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Verfahren zur Gewinnung von Vitamin B12 Die Erfindung betrifft die
Gewinnung von Vitamin B12 in erhöhten Ausbeuten aus Rohmaterialien, welche Substanzen
enthalten, die mit Vitamin B12 eng verwandt sind, aber merklich nielrigere physiologische
Aktivität, z. B. mit Bezug auf antiperniciöse Anaemie und Wirksamkeit als das Wachstum
von Tieren förderndes Mittel, aufweisen als Vitamin B12. Gegenstand der Erfindung
ist insbesondere ein neues Verfahren zur Umwandlung solcher Vitamin-B"-ähnlicher
Substanzen in Vitamin B12.
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Erfindungsgemäß wird Vitamin B12 aus einem Ausgangsmaterial, bestehend
aus Kulturflüssigkeiten, gewonnen, welches durch Züchtung von Vitamin B12 erzeugenden
Mikroorganismen in einem geeigneten Nährmedium entstanden ist, oder auch aus Konzentrationen
derartiger Kulturflüssigkeiten, indem das Ausgangsmaterial mit einer Cyanionen liefernden
Sub3tanz behandelt wird, wobei ein Reaktionsgemisch entsteht, das erhöhte Mengen
von Vitamin B12 enthält.
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Es sind bereits verschiedene Verfahren zur Gewinnung von Vitamin B12
aus Leber und aus Kulturflüssigkeiten bekannt. So haben z. B. Rickes ü. a. gezeigt,
daß Vitamin B12 aus durch Streptomyces griseus fermentierten Kulturflü..3sigkeiten
gewonnen werden kann (Science io8, 634bis638, Dezember z948). Pierce und seine Mitarbeiter
haben gezeigt, daß Vitamin B12 aus Kulturflüssigkeiten, die durch Fermentierung
mit Streptomyces aureofaciens entstanden sind, gewonnen werden kann (l. A. C. S.,
71, 2-95z).
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Es wurde gefunden, daß Kulturflüssigkeiten, welche durch Züchtung
von Vitamin B12 produzierenden Mikroorganismen entstanden sind, auch Fermentationsprodukte
enthalten,
welche mit Vitamin B12 nahe verwandt sind, aber nur einen Teil der Antiperniciosa-Aktivität
des Vitamins B12 aufweisen. Derartige Substanzen seien nachstehend als Vitamin-B"-ähnliche
Stoffe bezeichnet.
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Bei der Herstellung von Vitamin B12 in reiner Form bereitet die Entfernung
dieser Vitamin-BM ähnlichen Stoffe beträchtliche Schwierigkeiten. Infolge der engen
Verwandtschaft zwischen diesen Substanzen und Vitamin B12 ist die Abtrennung von
reinem kristallinen Vitamin B12 nur mit Hilfe von komplizierten und kostspieligen
Verfahren möglich.
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Wie gefunden wurde, ist es möglich, die Vitamin-B12-ähnlichen Substanzen
fast quantitativ in Vitamin B12 überzuführen. Hierdurch wird einerseits die Gewinnung
von reinem Vitamin B12 sehr vereinfacht, während gleichzeitig die Ausbeuten an Vitamin
B12 beträchtlich steigen.
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Erfindungsgemäß werden die V itamin-B" ähnlichen Substanzen mit einer
Substanz in Reaktion gebracht, welche Cyanionen liefert, und jene Substanzen dabei
in Vitamin B12 umgewandelt.
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Durch Behandlung von Kulturflüssigkeiten oder Konzentraten solcher,
welche sowohl Vitamin B12 wie auch Vitamin-B"-ähnliche Substanzen enthalten, mit
Cyanionen liefernden Stoffen erhält man stark vergrößerte Ausbeuten von reinem Vitamin
1312. Gleichzeitig wird, wie bereits obenerwähnt, die Isolierung von reinem Vitamin
B12 erheblich erleichtert.
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Die Umwandlung kann, wie weiter gefunden wurde, unter verschiedenen
Bedingungen unter Verwendung von verschiedenen Quellen für die Lieferung von Cyanionen
durchgeführt werden. Im allgemeinen verläuft die Reaktion bei inniger Berührung
der Vitamin-B12-ähnlichen Substanzen mit Cyanionen. Man kann z. B. Lösungen von
Vitamin-B" ähnlichen Substanzen mit Cyanionen liefernden Verbindungen, wie Metallcyaniden,
Ammoniumcyanid oder Cyanwasserstoff, behandeln. Geeignete Lösungsmittel sind z.
B. Wasser, wäßrig-organische Lösungsmittelgemische oder organische Lösungsmittel,
welche Cyanionen enthalten und in denen die Vitamin-B1.-ähnlichen Substanzen löslich
sind. Für praktische Zwecke hat sich die Durchführung der Reaktion in einem wäßrigen
Medium gut bewährt.
