DE102006053475A1

DE102006053475A1 - Zubereitungen zur Hemmung der Prostaglandin E2 Synthese

Info

Publication number: DE102006053475A1
Application number: DE102006053475A
Authority: DE
Inventors: Oliver Prof. Werz; Ulf Siemoneit
Original assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Current assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Priority date: 2006-11-14
Filing date: 2006-11-14
Publication date: 2008-06-19
Also published as: WO2008058514A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Zubereitungen aus pentazyklischen Triterpensäuren und ihren Derivaten und die Bereitstellung dieser Zubereitungen, insbesondere Boswelliasäuren, für die therapeutische Behandlung von entzündlichen Erkrankungen, schmerzhaften und fiebrigen Zuständen und Krebserkrankungen, die mit einer erhöhten Aktivität der induzierbaren mitochondrialen Prostaglandin E2 Synthase-1 (mPGES-1) bzw. erhöhten Prostaglandin E2 Synthese einhergehen, sowie das dazugehörige Verfahren.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft pentazyklische Triterpensäuren und deren strukturellen Derivate, insbesondere Boswelliasäuren aus Boswellia-Arten (wie B. serrata, B. carterii, B. sacra etc.), als Hemmstoffe der induzierbaren mitochondrialen Prostaglandin E₂ Synthase-1 und deren Anwendung zur Therapie von Prostaglandin E₂-vermittelten Erkrankungen.
Die Prostaglandinbiosynthese wird durch die initialen Schritte der Umwandlung von Arachidonsäure zu Prostaglandin (PG)H2 durch die Cyclooxygenase(COX)-1 oder -2 eingeleitet. Gewisse PGs, dazu gehörend das PGE2, sind Mediatorstoffe bei Entzündungen (v.a. rheumatoide Arthritis), Schmerz und Fieber, und sind des Weiteren bei Krebserkrankungen (Lunge, Kolon, Endometrium) beteiligt, andere dagegen erfüllen wichtige physiologischen Funktionen [1]. Hemmstoffe der COX-1 und -2 unterbinden damit die Synthese aller PGs und weisen aufgrund des Mangels physiologisch wichtiger PGs beträchtliche Nebenwirkungen (Magen, Niere) auf [2]. Die induzierbare mitochondriale Prostaglandin E2 Synthase-1 (mPGES-1) ist Mitglied der MAPEG Familie und katalysiert die Umwandlung von PGH₂ zu PGE₂ [3]. Das PGE₂ weist im Gegensatz zu den physiologisch notwendigen PGs ausgeprägte pathophysiologische Eigenschaften (Entzündung, Schmerz, Fieber, Krebserkrankungen, Angiogenese) auf. Seit Entdeckung der mPGES im Jahre 1999 ist man deshalb bestrebt, potente und selektive Hemmstoffe gegen die mPGES zu entwickeln, um die PGE₂ Synthese selektiv zu inhibieren, ohne dabei die Bildung der physiologisch wichtigen PGs zu unterdrücken. Dies macht die mPGES zu einem interessanten Arzneistoff-Target v.a. bei chronisch entzündlichen Erkrankungen (rheumatoide Arthritis), die mit Schmerz oder auch mit Fieber einhergehen, aber auch bei diversen Krebserkrankungen. Allerdings ist bislang kein Inhibitor der mPGES-1 als Arzneimittel zur Therapie zugelassen, und die Anzahl verfügbarer Hemmstoffe (wie z. B. MK886) ist derzeit noch äußerst gering und sind noch in klinischer Prüfung. Die Motivation der pharmazeutischen Forschung sichere und selektive Hemmstoffe der mPGES-1 zu finden ist enorm.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, die Nachteile der bekannten Verfahren (Einsatz von Hemmstoffen der COX Enzyme) zu umgehen, und Wirkstoffe, insbesondere Naturstoffe, und pharmazeutische Zubereitungen zu identifizieren, die in der Lage sind, die mPGES-1 zu hemmen. Diese Wirkstoffe sollen zur therapeutischen Behandlung von PGE2-vermittelten Erkrankungen, insbesondere rheumatoide Arthritis, bereitgestellt werden, um bei einer hohen Effizienz geringe Nebenwirkungen aufzuweisen.
Diese Aufgabe wird durch den Einsatz von pentazyklischen Triterpenen und ihrer struktureller Derivate gelöst, wie es im Anspruch 1 beschrieben ist. Bevorzugte Ausführungen sowie das Verfahren zur therapeutischen Behandlung sind in den abhängigen Ansprüchen 2 bis 8 genannt.
