DE10035591A1 - Verfahren zur Isolierung von tetra-und pentacyclischen Triterpensäuren - Google Patents
Verfahren zur Isolierung von tetra-und pentacyclischen TriterpensäurenInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von tetra- und pentacyclischen Triterpensäuren aus diese enthaltenden biologischen Materialien, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man das in geeigneter Weise in Lösung gebrachte biologische Material einer Fällung mit einem oder mehreren Calcium- und/oder Magnesiumsalz(en) unterwirft und die Triterpensäure(n) als Präzipitat isoliert.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolie
rung von tetra- und pentacyclischen Triterpensäuren aus diese
Säuren enthaltenden biologischen Materialien, bevorzugt aus
dem Harz von Boswellia-Baumarten.
Tetra- und pentacyclische Triterpensäuren, insbesondere Bos
welliasäuren und deren Derivate, wie Acetyl-11-keto-β-Boswel
liasäure, 11-Keto-β-Boswelliasäure, Acetyl-β-Boswelliasäure
und β-Boswelliasäure, sind wertvolle Arzneimittel zur Behand
lung entzündlicher Erkrankungen. Sie kommen natürlicherweise
in verschiedenen Pflanzen, insbesondere in den Baumharzen von
Boswellia-Arten vor. Diese Harze sind jedoch komplexe Zusam
mensetzungen, die eine Vielzahl von Verbindungen umfassen. Die
pharmakologisch wertvollen Säuren müssen aus diesen Substanz
gemischen isoliert werden. Derzeit sind folgende Verfahren zur
Gewinnung von Zubereitungen für die pharmazeutische Anwendung
bekannt:
- - Verfahren nach Winterstein und Stein, (Z. Physiol. Chem.
208, 9 (1932)).
Dabei werden Boswellisäuren aus dem Etherextrakt als Ba riumsalze gefällt. Mit diesem Verfahren werden jedoch nicht alle Boswellisäuren in gleicher Ausbeute erfaßt.
Außerdem ist das Verfahren aufgrund des Einsatzes von Ba riumsalzen umweltökologisch und toxikologisch bedenklich. Verunreinigungen des Fällungsprodukts mit verharzenden Bestandteilen machen aufwendige Reinigungs- und Waschver fahren notwendig. - - Fällung mit Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid.
Diese beispielsweise in Tschirch und Halbey (Arch. Phar maz. 487-503 (1998)) beschriebenen Fällungen der Triter pensäuren mittels Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid in organischen Lösungen besitzen den Nachteil, daß auch an dere verunreinigende Harzbestandteile mitgefällt werden und die Produkte als Emulsionen oder Öle anfallen. Daher sind aufwendige Reinigungs- und Waschverfahren notwendig. - - Extraktion mit organischen Lösungsmitteln.
Es wurden auch Versuche unternommen, Boswelliasäuren mit organischen Lösungsmitteln, wie Ether, Petrolether, Hexan, etc., zu extrahieren. Dabei kommt es sowohl zu großen Verlusten an Boswelliasäuren als auch zu stark verunreinigten Produkten. Diese enthalten neben den cy clischen Triterpensäuren auch neutrale cyclische Triter pene, die die biologisch/pharmakologisch gewünschten Wir kungen der Boswelliasäuren antagonisieren. - - Einsatz von chromatographischen Methoden.
Auch Versuche, Boswelliasäuren mittels Flüssigkeits- oder Dünnschichtchromatographie zu reinigen, führten zu keinen befriedigenden Ergebnissen und ergaben unreine Produkte in geringer Ausbeute.
Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß keines der Verfah
ren aus dem Stand der Technik in wirtschaftlicher Weise zu
reinen tetra- und pentacyclischen Triterpensäuren in großen
Mengen führt. Vielmehr ergeben alle bisher durchgeführten Ver
fahren mit verharzenden Bestandteilen und/oder neutralen Ter
penen und weiteren Neutralstoffen verunreinigte Produkte in
schlechter Ausbeute mit einer pharmazeutisch nicht zufrieden
stellenden Konsistenz (sirupartig-klebrig oder gelblich-kleb
rig). Es besteht daher ein Bedarf nach einem wirtschaftlichen
Verfahren zur Gewinnung von tetra- und pentacyclischen Triter
pensäuren in hoher Reinheit.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde,
ein einfaches, wirtschaftliches und umweltschonendes Verfahren
zur Isolierung von tetra- und pentacyclischen Triterpensäuren
in hoher Reinheit bereitzustellen. Das Verfahren soll sich zur
selektiven Isolierung von tetra- und pentacyclischen Triter
pensäuren aus biologischen Materialen eignen. Mit dem erfin
dungsgemäßen Verfahren soll erreicht werden, daß pharmakolo
gisch bedenkliche Neutralstoffe (insbesondere cyclische Tri
terpene vom Nichtsäuretyp) mit biologisch antagonistischen
Wirkungen sowie klebrige Harzbestandteile mit pharmazeutisch
bzw. verarbeitungstechnisch problematischen Eigenschaften in
dem Endprodukt nicht mehr vorhanden sind. Ferner soll das Ver
fahren zu Produktmengen in industriellem Maßstab führen, die
pharmakologisch weiterverarbeitet werden können. Ferner soll
das Verfahren schonend sein und zu keiner nachteiligen Verän
derung der tetra- und pentacyclischen Triterpensäuren führen,
wie z. B. Epimerisierung. Das Verfahren soll sich ohne toxische
Chemikalien durchführen lassen.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß durch die Verwen
dung von Magnesium- und/oder Calciumsalzen auf schonende Weise
tetra- und pentacyclische Triterpensäuren in hoher Reinheit
und Ausbeute erhalten werden können. Insbesondere werden er
findungsgemäß die tetra- und pentacyclischen Triterpensäuren
ohne pharmakologisch oder pharmazeutisch unerwünschte Substan
zen aus der Neutralfraktion des biologischen Materials erhal
ten. Die erfindungsgemäß erhaltenen tetra- und pentacyclischen
Triterpensäuren eignen sich sehr gut für eine rationale Arz
neimitteltherapie.
Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Isolierung von
tetra- und pentacyclischen Triterpensäuren aus diese enthal
tenden biologischen Materialien, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß man das in geeigneter Weise in Lösung gebrachte bio
logische Material einer Fällung mit einem oder mehreren Calci
um- und/oder Magnesiumsalz(en) unterwirft und die Triterpen
säure(n) als Präzipitat isoliert.
Die Verwendung von Magnesium- und/oder Calciumsalzen zur Ge
winnung von tetra- und pentacyclischen Triterpensäuren wutde
bisher nicht beschrieben. Sie ist auch nicht naheliegend,
vielmehr wurde der Einsatz solcher Salze von Fachleuten ausge
schlossen. Die Fällung von Säuretyp-Triterpenen durch Alkali-
oder Erdalkali-Kationen muß bei alkalischem pH erfolgen, damit
die Carboxyfunktion der Triterpensäuren deprotoniert vorliegt
und eine Salzbildung stattfinden kann. Der Einsatz von Magne
sium- oder Calcium-Kationen wird (jedoch) von der Fachwelt
ausdrücklich ausgeschlossen, da im alkalischen Milieu sofort
die schwerlöslichen Hydroxide von Calcium und Magnesium aus
fallen würden (vgl. beispielsweise Hoernlein-Dissertation,
Universität Tübingen (1997), Seiten 132-134). Überraschender
weise wurde jedoch gefunden, daß die Schwerlöslichkeit der
Calcium- und Magnesiumsalze in alkalischem Milieu gerade für
die selektive Fällung der cyclischen Triterpensäuren von be
sonderem Wert ist.
Das Ausgangsmaterial für das erfindungemäße Verfahren sind
tetra- und pentacyclische Triterpensäuren enthaltende biologi
sche Materialien. Bevorzugt sind dies Pflanzen der Gattung
Boswellia, z. B. Boswellia serrata, Boswellia carteri und Bos
wellia Bhau-dajiana. Es können alle tetra- und pentacyclische
Triterpensäuren enthaltende Pflanzenbestandteile verwendet
werden. Bevorzugt wird jedoch das Harz dieser Pflanzen verwen
det.
Das Ausgangsmaterial wird in geeigneter Weise in Lösung ge
bracht. Hierzu kann das in geeigneter Weise zerkleinerte Aus
gangsmaterial mit organischen Lösungsmitteln, wie beispiels
weise Diethylether, Chloroform, Azeton, Hexan, Dichlormethan,
etc. extrahiert werden. Das Harz kann auch ohne Vorbehandlung
als Grani wie sie aus den Bäumen als Sekrete austreten einer
Extraktion unterworfen werden. Ferner kann das Ausgangsmate
rial pulverisiert werden und als solches extrahiert werden.