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Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, je Mol vitaminähnlicher Substanzen
mehr als z Mol Cyanionen anzuwenden, um eine vollständige Umwandlung zu erzielen.
Bei Behandlung einer wäßrigen Lösung von Vitamin-BMähnlichen Substanzen mit einem
Überschuß von Metallcyanid, z. B. Cyannatrium oder Ammoniumcyaniden in alkalischer
Lösung wird ein purpurfarbener Komplex als Zwischenprodukt gebildet. Bei diesem
purpurfarbenen Komplex scheint es sich um die gleiche Substanz zu handeln, wie sie
bei Zufügung von Natriumcyanid zu einer wäßrigen Lösung von Vitamin B12 gebildet
wird. Beim Ansäuern einer Lösung, welche diesen purpurfarbenen Komplex enthält,
nimmt die Lösung wieder die rote Farbe an, welche für Vitamin B12 charakteristisch
ist. Bei Abwesenheit eines Überschusses von nietallcy anid oder nicht alkalischem
pu ist die Ansäuerung nicht erforderlich, da der purpurfarbene Komplex nicht gebildet
wird. Bei Verwendung von Cyanwasserstoff wird der purpurfarbene Komplex auch dann
nicht gebildet, wenn der Cyanwasserstoff in beträchtlichem Überschuß angewendet
wird.
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Das durch die vorstehend beschriebene Reaktion erhaltene Vitamin B12
ist in jeder Hinsicht identisch mit dem Vitamin B12, das direkt aus Kulturflüssigkeiten
gewonnen wird. Diese Identität ist durch Vergleich von ultravioletten, sichtbaren
und infraroten Adsorptionsspektren, optischer Drehung, Elementaranalysen, Kristallstrukturen,
Schmelzpunkten, Phasenlöslichkeit, polarographischem Verhalten und Verteilungskoeffizienten
wie auch durch Vergleich der mikrobiologischen und physiologischen Aktivität bestätigt
worden.
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Zur Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung können Vitamin-B1,-ähnliche
Stoffe in verschiedenen Stufen ihrer Gewinnung aus Kulturflüssigkeiten mit Cyanionen
liefernden Stoffen in Reaktion gebracht werden. Die Kulturflüssigkeit kann z. B.
mit einer geringen Menge eines Cyanids, wie Kalium- oder Natriumcyanid, behandelt
werden. Ebenso können Konzentrate von Vitamin-B"-ähnlichen Stoffen allein oder in
Kombination mit Vitamin B12 mit einer Cyanionen liefernden Substanz behandelt werden.
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Wenn eine Kulturflüssigkeit, welche sowohl Vitamin B12 als auch Vitamin-B1,-ähnliche
Substanzen enthält, erfindungsgemäß behandelt wird, wird vorteilhaft die Cyanionen
liefernde Substanz im Überschuß zugefügt, um die Umwandlung der Vitamin-B" ähnlichen
Stoffe in Vitamin B12 zu bewirken. Alsdann wird das Vitamin B12 durch Adsorption
an ein geeignetes adsorbierendes Material, wie Fullererde, Aktivkohle u. dgl., der
Kulturflüssigkeit entzogen. Das Adsorbat kann als Zusatz zu Tierfutter zwecks Anreicherung
desselben mit Vitamin B12 Verwendung finden oder als Ausgangsmaterial für die Isolierung
von reinem Vitamin B12 dienen.
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Das Verfahren gemäß der Erfindung wird vorteilhaft unter Anwendung
eines Konzentrats von Vitamin-B"-ähnlichen Stoffen durchgeführt, da hierdurch das
Volumen der reagierenden Stoffe vermindert und Schw=ierigkeiten mit nicht in Reaktion
gegangenen Cyaniden und damit verbundene Gefahren vermindert werden. Das gleiche
gilt für die Behandlung von Vitamin B12 und Vitamin B12 enthaltende Lösungen, welche
ebenfalls vorteilhaft in Form von Konzentraten verarbeitet werden.
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Die Lösungen oder festen Konzentrate, welche Vitamin-B1,-ähnliche
Stoffe enthalten, werden erfindungsgemäß mit einer zur Lieferung von Cyanionen geeigneten
Substanz im Überschuß behandelt, und zwar in einer Art, welche innige Berührung
der Reaktionsteilnehmer und vollständigen Ablauf der Reaktion gewährleistet. Die
Mischung wird vorzugsweise gründlich gerührt und dann kurze Zeit, z. B. etwa
15 bis 45 Minuten, stehengelassen. Jede Substanz, die befähigt ist, einen
Überschuß an Cyanionen zu liefern, kann verwendet werden, wie z. B, flüssige oder
gasförmige Cyanwasserstoffsäure, ein Metallsalz oder Ammoniumsalz von Cyanwasserstoffsäure
oder
Mischungen von Metallcvanid und einer Säure, welche Blausäure
in situ zu bilden vermag. Die in neutralem oder alkalischem Medium anzuwendenden
Metallcyanide müssen selbstverständlich befähigt sein, unter den gegebenen Reaktionsbedingungen
Cyanionen zu liefern. Die Alkalicyanide und Erdalkalicyanide erfüllen diese Forderung.
