahren
liegt.
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Obgleich die Natur dieserVitamin-B12-ähnlichen Substanzen noch nicht
völlig untersucht ist, hat es den Anschein, daß diese Substanzen prächtigrot gefärbte
Verbindungen sind, die das Element Co enthalten. Sie üben anscheinend auch in verschieden
starkem Maße LLD-, Küken- und Anti-perniciosa-Aktivität aus. Allerdings sind sie
wesentlich weniger wirksam als das reineVitaminB12. Sie scheinen daher in chemischer
wie auch biologisch!er Hinsicht dem Vitamin Bl2 nahe verwandt zu sein. Um jedoch
ein im wesentlichen reines Vitamin B12 von mindestens 950/oiger Reinheit zu erhalten,
das zur Behandlung von Krankheiten, wie perniziöser Anämie, verwendet werden kann,
ist es wichtig, die Vitamin-'312-ähnlichen Substanzen vom Vitamin B12 abzutrennen.
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Gegenstand der Erfindung ist, Vitamin B12 von Vitamin-Bl2-ähnlichen
Substanzen abzutrennen und in einem Reinheitsgrad von mindestens 95 % zu isolieren.
Dazu wird ein verbessertes Trennverfahren benutzt, das die Isolierung von Vitamin
B12 in hauptsächlich reiner kristalliner Form, frei von natürlich, vorkommenden
VitamiB12-ähnlichen Verunreinigungen aus Fermentationsmedien und anderen natürlichen
Ausgangsmaterialien, gestattet, wobei das Trennverfahren entweder allein oder in
Verbindung mit den gegenwärtig bekannten Gewinnungsmethoden angewandt werden kann.
Dieses Trennverfahren besteht darin, daß eine Vitamin B12 und Vitamin-B2-ähnliche
Substanzen enthaltende Lösung einem Gegenstromverteilungsverfahren unter Benutzung
des Systems Wasser-Benzylalkohol unterworfen wird. Dabei bleiben die unerwünschten
Substanzen in bestimmten Fraktionen der Gegenstromverteilungsflüssigkeiten zurück,
während das Vitamin B12 abgetrennt und in einer Fraktion der Verteilungsflüssigkeit
konzentriert wird, aus der es leicht und im wesentlichen in reiner kristalliner
Form gewonnen werden kann.
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In den Zeichnungen zeigt Fig. I das Schema eines Gegenstromverteilungsverfahrens
mit acht Stufen (eight plate countercurrent distribution), Fig. 2 eine graphische
Darstellung der Resultate des Gegenstromverteilungsverfahrens, wobei von einem typischen
Vitamin~B12-I(onzentrat ausgegangen wird, das 80°/o reines Vitamin Bl2 (K* = 1,2),
15% einer Verunreinigung, die durch Kl = S, und 5 ovo einer Verunreinigung, die
durch K = 0,4 charakterisiert ist, enthält, und in dem System BenzylalhokdWWasser
gearbeitet wird.
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Das Gegenstromverteilungsverfahren wird in folgender Weise durchgeführt:
Das Gefäß 1 wird mit einer bestimmten Menge Wasser W1 und einer bestimmten Menge
Benzylalkohol B1 beschickt.
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Wie aus Fig. 1 zu entnehmen ist, wird in dem Wasser W1 das Vitamin-B12-Konzentrat
gelöst, bevor der Benzylalkohol zugegeben wird. Man kann aber auch umgekehrt verfahren
und das Vitamin-B12-Konzentrat in Benzylalkohol lösen.
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Dann schüttelt man die Mischung in Gefäß 1, das beim Arbeiten in
Laboratoriumsmaßstab ein Scheidetrichter sein kann, kräftig durch und läßt zur Entmischung
stehen. Währenddessen verteilen sich Vitamin B12 und die Verunreinigungen zwischen
der wäßrigen und benzylalkoholischen Phase.
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Nach der Entmischung wird die Benzylalkoholschicht B1 abgetrennt
und zu einer bestimmten Menge frischen Wassers W2 in Gefäß 2 gegeben.