Das so in Lösung gebrachte Ausgangsmaterial wird nun einer
Fällung mit einem oder mehreren Calcium- und/oder Magnesium
salz(en) unterworfen. Dabei können beliebige Calcium- und/oder
Magnesiumsalze eingesetzt werden, beispielsweise anorganische
Salze, wie Hydroxid, Chlorid, Phosphat, Hydrogenphosphat, Car
bonat, Sulfat, Oxid, Nitrat, Fluorid, Bromid, etc. oder orga
nische Salze, wie Acetat, Fumarat, Citrat, Maleat, Lactat,
Formiat oder Ascorbat.
Bevorzugt werden Magnesiumacetat, -citrat, -fumarat, -chlorid,
-fluorid, -carbonat, -nitrat, -oxid oder -sulfat und Calcium
acetat, -ascorbat, -formiat, -lactat, -chlorid, -bromid,
-fluorid, -carbonat, -hydrogenphosphat, -nitrat, -oxid,
-phosphat und -sulfat verwendet.
Bevorzugter werden die Salze Magnesiumhydroxid, Magnesiumoxid
und Calciumhydroxid, Calciumoxid verwendet. Die Magnesium-
oder Calciumsalze können einzeln oder im Gemisch verwendet
werden. Es ist auch möglich, reine Magnesium- bzw. Calciumsal
ze einzusetzen. Für die Fällung werden die schwerlöslichen
Salze als stark übersättigte Lösungen bzw. Suspensionen in
Wasser und/oder Alkohol und/oder als Gemische von Wasser mit
organischen Lösungsmitteln, wie beispielsweise Ether, Dichlor
methan, Aceton, Hexan, Methanol, Ethanol, Butanol, Ethylacetat
und entsprechenden Lösungsmitteln eingesetzt.
Die übersättigte Lösung aus den Calcium- und/oder Magnesium
salzen kann noch weitere Verbindungen enthalten um die Hand
habbarkeit und technologischen Eigenschaften der Lösung zu
verbessern, z. B. um Micellen- bzw. Emulsionsbildung zu vermei
den, z. B. weitere Elektrolyte, wie z. B. Natriumchlorid, Natri
umsulfat, oder Alkohole, wie z. B. Butanol, und/oder Struktur
brecher, wie z. B. Harnstoff, Thioharnstoff, oder hydrophile
Polymere, wie PVP oder PEG, und/oder Basen oder Säuren, um die
spontan sich einstellenden pH-Werte zu modifizieren, wie z. B.
Ammoniak, NaOH, KOH, TFA, HCl, Essigsäure oder ähnliche Ver
bindungen. Derartige Verbindungen sind einem Fachmann bekannt
und lassen sich anhand von einfachen Routineversuchen auswäh
len.
Die Fällungslösung wird üblicherweise in einem Verhältnis von
1 g pro 5 g Pflanzenmaterial eingesetzt. Bevorzugt werden ein
gesetzt: pro Mol Säure im Harz, 2 bis 4 Mol Magnesium oder
Calcium.
Genauer wird hierzu der Gehalt der Haupt-Boswelliasäure-Ver
treter mittels rpHPLC-UV im Ausgangsharz bestimmt. Diese ma
chen ca. 80% Triterpensäuren im Harz aus. Das Magnesium- bzw.
Calciumsalz bzw. die Magnesium- bzw. Calciumsalze werden hier
zu in einem 2- bis 4-fachen Überschuß auf Molbasis (Triterpen
säure zu Magnesium- bzw. Calciumkationen) eingesetzt, d. h. pro
Mol der Boswelliasäuren werden 2 bis 4 mol Magnesiumkationen
oder Calciumkationen zugesetzt. Natürlich kann auch mit äqui
molaren Mengen oder mit noch größeren Magnesium- oder Calci
umüberschüssen gearbeitet werden. Die Überschüsse bringen kei
nen zusätzlichen Vorteil, sind aber auch nicht nachteilig. Das
optimale Verhältnis kann leicht von einem Fachmann anhand ein
facher Routineversuche ermittelt werden.
Die Fällung wird durch einfaches Vermischen des gelösten bio
logischen Materials mit der Fällungslösung, bevorzugt bei al
kalischem pH-Wert und bei Temperaturen im Bereich von 0°C bis
Raumtemperatur, bevorzugt zwischen 4°C bis 10°C durchgeführt.
Die Magnesium- und/oder Calciumsalze der tetra- und pentacy
clischen Triterpensäuren lassen sich z. B. durch Filtration,
Sedimentation oder Zentrifugation abtrennen. Sie sind nach Wa
schen mit geeigneten Lösungsmitteln, wie beispielsweise Die
thylether, Hexan, Chloroform, Dichlormethan, Petrolether Ace
ton, Alkohole, praktisch frei von harzigen Verunreinigungen
und können als solche zur weiteren Verarbeitung eingesetzt
werden. Durch Zusatz einer geeigneten organischen oder anorga
nischen Säure, wie Salzsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure,
Phosphorsäure, Essigsäure, Weinsäure, Milchsäure, können aus
den Calcium-/Magnesiumsalzen die reinen tetra- und pentacy
clischen Triterpensäuren gewonnen werden.