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Wenn ein festes Konzentrat mit flüssiger oder gasförmiger Cyanwasserstoffsäure
behandelt wird, wird sie genügend ionisiert, um die erforderlichen Cyanionen in
Abwesenheit eines Lösungsmittels zu liefern. Es ist aber vorteilhaft, in Gegenwart
eines Lösungsmittels zu arbeiten.
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Die Reaktion zwischen Vitamin-B12 haltigen Stoffen und Salzen von
Cyanwasserstoffsäure wird in einem Lösungsmittel durchgeführt, in welchem das Salz
dissoziiert, wie z. B. Wasser, Alkoholen mit z bis 3 Kohlenstoffatomen und wäßrig-organischen
Lösungsmittelgemischen, in denen die Vitamin-B"-ähnlichen Stoffe und die die Cyanionen
liefernden Stoffe löslich sind. Beim Arbeiten im Fabrikationsmaßstab läßt sich der
Vorgang störungsfrei und wirtschaftlich in wäßrig-alkalischer Lösung durchführen.
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Die Vorschrift, Cyanionen im Überschuß anzuwenden, ist so zu verstehen,
daß mehr als die Menge, unterhalb welcher die Ausbeute an reinem Vitamin B12 sich
vermindert, anzuwenden ist. Es empfiehlt sich, diese Menge für jedes zu verarbeitende
Rohmaterial experimentell zu bestimmen, da die Zusammensetzung der verschiedenen
Kulturflüssigkeiten und Konzentrate beträchtlich variieren kann. Eine annähernde
Bestimmung der Menge der erforderlichen Cyanionen kann derart erfolgen, daß die
optische Dichte der zu behandelnden Probe unter Verwendung von Licht mit 55oo Ä
Wellenlänge (bei dieser Wellenlänge hat reines Vitamin B12 eine seiner charakteristischen
Absorptionsspitzen) gemessen wird. Der erhaltene Wert, der die dem anwesenden Vitamin
B12 zukommende Farbe veranschaulicht, zuzüglich dem der Vitamin-B12-ähnlichen Substanzen
wird als potentielles Vitamin B12 berechnet. Für jedes so errechnete Milligramm
von potentiellem Vitamin B12 werden vorzugsweise etwa o,5 bis 2 mg Cyanionen zugeführt,
was einem beträchtlichen Überschuß entspricht.
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Zusammen mit den Vitamin-B12 ähnlichen Substanzen sind gewöhnlich
noch zahlreiche, nicht identifizierbare Verunreinigungen vorhanden. Soweit diese
Verunreinigungen ebenfalls mit Cyanionen reagieren, ist es notwendig, einen genügenden
Überschuß dieser Ionen vorzusehen, um auch unter diesen Bedingungen eine vollständige
Umwandlung der Vitamin-B"-ähnlichen Substanzen zu gewährleisten.
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Wenn die Reaktion in wäßriger Lösung unter Verwendung eines Metallcyanids
bei einem alkalischen pu-Wert durchgeführt wird, ist die Bildung des obenerwähnten
purpurfarbenen Komplexes ein sichtbares Zeichen dafür, daß ein Überschuß von Cyanid
zugefügt worden ist. Die purpurfarbenen Komplexe können durch Ansäuern des Reaktionsgemisches
auf einen px-Wert von etwa 5 oder weniger in Vitamin B12 übergeführt werden. Zur
Ansäuerung können gebräuchliche Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure od. dgl., verwendet
werden.
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Es sei bemerkt, daß die Verwendung eines Überschusses von Cyanid nicht
unbedingt nötig ist, da eine beträchtliche Vergrößerung der Ausbeute an Vitamin
13,2 erhalten werden kann, wenn ein Betrag von Cyanid angewendet wird, , der nicht
mit allen Vitamin-B"-ähnlichen Stoffen reagiert. Es empfiehlt sich jedoch die Verwendung
eines Überschusses, da dieser die Maximalausbeute an Vitamin B12 liefert und das
schwierige Verfahren der Beseitigung der Vitamin-13,-ähnlichen Stoffe zwecks Gewinnung
von reinem Vitamin B12 überflüssig macht.