Boswelliasäuren (BAs) sind pentazyklische Triterpensäuren, die als pharmakologisch relevante Inhaltsstoffe des Weihrauchharzes aus Boswellia serrata (B. serrata) identifiziert wurden. Ergebnisse aus Untersuchungen an Tiermodellen und an Patienten mit rheumatoider Arthritis, chronischer Colitis, ulcerativer Colitis, Morbus Crohn, bronchialem Asthma [4] und peritumoralen Gehirnödemen [5, 6] weisen auf pharmakologische Aktivitäten der BAs in vivo hin. Die zugrunde liegenden Wirkungsmechanismen und die molekularen Zielstrukturen von BAs sind jedoch noch unklar. So wurden die 5-Lipoxygenase [7], die Elastase [8], Topoisomerasen [9] und IκB Kinasen [10] aufgrund der Ergebnisse aus biochemisch-pharmakologischen Experimenten als Targets postuliert.
In der vorliegenden Erfindung konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass die pentazyklischen Triterpensäuren BAs an die mPGES binden und die katalytische Aktivität (Umwandlung von PGH2 zu PGE2) hemmen. Damit sind BAs und deren Derivate direkte Hemmstoffe der mPGES-1 bzw. Hemmstoffe der PGE2 Synthese. Bislang sind keine pentazyklischen Triterpensäuren als Hemmstoffe der PGE2 beschrieben worden.
In einer Ausführung der Erfindung werden gereinigte pentazyklische Triterpensäuren verwendet, wobei insbesondere BAs mit einer 11-Ketogruppe geeignet sind. In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung wird die gereinigte 3-O-Acetyl-11-Keto-Boswelliasäure (AKBA) verwendet. Dieser kann z. B. nach dem Verfahren von Jauch et al. [11] aus Weihrauchharzen halbsynthetisch gewonnen werden.
In einer weiteren Ausführung werden pentazyklische Triterpensäuren verwendet, die eine vergleichbare oder bessere Hemmwirkung auf die mPGES-Aktivität haben.
Die Erfindung umfasst ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung, die mindestens eine pentazyklische Triterpensäure oder eines ihrer Derivate und gegebenenfalls ein pharmazeutisches Trägermaterial enthält.
Zur therapeutischen Behandlung von PGE2-vermittelten Erkrankungen sind Plasmakonzentrationen von ca. 10 μM pentazyklische Triterpensäure erstrebenswert, das könnte etwa die p.o. Gabe von etwa 500-1000 mg/Tag sein.
Die Verabreichung von pentazyklischen Triterpensäuren und deren Derivate oder diese enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Therapie von Erkrankungen kann oral oder parenteral erfolgen.
Der Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt darin, dass für das Arzneistofftarget mPGES-1 mit den pentazyklischen Triterpensäuren Grundstrukturen identifiziert wurden, die zur Hemmung der Aktivität der mPGES-1 führen. Damit könnte nun selektiv die Synthese des PGE2 gehemmt werden, ohne dabei, wie bislang mittels Inhibitoren der COX-1 und -2, auch die Synthese anderer (physiologisch wichtiger) PGs zu hemmen. Dies hat zur Folge, dass die Therapie PGE2-vermittelter Erkrankungen mittels pentazyklischer Triterpensäuren im Vergleich zu COX-1/2 Inhibitoren weniger Nebenwirkungen aufweisen dürfte. Der Vorteil der Erfindung im Vergleich zur bereits bekannten Verwendung von pentazyklischen Triterpensäuren, liegt darin, dass aufgrund der mPGES-1-Hemmung, pentazyklische Triterpensäuren gezielt bei entzündlichen Erkrankungen eingesetzt werden können, die auf eine erhöhte Bildung von PGE2 zurückzuführen sind. Des weiteren kann durch Verwendung von pentazyklischen Triterpensäuren der Einsatz bzw. die Dosis von nicht-steroidalen Antiphiogistika (Cyclooxygenaseinhibitoren) reduziert und die Dauer der Einnahme verkürzt werden, die wegen ihrer unspezifischen Blockade der Synthese aller Prostaglandine zu erheblichen Nebenwirkungen führen.
Die Erfindung kann genutzt werden, um alle Formen von Erkrankungen, die mit einer erhöhten Produktion von PGE2 einhergehen, zu behandeln. Dabei handelt es sich primär um entzündliche Erkrankungen (v.a. rheumatoide Arthritis), fiebrige und schmerzhafte Zustände, sowie Krebserkrankungen, bei denen PGE2 eine Rolle spielt.
Weitere Vorteile, Merkmale und Anwendungsmöglichkeiten der Erfindung werden nachstehend anhand der Ausführungsbeispiele mit Bezug auf die Zeichnungen beschrieben. In den Zeichnungen zeigen:
1: Biosyntheseweg des PGE2
2: Strukturen von pentazyklischen Triterpensäuren. β-BA = β-Boswelliasäure; Aβ-BA = 3-O-Acetyl-β-Boswelliasäure; KBA = 11-Keto-β-Boswelliasäure; AKBA = 3-O-Acetyl-11-Keto-β-Boswelliasäure; α-BA = α-Boswelliasäure; ursolic acid = Ursolsäure; 3-oxo-TA = 3-Oxo-Triucallinsäure.