Beispiele für tetra- und pentacyclische Triterpensäuren, die
nach dem erfindungsgemäßen Verfahren isoliert werden können,
sind polycylische Triterpensäuren, wie Boswelliasäuren (Ace
tyl-11-keto-β-Boswelliasäure, 11-Keto-β-Boswelliasäure, β-
Boswelliasäure, Acetyl-β-Boswelliasäure, Acetyl-11-hydroxy-β-
Boswelliasäure, 11-Hydroxy-β-Boswelliasäure, Acetyl-α-Boswel
liasäure, a-Boswelliasäure und weitere seltenere Polyhydroxy-
α- und β-Boswelliasäuren) und Tirucallsäuren (3-oxo-Tirucall
säure, 3-Acetyl-Tirucallsäure und 3-Hydroxy-Tirucallsäure).
Das Produkt enthält die folgenden Boswelliasäuren in hohen An
teilen, aus dem diese in hoher Ausbeute und Reinheit isoliert
werden können:
Acetyl-11-keto-β-Boswelliasäure, 11-Keto-β-Boswelliasäure,
Acetyl-β-Boswelliasäure und β-Boswelliasäure.
Durch die hohe Reinheit der erfindungsgemäß isolierten Pro
dukte können auf die biologische Wirkung standardisierte phar
mazeutische Produkte formuliert werden.
Die beigefügten Figuren erläutern die Erfindung näher.
Die Fig. 1 ist ein Fließschema, in dem das erfindungsgemäße
Verfahren übersichtsartig dargestellt ist.
Die Fig. 1A zeigt eine allgemeine Übersicht über das erfin
dungsgemäße Verfahren.
Die Fig. 1B zeigt eine beispielhafte Ausführungsform des er
findungsgemäßen Verfahrens.
Die Fig. 2A-C zeigen W-rpHPLC-Fingerprints des Ausgangsma
terials (A: Orginalharz, B. serrata-Harz) des Etherauszuges
aus dem Harz (B: DEE-Extrakt) und der Produkte der Magnesium
salzfällung nach Gewinnung der freien Säuren (C: Säure-Pro
dukt) in zwei Systemen. Es wurden jeweils 33,3 µg auf eine
rpHPLC-Säule aufgetragen und die Elutionsprofile jeweils bei
210 und bei 260 nm detektiert. Bezüglich der experimentellen
Bedingungen wird auf Beispiel 1 verwiesen.
Es wurden die folgenden rpHPLC-W-Bedingungen für die Analytik
verwendet:
Säule: Shandon ODS 5 µm; 250 × 4 mm
mit Vorsäule 5 × 4 mm;
Laufmittel: Methanol/Wasser/TFA (91 : 9 : 0.007, v/v);
Elutionsgeschwindigkeit: 1,2 ml/min;
Injektionsvolumen: 10 µl;
Säulentemperatur: 33°C;
Detektionswellenlängen: 210 und 260 nm.
Laufmittel: Methanol/Wasser/TFA (91 : 9 : 0.007, v/v);
Elutionsgeschwindigkeit: 1,2 ml/min;
Injektionsvolumen: 10 µl;
Säulentemperatur: 33°C;
Detektionswellenlängen: 210 und 260 nm.
Die Fig. 3 zeigt die Elutionsprofile des Ausgangsmaterials
(B. carteri, Bhau-dajiana-Harz) und des Produktes (Säurepro
dukt) nach Trennung auf einer rpHPLC-Säule bei zwei Wellenlän
gen (260 nm und 210 nm). Bezüglich der Versuchsdurchführung
wird auf Beispiel 2 verwiesen. Es wurden dieselben experimen
tellen Bedingungen wie in Fig. 2 angegeben verwendet.
Die Fig. 4 zeigt die UV-HPLC-Elutionsprodukte der freien Säu
reprodukte, die als Produkte der Calciumfällung erhalten wur
den, gemessen bei zwei verschiedenen Wellenlängen. Bezüglich
der Versuchsdurchführung wird auf Beispiel 3 verwiesen. Es
wurden folgende rpHPLC-UV-Bedingungen für die Analytik verwen
det:
Säule: Shandon ODS 5 µm; 250 × 4 mm
mit Vorsäule 5 × 4 mm;
Laufmittel: Methanol/Wasser/TFA (91 : 9 : 0.007, v/v);
Elutionsgeschwindigkeit: 1,2 ml/min;
Injektionsvolumen: 10 µl;
Säulentemperatur: 33°C;
Detektionswellenlängen: 210 und 260 nm.