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Nach Beendigung der Reaktion kann das nicht in Reaktion gegangene
Cyanid durch Verdampfung bei einem sauren pH-Wert beseitigt werden. Die Verdampfung
kann bei einer Temperatur von etwa 5o bis 6o' durchgeführt werden; sie wird vorteilhaft
unter vermindertem Druck vorgenommen, bis der gesamte überschüssige Cyanwasserstoff
praktisch beseitigt ist. Wenn ein festes Konzentrat mit flüssigem oder gasförmigem
Cyanwasserstoff in Reaktion gebracht wird, kann das nicht in Reaktion gegangene
Cyanid durch Verdampfung im Vakuum oder bei Atmosphärendruck entfernt werden. Wenn
eine Lösung mit Cyanid in Reaktion gebracht wird, ist es manchmal ratsam, einen
Strom von Stickstoff oder Luft zwecks beschleunigter Entfernung von überschüssigem
Cyanid durchzuleiten.
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Nach Behandlung mit Cyanid, eventueller Ansäuerung und Entfernung
von überschüssigem Cyanid bzw. Cyanwasserstoff wird das Reaktionsgemisch zwecks
Gewinnung von reinem Vitamin B12 weiterbehandelt.
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Es sind bereits verschiedene Verfahren für die Gewinnung von reinem
Vitamin B12 aus solches enthaltenden Mischungen bekannt. Ein solches praktisch brauchbares
Verfahren besteht darin, daß eine Vitamin B12 enthaltende Lösung mit einem anorganischen
Salz, wie z. B. Ammoniumsulfat, Natriumchlorid, Natriumsulfat oder Aluminiumsulfat,
gesättigt, die gesättigte Lösung mit Benzylalkohol ausgezogen und der gewonnene
Auszug z. B. durch Erhitzung im Vakuum auf etwa 75 bis 8o° getrocknet wird, worauf
Äther zu der getrockneten benzylalkoholischen Lösung gegeben wird, um rohes Vitamin
B12 niederzuschlagen. Der Niederschlag wird dann in mit Benzvlalkohol gesättigtem
Wasser, das etwa 2 bis 3 °'o Eisessig enthält, gelöst. Diese Lösung und ein etwa
gleich großes Volumen Wasser, das mit Benzylalkohol gesättigt ist, werden in passende
Gefäße gegeben und anschließend mit etwa der gleich großen Menge von mit Wasser
gesättigtem Benzylalkohol extrahiert. Diese Extraktionen können so durchgeführt
werden, daß die beiden erwähnten Lösungen entweder kontinuierlich oder nacheinander
mit sechs bis acht Portionen mit Wasser gesättigtem Benzylalkohol extrahiert werden.
Die vereinigten Benzylaikoholextrakte werden getrocknet und dann mit Äther behandelt,
wobei gereinigtes Vitamin B12 niedergeschlagen wird. Durch Lösen des Niederschlags
in Wasser und Auskristallisieren kann man Vitamin B12 mit einem
Reinheitsgrad
von etwa 95 % gewinnen, das für medizinische Zwecke geeignet ist. Eine noch weitergehende
Reinigung kann durch Umkristallisieren aus `'Wasser erfolgen.
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Wenn der nach der Benzylalkoholextraktion erhaltene Niederschlag nicht
so weitgehend gereinigt ist, daß Vitamin B12 von einem 95%igen oder höheren Reinheitsgrad
durch Kristallisation erhalten wird, kann der Niederschlag weiter gereinigt werden,
indem man ihn in Methanol löst, das Vitamin B12 aus der Lösung durch Adsorption
mit Hilfe einer Kolonne von aktiver Tonerde entfernt und die Kolonne mit Methanol
entwickelt und eluiert. Das. angereicherte Eluat ergibt bei Behandlung mit Äther
einen neuen Niederschlag von gereinigtem Vitamin B12. Statt dessen kann die Weiterreinigung
auch durch eine Wiederholung des oben beschriebenen Extraktionsverfahrens mit Benzylalkohol
stattfinden. Bemerkt sei, daß wäßrige Rückstände aus der Benzylalkoholextraktion
und Fraktionen von Eluaten mit niedrigem Vitamin-13,-Gehalt bei der chromatographischen
Reinigungsstufe erneut mit Cyanionen behandelt werden können, um zusätzliche Mengen
von Vitamin B12 zu gewinnen.