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In das Gefäß I, das noch die wäßrige Schicht W1 enthält, wird eine
frische Menge Benzylalkohol B2 gegeben. Beide Gefäße werden dann kräftig geschüttelt,
wobei sich wiederum das Vitamin B12 und die Begleitstoffe auf die beiden Flüssigkeitsphasen
verteilen.
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Anschließend wird die Benzylalkoholschicht B1 aus Gefäß 2 abgezogen
und in Gefäß 3 eingefüllt, das eine frische Wassermenge W3 enthält. Die BenzylalkoholschichtB2
in Gefäß I wird abgezogen und in Gefäß 2 mit der Wasserschicht W2 übergeführt. Zu
Gefäß 1 mit der Wasserschicht W1 wird eine frische Menge Benzylalkohol B3 zugegeben.
Die drei Gefäße, die sich nunmehr im System befinden und die die Wasser- und Benzyl-*)
K = Verteilungskoeffizient (Cw C3), wobei unter Cv die Konzentration in Wasser und
unter C3 die Konzentration in Benzylalkohol zu verstehen ist.
alkoholschichten
W31B1, W21B2 und W1/B3 enthalten, werden erneut geschüttelt und dann zur Entmischung
stehengelassen.
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Dann wird die Benzylalkoholschicht B1 aus Gefäß 3 in Gefäß 4 mit
einer frischen Wassermenge W4 übergeführt, die Benzylalkoholschicht B2 aus Gefäß
2 in Gefäß 3, das die Wasserfraktion W3 enthält, die Benzylalkoholschicht B2 aus
Gefäß I in Gefäß 2 mit der WasserfraktionW2 übergeführt und in Gefäß I mit der Wasserfraktion
W1 eine frische Menge Benzylalkohol B4 gegeben.
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Wenn auf diese Weise acht Portionen frisches Wasser und frischer
Benzylalkohol in das System eingeführt sind, enthalten die acht Gefäße folgende
Wasser- und Benzylalkoholschichten: W81B1, W71B2, W61B3, W51B4 usw. Vergleiche die
Gefäße, die in der Zeichnung an der diagonalen Linie liegen.
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Das modifizierte Verfahren, auf das sich die punktierte Linie in
der Zeichnung bezieht, wird in gleicher Weise durchgeführt, nur mit dem Unterschied,
daß nur in zwei Gefäßen gearbeitet wird und nur zwei Portionen frischen Wassers
in das System eingeführt werden.
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Der Benzylalkohol B1 wird demgemäß in Gefäß I mit der Portion frischen
Wassers W1 geschüttelt und nach der Entmischung der beiden Schichten abgezogen und
in Gefäß 2 mit einer frischen Wassermenge W2 übergeführt, während die Wasserfraktion
W1 in Gefäß I mit einer frischen Menge Benzylalkohol B2 durchgeschüttelt wird. Nach
dem Entmischen wird die Benzylalkoholschicht B1 aus Gefäß 2 abgezogen und zwecks
Vereinigung mit später anfallenden Benzylalkoholfraktionen gesammelt. Die zweite
3enzylalkoholfraktion B2 wird dagegen aus Gefäß I in Gefäß 2 mit der Wasserfraktion
W2 übergeführt, während Gefäß I mit der Wasserfraktion W1 eine frische Benzylalkoholmenge
B3 zugefügt wird.
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Dieser Vorgang wird wiederholt, bis sieben Portionen Benzylalkohol
B1 bis B7 mit den beiden Wasserfraktionen W1 und W2 durchgeschüttelt sind. Die Benzylalkoholfraktionen
B1 bis B7, die die Hauptmenge an Vitamin B12 enthalten, werden vereinigt und auf
kristallines Vitamin B12 weiter aufgearbeitet. Will man die Aufarbeitung in wäßriger
Phase vornehmen, dann empfiehlt es sich, den Benzylalkoholfraktionen C H C13 zuzufügen,
um das aktive Material in die wäßrige Phase überzuführen.