Laufmittel: Methanol/Wasser/TFA (91 : 9 : 0.007, v/v);
Elutionsgeschwindigkeit: 1,2 ml/min;
Injektionsvolumen: 10 µl;
Säulentemperatur: 33°C;
Detektionswellenlängen: 210 und 260 nm.
Die Fig. 5 zeigt den dünnschichtchromatographischen Vergleich
der Produkte der Magnesium-, Calcium- und Natriumfällungen auf
der Stufe der freien Säureprodukte nach der Hydrolyse.
DC-Platte: Merk Kieselgel Si60F254;
Laufmittel: Dichlormethan/Methanol/Aceton/Essigsäure (92 : 6 : 2 : 0,1);
Sprühreagenz: 10% Acetanhydrid und 10% konzentrierte Schwe felsäure in absolutem Ethanol;
Detektion: UV bei 254 nm und nach Entwicklung bei 120°C für 5 min.
Laufmittel: Dichlormethan/Methanol/Aceton/Essigsäure (92 : 6 : 2 : 0,1);
Sprühreagenz: 10% Acetanhydrid und 10% konzentrierte Schwe felsäure in absolutem Ethanol;
Detektion: UV bei 254 nm und nach Entwicklung bei 120°C für 5 min.
Aufgetragen wurden neben Standardsubstanzen jeweils 10 µg der
Produkte der Fällungen der Calcium-, Magnesium- und Natrium-
Fällungsverfahren nach vergleichbarer (identischer) Wäsche mit
Ether.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläu
tert.
Fällung des Harzes von Boswellia serrata mit Magnesiumsalzen.
Ausgangsmaterial:
50 g (aus Indien, Harz von Boswellia serrata).
50 g (aus Indien, Harz von Boswellia serrata).
Chemische Ausgangsanalyse:
1,58% Acetyl-11-keto-β-Boswelliasäure (AKBA)
1,58% 11-keto-β-Bowelliasäure (KBA)
4,11% Acetyl-β-Boswelliasäure (Ac-BA).
1,58% Acetyl-11-keto-β-Boswelliasäure (AKBA)
1,58% 11-keto-β-Bowelliasäure (KBA)
4,11% Acetyl-β-Boswelliasäure (Ac-BA).
Schritt 1:
Extraktion mit Diethylether (250 ml) einer Soxhlett-Apparatur:
verbleibende nicht-extrahierbare Harzbestandteile: 24 g.
Extraktion mit Diethylether (250 ml) einer Soxhlett-Apparatur:
verbleibende nicht-extrahierbare Harzbestandteile: 24 g.
Schritt 2:
Fällung mit Mg(OH)2 (10 g) in 200 ml Wasser:
liefert bereits auffällig reine Magnesium-Boswelliasäuren- Salze, die nach Waschen mit 400 ml Diethylether praktisch frei von harzigen Verunreinigungen sind. Die Ausbeute beträgt 8,65 g.
Fällung mit Mg(OH)2 (10 g) in 200 ml Wasser:
liefert bereits auffällig reine Magnesium-Boswelliasäuren- Salze, die nach Waschen mit 400 ml Diethylether praktisch frei von harzigen Verunreinigungen sind. Die Ausbeute beträgt 8,65 g.
Schritt 3:
Hydrolyse:
die Mg-BA-Salze werden mit 25%iger HCl solange gerührt bis sich nahezu alle festen Bestandteile aufgelöst haben und der Reaktionsansatz einen stabilen sauren pH von ca. 2-3 aufweist.
Hydrolyse:
die Mg-BA-Salze werden mit 25%iger HCl solange gerührt bis sich nahezu alle festen Bestandteile aufgelöst haben und der Reaktionsansatz einen stabilen sauren pH von ca. 2-3 aufweist.
Schritt 4:
Freie Säuren:
die freien Säuren werden mit Diethylether extrahiert, die Etherphase einrotiert und der Rückstand in Methanol gelöst. Aus Methanol kristallisiert ein weißes körniges Produkt von Boswelliasäure-Derivaten.
Ausbeute: 4 g
Relative Gesamtausbeute: 8%.