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Die nachfolgenden Beispiele veranschaulichen die Überführung von Vitamin-B"
ähnlichen Stoffen mit Cyanionen in Vitamin B12 sowie die erfindungsgemäß erzielbaren
Ausbeuteerhöhungen an Vitamin B12. Beispiel i Etwa 8300 1 einer Kulturflüssigkeit,
welche mit Hilfe eines Stammes von S. griseus hergestellt wurde und eine LLD- (Lactobacillus
lactis Dorner) Aktivität von 463o Einheiten je Kubikzentimeter aufwies, wurde mit
Phosphorsäure auf pg 2,5 angesäuert, einer Vorklärungsfiltration mit Diatomeenerde
unterworfen, mit Natriumhydroxyd auf pg 7 bis 8 eingestellt und nochmals mit Diatomeenerde
filtriert. Das Filtrat wurde mit Aktivkohle behandelt, um die aktiven Faktoren zu
adsorbieren. Die abfiltrierte Aktivkohle wurde mit etwa i5o 1 n-Butanol 15 Minuten
gerührt, der Mischung etwa 115 1 Wasser zugefügt, ein Filtrierhilfsmittel zugesetzt
und die Mischung 45 Minuten lang gerührt. Die festen Bestandteile «wurden mittels
einer Korbzentrifuge entfernt und mehrmals auf der Zentrifuge mit einer Zusatzmenge
von etwa i5o 1 Wasser, das mit Butanol gesättigt war, gewaschen. Das Filtrat und
die Waschflüssigkeit wurden miteinander vereinigt und die Butanolschicht und Wasserschichten
getrennt. Die Wasserschicht, welche praktisch das gesamte LLD-aktive Material enthält,
wurde filtriert, um Kohlenfeinteilchen zu entfernen. Zu dem erhaltenen Filtrat,
etwa 3001, wurden etwa 45 1 Benzylalkohol und etwa 192 kg Ammoniumsulfat gegeben,
die Mischung 15 Minuten gerührt und dann i Stunde stehengelassen. Die Wasserschicht
wurde abgetrennt und nochmals mit etwa 301 Benzylalkohol ausgezogen. Die benzylalkoholischen
Extrakte wurden miteinander vereinigt und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet.
Das Volumen des getrockneten Extraktes betrug etwa So 1; die Volumenvergrößerung
beruht auf der Anwesenheit von Butanol. Die benzylalkoholische Lösung wurde mit
2o kg aktiver Tonerde chromatographisch behandelt. Nachdem die gesamte Lösung in
die Kolonne eingeführt war, wurde diese mit einer Mischung von Methanol und Aceton
i : 2 gewaschen, bis der Abfluß farblos war. Die Kolonne wurde dann mit Methanol
entwickelt und alle Eluate, welche rot gefärbt waren, gesammelt. Hierbei wurden
etwa 52 1 erhalten. Die rotgefärbte Flüssigkeit wurde im Vakuum unterhalb 35° auf
etwa 2 1 konzentriert und durch Zufügung eines Gemisches von i Volumen Aceton mit
4 Volumen Äther ein Niederschlag erzeugt, der portionsweise mit Methanol extrahiert
wurde, bis ein weißer Rückstand verblieb. Die optische Dichte der Methanollösung,
gemessen bei 5500 Ä, zeigte ein Maximum von 46o mg von Vitamin Bz. und Vitamin-B"-ähnlichen
Stoffen. Ein aliquoter Teil der Methanollösung wurde mit Äther behandelt und der
gebildete Niederschlag einer Gegenstromextraktion mit dem System Benzylalkohol-Wasser
unterworfen. Der maximale Betrag von vorhandenem Vitamin B12 wurde hierbei mit 187
mg bestimmt.
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Der Rückstand der Lösung wurde in zwei Hälften geteilt und die eine
Hälfte mit Äther behandelt. Der hierbei erhaltene Niederschlag wurde in etwa ioo
ccm Wasser gelöst. Zu der Lösung wurden 8 ccm wäßriges Kaliumcyanid (i °/o) unter
Umrühren zugefügt und die Lösung etwa 15 Minuten stehengelassen. Hierauf wurde mit
Chlorwasserstoffsäure auf etwa p$ = 4 angesäuert, dann 7o g Ammoniumsulfat zugefügt
und die Mischung mit drei Portionen Benzylalkohol von je 2o, io, io ccm ausgezogen.
Die benzylalkoholischen Auszüge wurden durch Erhitzen auf 75 bis 8o° im Vakuum getrocknet,
während die bei der Benzylalkoholextraktion zurückgebliebene Lösung filtriert und
zwecks Erzeugung eines Niederschlags mit Äther behandelt wurde. Der Niederschlag
wurde in 2o ccm Wasser, das mit Benzylalkohol gesättigt und mit o,5 ccm Eisessig
versetzt war, gelöst und die Lösung einem Gegenstromverteilungsverfahren mit dem
System Benzylalkohol-Wasser unterworfen. Die hierbei erhaltenen benzylalkoholischen
Lösungen wurden miteinander vereinigt, durch Erwärmen im Vakuum getrocknet und mit
Äther behandelt. Der hierbei erhaltene Niederschlag wurde in i,i ccm Wasser gelöst
und kristallisieren gelassen. Die Kristalle wurden durch Zentrifugieren abgetrennt
und durch Lösen in io ccm Wasser, Zufügen von etwa i2o ccm Aceton bis zur Trübung
und Stehenlassen zur Kristallisation gebracht. Das Gewicht der erhaltenen Kristalle
betrug nach Trocknen im Vakuum bei ioo° i27 mg. Der durch Gegenstromextraktion festgestellte
Reinheitsgrad betrug 95 °/o. Die Identität der erhaltenen Kristalle mit reinem Vitamin
B12 wurde durch Vergleich der physikalischen und chemischen Eigenschaften festgestellt.