3: Selektive Bindung von mPGES-1 an immobilisierte Boswelliasäuren. US = Überstand; P = Präzipitat; 1 = EAH-Sepharose-Beads ohne Ligand als Kontrolle; 2 = 11-Keto-Boswelliasäure immobilisiert an EAH-Sepahrose Beads; 3 = Lysat von Interleukin-1-stimulierten A549 Zellen mit endogener mPGES-1). Der Pfeil kennzeichnet die Position der mPGES-1 (16 kDa, Detektion mittels Western-Blot).
4: Hemmung der mPGES-1-vermittelten Synthese von PGE2 (Prozentuale Aktivität gegenüber der Kontrolle mit DMSO als Solvent) in der mikrosomalen Fraktion von Interleukin-1-stimulierten A549 Zellen (Mittelwert + Standardfehler, n = 4). 1 = DMSO (Negativkontrolle); 2 = 10 μM 3-O-Acetly-11-Keto-Boswelliasäure; 3 = 30 μM 3-O-Acetly-11-Keto-Boswelliasäure; 4 = 10 μM β-Boswelliasäure; 5 = 30 μM β-Boswelliasäure.
Ausführungsbeispiele
Bindung von mPGES-1 an immobilisierte Boswelliasäuren
11-Keto-BA wurde an der C3-OH Gruppe mit Glutarsäureanhydrid zum Halbester umgesetzt, die zweite Glutarsäure-Carboxygruppe wurde dann mit der primären Aminogruppe der EAH-Sepharose verknüpft um so immobilisierte BAs (KBA-Seph) zu erhalten. Für Protein-Fishing-Experimente wurden als Proteinquelle Zentrifugationsüberstände (16.000 g, 10 min) der Lysate (Detergenzlyse mit 1% Triton X-100 und 0,5% NP-40) von Interleukin-1-stimulierten A549 Zellen verwendet. EAH-Sepharose ohne Ligand (Seph) diente zur Kontrolle für unspezifische Bindung. Die Sepharosen wurden mit den Überständen über Nacht bei 4°C unter stringenten Bedingungen (1% Triton X-100, 0,5% NP-40) inkubiert und anschließend dreimal mit dem Inkubationspuffer gewaschen. Die so gewonnenen Protein-Präzipitate wurden mit Denaturierungspuffer behandelt um die gebundenen Proteine abzutrennen. Daneben wurde ein Aliquot der verbleibenden Überstände nach der Inkubation mit den Sepharosen als Probe entnommen. Sowohl Proteine des Präzipitats als auch der verbleibenden Überstände wurden dann mittels SDS-PAGE aufgetrennt, auf Nitrocellulosemembran geblottet und mit Hilfe eines spezifischen Antikörpers gegen humane mPGES-1 in einer Antikörperreaktion (Western-Blot) analysiert (3).
Die Analyse der so gefärbten Proteine zeigt, dass im Präzipitat mittels KBA-Seph reichlich mPGES-1 vorhanden ist, die Kontrollpräzipitation mit Seph (ohne Ligand) jedoch kaum mPGES-1 aufweist. Passend dazu, findet man im verbleibenden Überstand nach KBA-Seph-Behandlung keine mPGES-1, während in den Überständen mit Seph-Behandlung reichlich mPGES-1 zurück bleibt (3). Daraus folgt, dass mPGES-1 selektiv an KBA-Seph, nicht aber an Seph ohne Ligand bindet.
Einfluss von Boswelliasäuren auf die Aktivität der mPGES-1
A549 Zellen wurden mit Interleukin-1 (1 ng/ml) für 72 Stunden inkubiert. Nach Ernte und Zellzahlbestimmung wurden die pelletierten Zellen auf Trockeneis/Ethanol schockgefroren, durch Zugabe von 1 ml Homogensisierungspuffer (4°C) wieder aufgetaut und mittels Ultraschall homogenisiert. Nach Zentrifugation 10.000 g für 10 min bei 4°C wurde der erhaltene Überstand bei 174.000 g und 4°C für 1 h Stunde zentrifugiert um Mitochondrien zu gewinnen. Das Pellet (Mitochondrien) wurde im Homogensierungspuffer gelöst und mit den Testsubstanzen (Boswelliasäuren bzw. DMSO) für 10 min bei 4°C in 96-well Platten vorinkubiert. Dann wurde PGH2 als Substrat zugegeben und die Reaktion nach 1 min bei 4°C mittels Stopplösung (enthält u.a. Fe2+, Citronensäure und 11-β-PGE2 als Standard) beendet. Nach Festphasenextraktion (RP-18-Säulen und Aceton als Elutionsmittel) wurde die Probe mittels HPLC (RP-18, UV-Detektion bei 190 nm) analysiert.