Freie Säuren:
die freien Säuren werden mit Diethylether extrahiert, die Etherphase einrotiert und der Rückstand in Methanol gelöst. Aus Methanol kristallisiert ein weißes körniges Produkt von Boswelliasäure-Derivaten.
Ausbeute: 4 g
Relative Gesamtausbeute: 8%.
Das Produkt enhält | Anreicherung |
9,0% Acetyl-11-keto-β-Boswelliasäure (AKBA) | 5,6fach |
7,3% 11-keto-β-Boswelliasäure (KBA) | 5,6fach |
21,0% Acetyl-β-Boswelliasäure | 5,6fach |
Das Ergebnis ist in Fig. 2A-2C dargestellt.
Biologische Wirkung:
Das Produkt ist im biologischen Test (Hemmung der Leukotrien- Biosynthese mit einer IC50 von 5 µg/ml) wirksam. Die Hemmung ist vollständig.
Das Produkt ist im biologischen Test (Hemmung der Leukotrien- Biosynthese mit einer IC50 von 5 µg/ml) wirksam. Die Hemmung ist vollständig.
Fällung eines Harzgemisches aus Boswellia carteri und B. Bhau
dajiana mit Magnesiumsalzen.
Ausgangsmaterial:
100 g (aus Afrika, Harzgemisch von Boswellia carteri und B. Bhau-dajiana).
100 g (aus Afrika, Harzgemisch von Boswellia carteri und B. Bhau-dajiana).
Chemische Ausgangsanalyse:
8,3% Acetyl-11-keto-β-Boswelliasäure (AKBA)
nur Spuren an 11-keto-β-Boswelliasäure (KBA)
1,7% Acetyl-β-Boswelliasäure (Ac-BA).
8,3% Acetyl-11-keto-β-Boswelliasäure (AKBA)
nur Spuren an 11-keto-β-Boswelliasäure (KBA)
1,7% Acetyl-β-Boswelliasäure (Ac-BA).
Schritt 1:
Extraktion mit Diethylether (500 ml) einer Soxhlett-Apparatur:
verbleibende nicht-extrahierbare Harzbestandteile (29 g) sowie frisch ablaufendes Lösungsmittel enthalten keine analytisch nachweisbaren Mengen an Boswelliasäure-Derivaten.
Extraktion mit Diethylether (500 ml) einer Soxhlett-Apparatur:
verbleibende nicht-extrahierbare Harzbestandteile (29 g) sowie frisch ablaufendes Lösungsmittel enthalten keine analytisch nachweisbaren Mengen an Boswelliasäure-Derivaten.
Schritt 2:
Fällung mit Mg(OH)2 (10 g) Lösung in 300 ml Wasser (pH 10,2):
liefert bereits auffällig reine Magnesium-Boswelliasäuren- Salze, die nach Waschen mit 400 ml Diethylether praktisch frei von harzigen Verunreinigungen sind. Die Ausbeute beträgt 20 g.
Fällung mit Mg(OH)2 (10 g) Lösung in 300 ml Wasser (pH 10,2):
liefert bereits auffällig reine Magnesium-Boswelliasäuren- Salze, die nach Waschen mit 400 ml Diethylether praktisch frei von harzigen Verunreinigungen sind. Die Ausbeute beträgt 20 g.
Schritt 3:
Hydrolyse:
die Mg-BA-Salze werden mit 25%iger Hcl solange gerührt bis sich nahezu alle festen Bestandteile aufgelöst haben und der Reaktionsansatz einen stabilen sauren pH aufweist (pH 2-3).
Hydrolyse:
die Mg-BA-Salze werden mit 25%iger Hcl solange gerührt bis sich nahezu alle festen Bestandteile aufgelöst haben und der Reaktionsansatz einen stabilen sauren pH aufweist (pH 2-3).
Schritt 4:
Freie Säuren:
die freien Säuren werden mit Diethylether extrahiert, die Etherphase einrotiert und der Rückstand in Methanol gelöst. Aus Methanol kristallisiert ein weißes körniges Produkt von Boswelliasäure-Derivaten.
Freie Säuren:
die freien Säuren werden mit Diethylether extrahiert, die Etherphase einrotiert und der Rückstand in Methanol gelöst. Aus Methanol kristallisiert ein weißes körniges Produkt von Boswelliasäure-Derivaten.
Ausbeute: 4 g
Das kristalline Produkt besteht aus 65,5% AKBA, einem 11- Hydroxy-BA-Derivat (2%) und 17,3% Acetyl-β-BA (siehe Abbildung zur Analytik). Die Anreicherungsfaktoren sind ca. Bfach für AKBA und 10fach für Acetyl-β-BA.