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Die wäßrige Lösung, welche bei dem vorstehend erwähnten Gegenstromextraktionsverfahren
verblieb, wurde mit wäßrigem Kaliumcyanid weiterbehandelt, wieder angesäuert und
dann mit Kohlenstofftetrachlorid-Kresol 2 : i extrahiert und der Extrakt mit Äther
behandelt. Der hierbei gebildete Niederschlag wurde in einer geringen Menge Methanol
gelöst und wieder Äther zugefügt. Der so erhaltene Niederschlag
wurde
in 0,13 ccm Wasser gelöst und zur Kristallisation gebracht. Die Kristalle wurden
in einer Wasser-Aceton-Mischung 'umkristallisiert. Das Gewicht der erhaltenen Kristalle
betrug nach Trocknung bei ioo° im Vakuum 47 mg. Die Kristalle enthielten 73 °/o
reines Vitamin B12.
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Die zweite Hälfte der ursprünglichen methanolischen Lösung lieferte
bei einer Behandlung, welche der der ersten Hälfte entsprach, aber mit dem Unterschied,
daß die Cyanidbehandlung weggelassen wurde, eine Ausbeute von nur etwa 5o mg Vitamin
B12. Hieraus geht hervor, daß die Cyanidbehandlung eine dreifache Vergrößerung der
Menge des gewonnenen Vitamins B12 bewirkte.
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Weitere Versuche, bei denen nach Beispiel i, aber unter Anwendung
von Ammonium-, Barium- und Calciumcyanid (an Stelle von Kaliumcyanid) gearbeitet
wurde, führten praktisch zu gleich guten Ergebnissen. Auch hierbei wurde eine etwa
dreifache Erhöhung der Ausbeuten an Vitamin B12 erhalten. Beispiel 2 Ein Konzentrat
aus einer Kulturflüssigkeit von S. griseus, das Vitamin B12 und Vitamin-B,2-ähnliche
Substanzen enthielt, wurde durch Gegenstromextraktion mit Wasser und Benzylalkohol
gereinigt. Das Konzentrat hatte keine Vorbehandlung mit Cyanid erfahren. Das gereinigte
Material in den benzylalkoholischen Auszügen wurde zwecks Gewinnung von reinem Vitamin
B12 weiterbehandelt. Die wäßrigen Schichten, welche Vitamin-B"-ähnliche Stoffe,
eine geringere Menge von Vitamin B12 und unbekannte Verunreinigungen enthielten,
wurden miteinander vereinigt und mit Äther behandelt. Der hierbei gebildete amorphe
Niederschlag wurde abgetrennt und getrocknet. Eine Portion des amorphen Niederschlags
wurde für Vergleichszwecke aufgearbeitet. Einige andere Portionen wurden in der
nachstehend beschriebenen Weise mit Cyaniden behandelt a) Eine Portion des amorphen
Niederschlags wurde in Wasser gelöst und spektographisch analysiert. Adsorptionsspitzen
wurden bei 361o und 5200 beobachtet. Die Lösung wurde dann der Gegenstromextraktion
mit Wasser und Benzylalkohol unterworfen. Es zeigte sich, daß i mg des festen Ausgangsmaterials
nur o,112 mg Vitamin Bit enthielt.
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b) 1o,5 mg des amorphen Niederschlags wurden in 3 ccm Wasser gelöst
und 0,2 ccm flüssiger Cyanwasserstoff zugefügt. Die Lösung wurde kurze Zeit stehengelassen
und dann auf 5o bis 6o° erhitzt, um überschüssigen Cyanwasserstoff zu entfernen.
Spektographische Analysen zeigten Adsorptionsspitzen bei 361o, 5200 und 55oo
Ä, also eine Annäherung an das Vitamin-B12-Spektrum. Die Lösung wurde der Gegenstromextraktion
mit Wasser und Benzylalkohol unterworfen. Dabei zeigte es sich, daß o,22o mg Vitamin
B12 pro i mg des Ausgangsmaterials kommen, also ein Zuwachs von 96 °/o stattgefunden
hat.
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c) 9,6 mg des amorphen Niederschlags wurden in 2 ccm Methanol gelöst
und o,2 ccm flüssiger Cyanwasserstoff (wasserfrei) zugegeben. Die Lösung wurde 15
Minuten in einem Eisbad stehengelassen und dann bei 5o bis 6o° zur Trockne gebracht.