Es zeigt sich, dass die Vorinkubation der mitochondrialen Fraktion von Interleukin-1-stimulierten A549 Zellen zu einer potenten Hemmung der mGPES-1 Aktivität führt, indem 10 μM AKBA die PGE2-Synthese aus PGH2 zu 75% hemmen, 30 μM AKBA ergeben keine weitere Hemmwirkung. Die Effizienz der β-BA ist etwas geringer, so hemmen 10 μM β-BA die PGE2-Synthese nur zu 30%, 30 μM hemmen zu 45%.
Literatur

[1] C.D. Funk, Prostaglandins and leukotrienes: advances in eicosanoid biology, Science 294 (2001) 1871-1875.
[2] F. Celotti and S. Laufer, Anti-inflammatory drugs: new multitarget compounds to face an old problem. The dual inhibition concept, Pharmacol Res 43 (2001) 429-436.
[3] P.J. Jakobsson, S. Thoren, R. Morgenstern and B. Samuelsson, Identification of human prostaglandin E synthase: a microsomal, glutathione-dependent, inducible enzyme, constituting a potential novel drug target, Proc Natl Acad Sci U S A 96 (1999) 7220-7225.
[4] H.P. Ammon, [Boswellic acids (components of frankincense) as the active principle in treatment of chronic inflammatory diseases], Wien Med Wochenschr 152 (2002) 373-378.
[5] M. Winking, S. Sarikaya, A. Rahmanian, A. Jodicke and D.K. Boker, Boswellic acids inhibit glioma growth: a new treatment option?, J Neurooncol 46 (2000) 97-103.
[6] W. Wick and W. Kuker, Brain edema in neurooncology: radiological assessment and management, Onkologie 27 (2004) 261-266.
[7] H. Safayhi, T. Mack, J. Sabieraj, M.I. Anazodo, L.R. Subramanian and H.P. Ammon, Boswellic acids: novel, specific, nonredox inhibitors of 5-lipoxygenase, J Pharmacol Exp Ther 261 (1992) 1143-1146.
[8] H. Safayhi, B. Rall, E.R. Sailer and H.P. Ammon, Inhibition by boswellic acids of human leukocyte elastase, J Pharmacol Exp Ther 281 (1997) 460-463.
[9] T. Syrovets, B. Buchele, E. Gedig, J.R. Slupsky and T. Simmet, Acetyl-boswellic acids are novel catalytic inhibitors of human topoisomerases I and II alpha, Mol Pharmacol 58 (2000) 71-81.
[10] T. Syrovets, B. Buchele, C. Krauss, Y. Laumonnier and T. Simmet, Acetyl-boswellic acids inhibit lipopolysaccharide-mediated TNF-alpha induction in monocytes by direct interaction with IkappaB kinases, Journal of Immunology 174 (2005) 498-506.
[11] J. Jauch and J. Bergmann, An efficient method for the large-scale preparation of 3-O-acetyl-11-oxo-beta-boswellic acid and other boswellic acids, Eur J Org Chem (2003) 4752-4756.

Claims

Zubereitung zur Hemmung der PGE2 Synthese, insbesondere zur Hemmung der mPGES-1, dadurch gekennzeichnet, dass diese Zubereitung eine oder mehrere pentacyclische Triterpensäuren oder/und ihre Derivate enthält.
Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die pentacyclische Triterpensäuren natürlich vorkommende oder künstlich synthetisierte Boswelliasäuren oder/und eines ihrer Derivate sind.
Zubereitung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die pentazyklischen Triterpensäuren aus Boswellia-Arten gewonnen wurden.
Zubereitung nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine pharmazeutisch wirksame Menge von pentacyclischen Triterpensäuren oder/und eines ihrer Derivate und ein pharmazeutisches Trägermaterial enthält.
Zubereitung nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie zur Behandlung PGE2-vermittelter Erkrankungen eingesetzt wird.
Zubereitung nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die PGE2-assoziierte Erkrankungen insbesondere Entzündungen und/oder Krebserkrankungen sind.
Verfahren zur Beeinflussung der PGE2 Synthese, insbesondere zur Hemmung der mPGES-1 Aktivität, dadurch gekennzeichnet, dass eine wirksame Menge einer Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 appliziert wird.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es zur Behandlung von mit einer atypischen PGE2-assoziierten Erkrankung eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Plasmakonzentrationen von pentacyclischen Triterpensäuren oder/und ihrer Derivaten nach der Applikation etwa 0,1-15 μM beträgt.