Das kristalline Produkt besteht aus 65,5% AKBA, einem 11- Hydroxy-BA-Derivat (2%) und 17,3% Acetyl-β-BA (siehe Abbildung zur Analytik). Die Anreicherungsfaktoren sind ca. Bfach für AKBA und 10fach für Acetyl-β-BA.
Das Ergebnis ist in Fig. 3 dargestellt.
Biologische Wirkung:
Das Produkt ist im biologischen Test (Hemmung der Leukotrien- Biosynthese mit einer IC50 von 1 µg/ml) etwa so wirksam wie AKBA (IC50 = 0,8 µg/ml). Die Hemmung ist vollständig.
Das Produkt ist im biologischen Test (Hemmung der Leukotrien- Biosynthese mit einer IC50 von 1 µg/ml) etwa so wirksam wie AKBA (IC50 = 0,8 µg/ml). Die Hemmung ist vollständig.
Fällung in Form von Calciumsalzen (afrikanisches Harz).
Ausgangsmaterial:
50 g (aus Afrika, Harzgemisch von Boswellia carteri und B. Bhau-dajiana wie bei Beispiel 1).
50 g (aus Afrika, Harzgemisch von Boswellia carteri und B. Bhau-dajiana wie bei Beispiel 1).
Chemische Ausgangsanalyse:
8,3% Acetyl-11-keto-β-Boswelliasäure (AKBA)
nur Spuren an 11-keto-β-Boswelliasäure (KBA)
1,7% Acetyl-β-Boswelliasäure (Ac-BA)
8,3% Acetyl-11-keto-β-Boswelliasäure (AKBA)
nur Spuren an 11-keto-β-Boswelliasäure (KBA)
1,7% Acetyl-β-Boswelliasäure (Ac-BA)
Schritt 1:
Extraktion mit Diethylether (250 ml) in einer Soxhlett- Apparatur:
verbleibende nicht-extrahierbare Harzbestandteile (14 g), extrahierter Anteil 36 g in 320 ml.
Extraktion mit Diethylether (250 ml) in einer Soxhlett- Apparatur:
verbleibende nicht-extrahierbare Harzbestandteile (14 g), extrahierter Anteil 36 g in 320 ml.
Schritt 2:
Fällung mit Ca(OH)2 (13 g) in 265 ml Wasser (pH 12,5):
liefert 14,4 g reine Calcium-Triterpensäure-Salze:
Produkt besser als bei NaOH oder KOH (keine Emulsionsbildung), jedoch schlechter absaugbar als das Produkt der Magnesiumfäl lung; auch nach analoger DEE-Wäsche: gelblich und harzig klebrig.
Fällung mit Ca(OH)2 (13 g) in 265 ml Wasser (pH 12,5):
liefert 14,4 g reine Calcium-Triterpensäure-Salze:
Produkt besser als bei NaOH oder KOH (keine Emulsionsbildung), jedoch schlechter absaugbar als das Produkt der Magnesiumfäl lung; auch nach analoger DEE-Wäsche: gelblich und harzig klebrig.
Schritt 3:
Hydrolyse:
die Ca-Salze werdem mit 25%iger HCl solange gerührt bis sich nahezu alle festen Bestandteile aufgelöst haben und der Reak tionsansatz einen stabilen saueren pH aufweist (pH 2-3). Schritt 4:
Freie Säuren:
Ca-Salz liefert nach Hydrolyse 1,5 g freie Säuren (Ausbeute: 3%).
Hydrolyse:
die Ca-Salze werdem mit 25%iger HCl solange gerührt bis sich nahezu alle festen Bestandteile aufgelöst haben und der Reak tionsansatz einen stabilen saueren pH aufweist (pH 2-3). Schritt 4:
Freie Säuren:
Ca-Salz liefert nach Hydrolyse 1,5 g freie Säuren (Ausbeute: 3%).
Die Zusammensetzung der Produkte ist wie bei Beispiel 1, je
doch ist das Produkt im Gegensatz zum Magnesium-
Fällungsprodukt klebrig-harzig und gelblich und bedingt aus
giebigere Waschschritte.
Das Ergebnis ist in Fig. 4 dargestellt.
Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, jedoch mit dem
Unterschied, daß statt mit Magnesium eine Fällung mit Barium
hydroxid durchgeführt wurde. Der Extrakt wurde dabei mit 100 g
Ba(OH)2-Pulver und 3 l einer gesättigten wäßrigen Ba(OH)2-
Lösung versetzt und dann mit einem KPG-Rührer gerührt. Nach
etwa 10 h wurde der entstandene Niederschlag bei leichtem Un
terdruck abgenutscht, mehrmals in frischem Ether resuspendiert
und erneut abgenutscht. Diese Prozedur muß so lange wiederholt
werden bis der Ether farblos abläuft. Anschließend wurde das
hellbeige Bariumsalz vorsichtig getrocknet.