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Auch die Wasserfraktionen W1 und W2, die noch etwas Vitamin B12 enthalten,
werden vereinigt und können erneut in das Verfahren gegeben werden.
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Wenn auch die Gegenstromverteilung schon früher bei bestimmten Gelegenheiten
mit anderen Lösungsmitteln angewandt wurde, so ist es dennoch überraschend, daß
man mit diesem einfachen Verfahren unter erfindungsgemäßer Verwendung von Benzylalkohol-Wasser
das Vitamin B12 in sehr reiner Form von den natürlich vorkommenden Vitamin-Bl2-ähnlichen
Begleitsubstanzen abtrennen kann. Dies ist besonders überraschend im Hinblick auf
die extreme Verdünnung, in der Vitamin B12 gewöhnlich in den Ausgangsmaterialien
vorliegt.
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Es werden die unerwünschten Begleitstoffe des Vitamin Bl2, die den
größten Prozentsatz der Verunreinigungen ausmachen, augenscheinlich in einem Verhältnis
von etwa 8 : 1 zwischen Wasser und Benzylalkohol verteilt, während andererseits
das vorhandene Vitamin B12 in einem Verhältnis von etwa 1,2 1 zwischen Wasser und
Benzylalkohol verteilt wird. Die Benzylalkoholendphase eines solchen zweiphasigen
Lösungsmittelsystems enthält den größten Teil des VitaminBt2, das im wesentlichen
frei von Begleitstoffen ist, da lediglich nur etwa ein Neunte der unerwünschten
Vitamin-Bl2-ähnlichlen Begleitstoff in die Benzylalkoholphase gehen, während die
restlichen acht Neunte in der Wasserphase bleiben.
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In manchen Fällen ist noch eine weitere Klasse von Verunreinigungen
beobachtet worden. Diese Verunreinigungen kommen weniger häufig vor und scheinen
ein Verteilungsverhältnis von etwa 0,4 : 1 zwischen Wasser und Benzylalkohol zu
haben. Bei der Gewinnung von Vitamin B12 in einem Reinheitsgrad von mehr als 950/o
kann diese Art von Verunreinigunaen häufig vernachlässigt werden.
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Wenn mehrfache Extraktionen, wie in Fig., 1 dargestellt ist, durchgeführt
werden, ist dieses Gegenstromverteilungsverfahren in bezug auf die Vitamin-B12-Gewinnung
so wirksam, daß es in einem Analysenverfahren zur Bestimmung der Vitamin-Bl2-Menge
in den FermSentationsflüssigkeiten sowie verschiedenen festen Zwischenprodukten
und sonstigen vitaminhaltigen Lösungen benutzt werden kann.
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Das Gegenstromverteilungsverfahren in Benzylalkohol und Wasser kann
auf verschiedene Weise in industriellem Maßstab durchgeführt werden. So kann z.B.
auch folgende modifizierte Ausführung der Gegenstromverteilung, die schematisch
in Fig. I dargestellt ist, angewandt werden.
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Eine bestimmte Menge mit Benzylalkohol gesättigtes Wasser wird in
zwei Extraktionsgefäße gefüllt und das zu reinigende feste Material in dem ersten
der beiden Gefäße gelöst. Zu diesem ersten Gefäß wird dann die gleiche Menge mit
Wasser gesättigter Benzylalkohol zugefügt und die Lösungsmittelmischung zur Beschleunigung
der Verteilung geschüttelt. Anschließend läßt man die Mischung stehen, trennt die
Benzylalkoholschicht ab und gibt sie in das zweite Extraktionsgefäß, schüttelt wiederum,
läßt nach Beendigung der Reaktion die Lösungsmittelmischung zur Entmischung stehen,
trennt die Benzylalkoholschicht ab und gibt sie in ein geeignetes Vorratsgefäß.
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Diese Gegenstromextraktionen werden mehrere Male, gewöhn,ljich sechmal
oder mehr, wiederholt, wobei jedesmal frische Portionen Benzylalkohol verwendet
werden. Nach Beendigung dieser Operationen werden die Benzylalkoholschichten vereinigt.