Der Rückstand wurde in Wasser gelöst. Die spektographische Analyse zeigte Adsorptionsspitzen
bei 3610, 5200 und 550o Ä, also Annäherung an das Vitamin-B"-Spektrum. Die wäßrige
Lösung wurde der Gegenstromextraktion mit Wasser und Benzylalkohol unterworfen,
wodurch ermittelt wurde, daß von der anwesenden Gesamtmenge von Vitamin B12 und
Vitamin-B"-ähnlichen Substanzen 81 °/o Vitamin B12 waren; das sind 0,219 mg Vitamin
B12 je Milligramm Ausgangsmaterial und bedeutet einen Zuwachs von 95,5 %.
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Bei Behandlung von Teilen des amorphen Niederschlags mit flüssigem,
wasserfreiem Cyanwasserstoff in Äthanol, Benzylalkohol und Kresollösung wurden entsprechende
Erhöhungen des Vitamin-B"-Gehaltes erzielt.
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d) 1o,8 mg des amorphen Niederschlags wurden innig mit 2,2 ccm flüssigem,
wasserfreiem Cyanwasserstoff gemischt und die Mischung stehengelassen, bis der Cyanwasserstoff
verdampft war. Der Rückstand wurde in Wasser gelöst. Eine spektographische Analyse
der Lösung zeigte Adsorptionsspitzen bei 361o, 52oo und 56oo Ä, also eine Annäherung
an das Vitamin-Bi.-Spektrum. Die wäßrige Lösung wurde der Gegenstromextraktion mit
Wasser und Benzylalkohol unterworfen, wobei sich ergab, daß von der vorhandenen
Gesamtmenge an Vitamin B12 und Vitamin-B"-ähnlichen Substanzen 81 °,/o Vitamin B12
waren. Dies entspricht o,198 mg Vitamin BI, je Milligramm Ausgangsmaterial, entsprechend
einem Zuwachs von 77 °/o.
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Beispiel 3 Etwa iiooo 1 Kulturflüssigkeit aus mehreren Ansätzen von
Kulturflüssigkeiten eines Stammes von S. griseus wurden der Behandlung mit Aktivkohle,
Ausziehung der Aktivkohle mit Butanol-Wasser, der Benzylalkoholextraktion und der
chromatographischen Behandlung und Niederschlagung im Sinne des Beispiels i unterworfen.
Die Feststoffe des Niederschlags wurden mit Methanol ausgezogen, bis ein weißer
Rückstand verblieb. Die erhaltene Methanollösung zeigt bei Messung 55oo Ä. Der Vergleich
mit reinem Vitamin B12 zeigte, daß 540 mg Vitamin B12 und Vitamin-Bi.-ähnliche Substanzen
anwesend waren. Der Methanollösung wurden zwecks Erzeugung eines Niederschlags Aceton
und Äther zugesetzt, bis die Flüssigkeit keine rosa Färbung mehr zeigte. Der Niederschlag
wurde in 300 ccm Wasser gelöst und mit wäßriger Natriumhydroxydlösung auf
pH = 8 eingestellt. Dann wurden 2,7 g Natriumcyanid zugegeben und die Lösung 40
Minuten unter gelegentlichem Umrühren stehengelassen. Die Lösung hatte Purpurfarbe;
ein Beweis dafür, daß ein ausreichender 1J`berschuß von Cyanid zugesetzt worden
ist. Die Lösung wurde dann mit Chlorwasserstoffsäure auf PH 3 eingestellt und zwecks
Entfernung des Cyanwasserstoffes Stickstoff durch die Lösung geleitet. Alsdann wurden
21o g Ammoniumsulfat zugegeben und mit Benzylalkoholportionen von 50, 25, 25 und
io ccm extrahiert. Die Extrakte wurden durch
Erwärmen auf 75 bis
8o° im Vakuum getrocknet und dann durch einen Sinterglastrichter filtriert. Das
Filtrat wurde mit Äther versetzt und der hierbei entstandene Niederschlag einem
Gegenstromextraktions- und Reinigungsverfahren mit Benzylalkohol und Wasser unterworfen.
Die hierbei erhaltenen Benzylalkoholextrakte wurden miteinander vereinigt, durch
Erhitzen auf 7o bis 8o° im Vakuum getrocknet und Äther zwecks Erzeugung eines Niederschlags
zugefügt. Der Niederschlag wurde in Methanol gelöst und chromatographisch mit aktiver
Tonerde behandelt. Die Kolonne wurde dabei mit Methanol entwickelt und der mit aktiven
Substanzen angereicherte Abfluß zwecks Erzeugung eines Niederschlags mit Äther versetzt.