Es wurden 350 g Bariumsäuresalze aus 2 kg Harz erhalten, die
jedoch bereits optisch sichtbar stark mit harzigen Bestandtei
len verunreinigt waren und eine extensive Wäsche mit Diethyle
ther notwendig machten. So wird bei Bariumsalzen eine fraktio
nierte Wäsche mit ca. 20 l Diethylether benötigt, um eine ver
gleichbare Harzfreiheit zu erreichen. Aufgrund der thermischen
Belastung war das Produkt mit Dien-Boswelliasäure-Artefakten
verunreinigt (Acetyl-11-keto-β-Boswelliasäure und Acetyl-β-
Boswelliasäure). Durch die klebrig verharzenden Bestandteile
ist eine weitere Aufarbeitung erschwert. Das Produkt der Mag
nesiumfällung liefert dagegen ein nahezu reines Gemisch von
Magnesiumsalzen.
Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß das erfindungs
gemäße Verfahren zu Produkten führt, die praktisch frei von
verunreinigenden Harzbestandteilen sind und keine die pharma
kologische Wirkung der tetra- und pentacyclischen Triterpen
säuren nachteilig beeinflussende Bestandteile, wie beispiels
weise Amyrinderivate, enthalten. Die Produkte werden in sehr
reiner Form erhalten und eignen sich so zur Weiterverarbeitung
für pharmazeutische Präparate.
Claims (6)
1. Verfahren zur Isolierung von tetra- und pentacyclischen
Triterpensäuren aus diese enthaltenden biologischen Materia
lien, dadurch gekennzeichnet, daß man das in
geeigneter Weise in Lösung gebrachte biologische Material ei
ner Fällung mit einem oder mehreren Calcium- und/oder Magne
siumsalz(en) unterwirft und die Triterpensäure(n) als Präzipi
tat isoliert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn
zeichnet, daß das biologische Material durch Extrak
tion mit einem organischen Lösungsmittel in Lösung gebracht
wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn
zeichnet, daß das biologische Material durch Pulveri
sieren und Auflösen in einem organischen Lösungsmittel in Lö
sung gebracht wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß die Calcium- und/oder Ma
gnesiumsalze ein organisches Salz, ausgewählt aus der Gruppe
bestehend aus Acetat, Fumarat, Citrat, Maleat, Ascorbat, For
miat oder Lactat oder ein anorganisches Salz, ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus Fluorid, Carbonat, Nitrat, Oxid, Sul
fat, Hydrogenphosphat, Hydroxid, Chlorid, Phosphat oder Sulfat
sind.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch
gekennzeichnet, daß das biologische Material
eine Pflanze der Gattung Boswellia ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch
gekennzeichnet, daß die isolierten tetra- und
pentacyclischen Triterpensäuren Boswelliasäure, Acetyl-11-
keto-β-Boswelliasäure, 11-Keto-β-Boswellisäure und Acetyl-β-
Boswelliasäure sind.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE2000135591 DE10035591A1 (de) | 2000-07-21 | 2000-07-21 | Verfahren zur Isolierung von tetra-und pentacyclischen Triterpensäuren |
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DE2000135591 DE10035591A1 (de) | 2000-07-21 | 2000-07-21 | Verfahren zur Isolierung von tetra-und pentacyclischen Triterpensäuren |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
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ID=7649770
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Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE10035591A1 (de) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1480662A1 (de) * | 2002-03-05 | 2004-12-01 | Ganga Raju Gokaraju | Verfahren zur herstellung einer fraktion, die bis zu 100 % mit 3-o-acetyl-11-keto-beta-boswellinsäure aus einem extrakt, der ein gemisch aus boswellinsäuren enthält, angereichert ist |
DE102006053475A1 (de) * | 2006-11-14 | 2008-06-19 | Eberhard-Karls-Universität Tübingen | Zubereitungen zur Hemmung der Prostaglandin E2 Synthese |
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-
2000
- 2000-07-21 DE DE2000135591 patent/DE10035591A1/de not_active Withdrawn
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EP3338773A1 (de) * | 2010-09-22 | 2018-06-27 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Verwendung von boswelliasäuren zur prophylaxe und/oder behandlung von schädigungen und/oder entzündung der langerhans'schen inseln |
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