Die aus insgesamt sieben Portionen gebildete benzylalkoholische Lösung enthält ungefähr
94% des in dem behandelten Material enthaltenen Vitamin Bl2 und nur etwa 20% der
unerwünschten Vitamin-B-j2-ähnlichen Substanzen, die ein Verteilungsverhältnis (Cw:
CB) von 8 : 1 haben. Die Verunreinigungen, die in einem Verteilungsver-
hältuis
(Clv: CB) von etwa 0,4 : 1 vorliegen, gehen, wenn sie vorhanden sind, in die Benzylalkoholschicht.
Aus dieser benzylalkoholischen Lösung, in der das Vitamin B12 in wesentlich reinerer
Form vorliegt, kann das Vitamin B12 in verschiedener Weise ausgefällt werden. Auf
diese Weise wird ein oftmals 95- bis 100%iges Vitamin B12 in kristalliner Form erhalten.
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Durch eine vergrößerte Anzahl von Extraktionsgefäßen, die mit Benzylalkohol
gesättigtes Wasser enthalten, wird eine vollständigere Abtrennung der hauptsächlichsten
unerwünschten Nebenprodukte von Vitamin Bt2 erhalten Um in einem solchen Falle trotzdem
den gleichen Prozentsatz Vitamin B12 aus dem Ausgangsmaterial zu isolieren. erhöht
man vorzugsweise die Anzahl der Benzylalkoholportionen in dem Gegenstromverteilungsverfahren.
Mit dieser Methode werden bei sehr unreinen Vitamin-B12-haltigen Ausgangsmaterialien
sehr gute Ergebnisse erzielt.
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Häufig liegen Verunreinigungen, die durch ein Verteilungsverhältnis
(Cw : Cn) von o,4: I gekennzeichnet sind. in unerwünscht hohem Prozentsatz vor.
In einem solchen Fall können durch folgendes Verfahren diese Verunreinigungen nahezu
vollkommen entfernt werden, wobei ein nahezu 100%iges Vitamin B12 erhalten wird.
Dabei wird zunächst eine vollständige Gegenstromverteilung. wie sie in Fig. I dargestellt
ist, durchgeführt. Dann läßt man das Vitamin B12 aus den Benzylalkohollösungen der
Extraktionsgefäße einzeln auskristallisieren und isoliert die Kristalle, die einen
bestimmten Reinheitsgrad haben. Das reinste Vitamin B,2 wird aus den mittleren Gefäßen
gewonnen, während die Verunreinigungen, die durch ein Verteilungsverhältnis K =
(Cw : C3) 8 und 0,4 charakterisiert sind, sich hauptsächlich in den ersten bzw.
in den letzten Gefäßen ansammeln. Auf diese Weise wird im wesentlichen reines Vitamin
Blo von den bleiden Hauptarten von Verunreinigungen abgetrennt.
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Die vorstehenden Ausführungen gelten unter der Voraussetzung, daß
gleiche Mengen Benzylalkohol und Wasser verwendet werden. Man kann aber auch das
Mengenverhältnis von Wasser zu Benzylalkohol in dem Gegenstromverteilungsverfahren
innerhalb weiter Grenzen variieren, ohne dadurch die erzielbaren guten Ergebnisse
zu beeinträchtigen.
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Da dadurch jedoch das Verteilungsverhältnis von Vitamin B12 und den
begleitenden Verunreinigungen in den einzelnen Extraktionsgefäßen variiert werden
kann, kann das eine Änderung in der Anzahl der Extraktionsgefäße und infolgedessen
eine veränderte Anzahl von Wasser- und Benzylalkoholportionen in dem Gegenstromverteilungsverfahren
erfordern.
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Dieses Verfahren ist zur Behandlung von Ausgangsmaterialien mit einem
verhältnismäßig hohen Vitamin-B12-Gehalt von beispielsweise 10 bis 90% besonders
geeignet, ohne jedoch auf die Vitamin-B12-reichen Ausgangsmaterialien beschränkt
zu sein.