Die Reste der chromatographischen Behandlung, welche 55oo Ä zeigten, was etwa go
mg Vitamin B12 entspricht, wurden weiterverarbeitet. Der Niederschlag wurde in 1,9
ccm Wasser gelöst und der Kristallisierung überlassen. Die roten Kristalle wurden
in 2o ccm Wasser gelöst, die Lösung filtriert, mit 2o ccm zusätzlichem Wasser ausgewaschen
und die Waschflüssigkeit der Lösung zugefügt. Alsdann wurden 52o ccm Aceton zugefügt,
kristallisieren gelassen, die Kristalle abzentrifugiert, mit Aceton gewaschen und
bei 56° im Vakuum getrocknet. Es wurden 32.4,7 mg roter Kristalle erhalten; eine
Probe der Kristalle verlor beim Trocknen bei ioo° 5 °;o ihres Gewichts. Die getrocknete
Probe bestand aus 94°'oigem Vitamin B12. Praktisch die gleichen Resultate wurden
erhalten, wenn die Cyanidbehandlung in wäßrigem Methanol und wäßriger Äthanoilösung
durchgeführt wurde. Beispiel 4 3 1 der mit Hilfe eines Stammes von S. griseus erhaltenen
Kulturflüssigkeit wurden mit 2,1 g in wenig Wasser gelöstem Natriumcyanid behandelt.
Die Lösung wurde 2 Stunden lang gerührt und mit konzentrierter Chlorwasserstoffsäure
auf PH = .4 gebracht. Alsdann wurde über Nacht derart evakuiert, daß Luft durch
die Lösung perlte. Nunmehr wurden der Lösung ZiSo g Ammoniumsulfat und
30 ccm Benzylalkohol zugefügt. Die Mischung wurde gerührt, alsdann stehengelassen
und die gebildete Benzvlalkoholschicht abgezogen. Die wäßrige Schicht wurde dann
nochmals mit 2o ccm Benzylalkohol und drei Portionen von je io ccm Benzylalkohol
ausgezogen. Die erschöpfte wäßrige Schicht wurde verworfen, die vereinigten Benzylalkoholauszüge
wurden mit 2 Raumteilen Chloroform verdünnt und dann mit drei Portionen Wasser von
je 5 ccm ausgezogen. io ccm der wäßrigen Lösung, enthaltend etwa 3ooooo LLD-Einheiten
per Kubikzentimeter, wurden einem 8-Stufen-Gegenstromextraktionsverfahren mit Benzylalkohol
unter Verwendung von io-ccm-Phasen unterworfen. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden
Tabelle veranschaulicht.
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31 der gleichen Kulturflüssigkeit wurden einer entsprechenden Behandlung
unterworfen mit dem Unterschied, daß kein Cyanid zugefügt wurde. Die ursprüngliche
wäßrige Lösung, welche durch Benzylalkoholextraktionen erhalten wurde, wurde dem
Gegenstromextraktionsverfahren mit Denzylalkohol unterworfen. Auch die hierbei erhaltenen
Ergebnisse sind aus der Tabelle ersichtlich.
| Prozentuale Verteilung |
| Rohre Unbehandelte Behandelte Reines |
| Nr. Kulturflüssigkeit Kulturflüssigkeit Vitamin B12 |
| 1 28,7 1.0 1.4 |
| 2 ig,i 6,1 8,3 |
| 3 23,4 29,0 20,9 |
| 4 15,5 29,2 29,1 |
| 5 5,4 20,9 24,2 |
| 6 3,9 11,2 12,1 |
| 7 2,6 °,6 3,3 |
| 8 0,7 o,9 0,4 |
Beispiel 5 Es wurde eine Kulturflüssigkeit verwendet, die durch Züchtung eines Stammes
von S. griseus entstanden ist. ioo 1 der Flüssigkeit wurden mit Salzsäure auf pg
2,5 angesäuert. Die Flüssigkeit wurde dann mit 22o mg Natriumcyanid behandelt und
io Minuten gerührt. Dann wurden ioo g Fullererde und ioo g Diatomeenerde zugefügt,
der erhaltene Schlamm
30 Minuten lang gerührt, das Adsorbat durch Filtration
abgetrennt und bei 5o° getrocknet. Das Adsorbat zeigte eine Aktivität von 843000
Einheiten pro Gramm. Es ist geeignet, das Wachstum von Hühnchen zu fördern.
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Bei der Behandlung mit Fullererde wird im wesentlichen das gesamte
in der Kulturflüssigkeit befindliche aktive Material adsorbiert. Da der @'itamin-B"
Gehalt der Kulturflüssigkeit durch die Cyanidbehandlung, wie u. a. aus Beispiel
4 ersichtlich, merklich vergrößert wird, wird auch der Vitamin-B"-Gehalt des Adsorbats
in entsprechendem Verhältnis vergrößert.