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Im Gegenteil, es kann zur Behandlung von Ausgangsmaterial mit selhr
verschiecienem Vitamin-G1-Gehalt verwendet werden. Es kann außerdem dazu benutzt
werden, um in Zwischenstufen bei Vitamin-B.,-Konzentraten, die auf im wesentlichen
reines Vitamin Bt2 in kristalliner Form aufgearbeitet werden sollen, andere Verunreinigungen
zu entfernen.
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So können z. B. nach diesem verbesserten Verfahren Fermentierungsflüssigkeiten,
die bei der Fermentierung von verschiedenen Mikroorganismen. insbesondere Streptomyces
griseus, erhalten werden, direkt und ohne vorhergehende Reinigung behandelt werden.
In den meisten Fällen unterwirft man jedoch die Fermentierungsflüssigkeit zunächst
einer Reihe von anderen Reinigungsverfahren, um die Hauptmenge an Verunreinigungen
zu entfernen und dabei ein verhältnismäßig Vitamin-B12-reiches Material zu erhalten,
aus dem anschließend mit Hilfe des Gegenstromverteilungsverfahrens das Vitamin B12
in im wesentlichen reiner und kristalliner Form erhalten werden kann.
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Die folgende Beispiele sollen das neue und verbesserte Verfahren
zur Gewinnung von Vitamin B12 in im wesentlichen reiner Form aus Konzentraten erläutern:
Beispiel I Eine Fermentierungsflüssigkeit von der Vergärung mit Streptomyces griseus
wird zur Absorption der aktiven Bestandteile mit Aktivkohle behandelt. Anschließend
wird die Aktivkohle mit wäßrigem Pyridin eluiert und das Eluat konzentriert. Die
aktiven Faktoren werden in Benzylalkohol gelöst und die dabei erhaltene Lösung an
aktivierter Tonerde chromatographiert. Man entwickelt die Kolonne mit Methanol,
fällt die Aktivfaktoren verschiedene Male mit Aceton aus der methanolischen Lösung
aus, wobei ein flockiger Niederschlag erhalten wird. Eine auf diese Weise erhaltene
Fällung von 40 g enthält etwa 2659 mg Vitamin-Bt2-ähnliche Substanzen, was sich
aus Messung der Absorptionsintensität bei 5500 Ä (einer charakteristischen Spitze
von VitaminBt2) und Vergleich mit dem bekannten Wert für reines Vitamin B12 ergibt.
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Die Fällung wird in Methanol gelöst, an aktiver Tonerde chromatographiert
und die Kolonne mit Methanol entwickelt. Das rotgefärbte, angereicherte Eluat enthält
2280 mg Vitamin-Bl-ähnliches Material, nachgewiesen durch die Absorptionsintensität
bei 5500 Ä. Das angereicherte Eluat wird konzentriert, anschließend mit Aceton Äther
gefällt, der Niederschlag in Nilethanol gelöst und mit Äther erneut gefällt. Der
Niederschlag wiegt nach dem Trocknen 5,93 g. Der Niederschlag wird dann in 100 ccm
Wasser, das mit Benzylalkohol gesättigt ist, gelöst. Diese Operation wird in einem
Zentrifugenrohr ausgeführt. Ein zweites Zentrifugenrohr wird mit 100 ccm Wasser,
das mit Benzylalkohol gesättigt ist, beschickt. Anschließend gibt man 100 ccm enzylalkohol,
der mit Wasser gesättigt ist, in das erste Rohr, schüttelt gut durch, zentrifugiert,
um die Wasser- und Benzylalkoholschichten zu entmischen, entfernt die Benzyl-
alkoholschicht
am unteren Ende des Rohres und führt sie in ein zweites Rohr über, wo das Durchschütteln,
Zentrifugieren und Entmischen wiedlerholt wird. Die Benzylalkoholschicht wird in
einem Sammelgefäß gesondert aufbewahrt. Sechs weitere 100-ccm-Portionen von mit
Wasser gesättigtem Benzylalkohol passieren die beiden Rohre in der gleichen Weise,
und die sieben auf diese Weise erhaltenen Alkoholschichten aus dem Sammelgefäß werden
vereinigt.
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Die vereinigten Benzylalkoholschichten werden im Vakuum bei 350 konzentriert,
um das Wasser zu entfernen, anschließend 4,2 1 Äther und 1,4 1 Aceton zu dem abgekühlten
Konzentrat zugefügt, wobei sich ein Niederschlag bildet, der abfiltriert und dann
in 400 ccm Methanol gelöst wird. Aus dieser Lösung fällt man mit 2 1 Äther einen
Niederschlag aus, den man abfiltriert, wiederum in 21 ccm Wasser löst und daraus
bei o bis 5° auskristallisieren läßt. Die Kristallisation erfordert etwa 15 Stunden.
Die Kristalle werden abzentrifugiert und bei o bis 5° mit Wasser gewaschen. Dann
löst man die Kristalle erneut in 100 ccm Wasser auf, filtriert die Lösung durch
eine Glasfrittennutsche, wäscht die Apparatur mit 20 ccm Wasser und vereinigt das
Waschwasser mit dem Filtrat. Zu dieser Lösung fügt man 1320 ccm Aceton und läßt
die Lösung bei Raumtemperatur I Stunde stehen. Dann fügt man weitere 240 ccm Aceton
hinzu und kühlt die Lösung 3 Stunden auf o bis SO ab. Dabei bilden sich Kristalle,
die abfiltriert und im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet werden. Auf diese Weise
werden gIo mg kristallisiertes Material erhalten. Eine Probe, die bei IOO° bis zur
Gewichtskonstanz getrocknet worden war, hatte 6,7% Gewichtsverlust, bedingt durch
die flüchtigen Anteile.
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Die getrocknete Probe enthält 95,1% eines Vitamin B12, wie durch die
Phasenlöslichkeitsanalyse hestimmt wurde, und ist 808 mg reinem Vitamin Bt2 äquivalent.
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Beispiel 2 4750 mg kristallisierbes Vitamin B,2, das analog Beispiel
I erhalten worden war, enthält auf Grund einer Bestimmung durch das Gegenstromverteilungsverfahren
4330 mg Vitamin, was einem Keinheitsgrad von 91,3 0/o entspricht. Durch weitere
Reinigungsoperation sollte das Material auf einen Reinheitsgrad von 95 % gebracht
werden.
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Zu dem Zweck werden die 4750 mg des kristallinen Materials einer
vollständigen achtstufigen Gegenstromverteilung zwischen wäßriger und benzylalkoholischer
Phase unterworfen (vgl.
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Fig. I), wobei die Phasen aus je 100 ccm Flüssigkeit bestehen. Am
Ende des Verteilungsverfahrens sind acht Gefäße, I bis 8, mit Wasser- und Benzylalkoholphasen,
die miteinander im Gleichgewicht stehen, vorhanden. (Acht Portionen Benzylalkohol
sind mit dem Wasser in Gefäß I durchgeschüttelt worden, sieben mit dem in Gefäß
2 usw.).
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Zu jedem dieser acht Gefäße werden I25 ccm Chloroform zugefügt, um
das aktive Material in die Wasserschicht überzuführen. Anschließendwerden die Wasserschichten
abgetrennt. Dann wäscht man jede Blenzylalkoholschicht mit weiteren 25 ccm Wasser
und vereinigt jedes Waschwasser mit der entsprechenden Wasserschicht. Jede auf diese
Weise erhaltene Wasserphase wird auf den Gehalt an festen Substanzen und den Vitamin-Bl2-Gehalt
durch Messung der Absorptionsintensität bei 550oÅ untersucht. Dann fügt man zu allen
Phasen I7 Volumteile Aceton hinzu, wobei sich beim Stehen Kristalle bilden. Die
Kristalle aus den Ge-Gefäßen 3, 4, 5 und 6 werden abfiltriert und getrocknet. Jede
Kristallportion wird mit Hilfe des Gegenstromverteilungsverfahrens auf Vitamin-B12-Gehalt
untersucht. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind folgender Tabelle zu entnehmFen.
| Gesamt- Max. Kristall- Reinheits- |
| Ge- menge Vitamin- menge grad |
| an festen BGblt |
| fäße Substanzen i2-ea w2sserrL er nstae |
| mg mg mg % |
| 1 195 73 - - |
| 2 640 440 - - |
| 3 950 970 902 98,o |
| 4 1320 1220 1220 99,5 |
| 5 1090 1000 967 98,0 |
| 6 590 620 460 91,0 |
| 7 264 260 - - |
| 8 66 70 - - |
Die Kristalle aus den Gefäßen 3, 4 und 5 haben den gewünschten hohen Reinheitsgrad.
Die Substanzen aus den Gefäßen I und 2, die den größten Teil der unerwünschten Begleitsubstanzen,
die durch ein Verteilungsverhältnis (Cw: CB) von etwa 8 : 1 charakterisiert sind,
enthalten, und die Substanzen von den Gefäßen 6,7 und 8, die nahezu die gesamten
unerwünschten Begleitsubstanzen, die durch ein Verteilungsverhältnis (Cw: CB) von
etwa 0,4 : I charakterisiert sind, enthalten, werden mit anderen ähnlichen Fraktionen
vereinigt und zur weiteren Reinigung wiederum der Gegenstromverteilung unterworfen.
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Das beschriebene Verfahren ist in Fig. 2 graphisch dargestellt, worin
die Konzentration der einzelnen Komponenten eines typischen Vitamin-B3.2-Konzentrates
nach einem achtstufigen Gegenstromverteilungsverfahren für jedes Gefäß aufgezeichnet
ist. Das Ausgangskonzentrat enthält im dargestellten Beispiel 80% eines Vitamin
B12 (K = 1,2), I50/o des Materials mit K = 8 und 5% des Materials mit K = 0,5. Aus
der Figur geht hervor, daß die höchsten Vitamin-B12-Konzentratonen in den mittleren
Gefäßen gefunden werden, die zu gleicher Zeit den niedrigsten Gehalt an den unerwünschten
Verunreinigungen aufwleisen. Gefäß 4 enthält z. B. 24,17 Gewichtsprozent des Ausgangskonzentrats,
das aus 23,3% Vitamin B12, 0,45% Substanzen mit K=8 und 0,42% Material mit K = 0,4
besteht. Damit sind 96.5 0/o' der vorhandenen Substanz in Gefäß 4 Vitamin B12.
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Durch Auskristallisation in der vorher bleschriebe-
nen
Weise erhält man aus diesem Gefäß ein mindestens 96,5 0/oiges VitaminBt2. Durch
wiederholte Kristallisation kann weitere Reinigung erzielt werden. Auf der anderen
Seite geht aus Fig. 2 hervor, daß in den ersten und letzten Gefäßen die Menge an
VitaminBç2 besonders gering und die der unerwünschten Verunreinigungen dagegen besonders
groß ist.
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Es ist klar, daß die störenden Nebenprodukte in den Ausgangskonzentraten
mengenmäßig etwas variieren, weiterhin ist einzusehen, daß die augenscheinlichen
Verteilungskoeffizienten der hauptsächlichsten Klassen von Verunreinigungen keine
absoluten, sondern nur angenäherte Werte darstellen. So können die in den mittleren
Gefäßen gefundenen Verunreinigungen mengenmäßig oft unter zuweilen auch über den
in Fig. 2 angegebenen Werten liegen.
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Im letzteren Falle wird durch Wiederholung des Verteilungsverfahrens
das Vitamin B12 in gewünschter Reinheit erhalten. Auf der anderen Seite kann in
einem einzigen Verfahren eine vollständi gere Trennung erreicht werden, wenn man
die Anzahl der Gefäße erhöht. Bei einer graphischen Darstellung dieses abgewandelten
Verfahrens würden die Kurven für K = 8 und K = 0,4 im Vergleich zu Fig. 2 nach links
und rechts verschoben und von der Spitze der Kurve für K = I,2 weiter entfernt sein.