DE3000246C2 - Verfahren zur Herstellung von L-α-Glycerylphosphorylcholin - Google Patents

Description

Behandlung der ätherischen Lösung mit Lithiummethylat Dieses zuletzt genannte Reagens wird in einer Menge von 1 Mol pro Mol Phosphatid verwendet Die Behandlung mit diesem Reagens führt zu einer Mischung aus Glycerylphosphorylcholin (GPC) und Glycerylphosphoryläthanolamin (GPE). Nach der Neutralisation dieser Mischung mit HCl werden das GCP und das GPE durch Chromatographie an Siliciumdioxid voneinander getrennt In der Praxis wurde festgestellt daß diese Chromatographie zu GPC führt das durch kolloidale Kieselsäure verunreinigt ist (wie voraussehbar, wenn man Wasser als Eluierungsmittel verwendet). Das Kieselsäure-Verunreinigungsmittel ist nur durch wiederholte Kristallisationen des Endproduktes entfernbar. Diese Kristallisationen sind sehr schwierig durchzuführen.

Zusammenfassend kann gesagt werden, daß die vorstehend beschriebenen Verfahren zur Herstellung von GPC mit einer zufriedenstellenden Reinheit im allgemeinen umständlich und unwirtschaftlich für die Durchführung in einem großtechnischen Maßstabe sind.

Es wurde nun überraschend gefinden, daß GPC in hoher Reinheit und in hoher Ausbeute und nach einem verhältnismäßig einfachen Verfahren, das ohne Schwierigkeiten in einem großtechnischen Maßstabe durchgeführt werden kann, erhalten werden kann, wenn die Methanolyse von gereinigtem Lecithin in Gegenwart einer katalytischen Menge Natriummethylat bezogen auf die verwendete Lecithinmenge, durchgeführt wird.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von L-a-Glycerylphosphorylcholin der Formel

CH₂OH

HO-C-H Ο^θ

CH₂-O-P

ll\

O 0-CH₂-CH₂-N(CH₃),

in einem reinen Zustand, das dadurch gekennzeichnet ist. daß man gereinigtes Lecithin einer durch Natriummethylat katalysierten Methanolyse unterwirft.

Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung erhält man L-a-Glycerylphosphorylcholin in reinem Zustand, wenn man Lecithin in Gegenwart einer katalytischen Menge Natriummethylat einer Methanolyse unterwirft. Das Verfahren kann in einem großtechnischen Maßstabe wirtschaftlich durchgeführt werden, weil das gewünschte Reaktionsprodukt leicht abgetrennt (gewonnen) werden kann.

Das dabei erhaltene Produkt ist genügend rein, so daß es weder einer Umkristallisation, die wie oben angegeben besonders schwierig ist, nach einer Komplexbildung mit CdCl₂ unterworfen werden muß, wobei diese beiden Reinigungsverfahren für die Durchführung in einem großtechnischen Maßstabe nicht geeignet sind.

Die Methanolyse wird bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens vorzugsweise in der Weise durchgeführt, daß man eine methanolische Lösung von gereinigtem Lecithin, die vorzugsweise etwa 39 Gew.-% Lecithin und katalytische Mengen CH₃ONa enthält, etwa 60 Minuten lang bei Umgebungstemperatur stehen läßt. Das CH₃ONa wird vorzugsweise in einer Menge von 0,01 bis 0,1, insbesondere von 0,05 Mol pro Mol Lecithin verwendet Am Ende der Reaktion werden die Fettsäureester, die sich während der Umsetzung abgeschieden haben, entfernt und die zurückbleibende Methanoliösung wird mit etwa 8 Äquivalenten eines schwach kationischen Harzes 1R-C50 (H^e) pro Äquivalent Natriummethylat behandelt um die Natriumionen zu eliminieren.

Das Eluat und die Waschwässer aus dem Harz werden durch Eindampfen unter vermindertem Druck (beispielsweise von 12 mm Hg) auf ein geringes Volumen eingeengt und nach dem Verdünnen mit Wasser mit Chloroform extrahiert zur Entfernung der letzten Spuren der Fettsäureester, der letzten Spuren von nicht-deacyliertem oder teilweise deacyliertem Lecithin und der Spuren von Sphingomyelin, die im allgemeinen in dem aus Eisen erhaltenen Lecithin zu finder, sind. Die wäßrige Phase wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft und dann wird gewünschtenfalls das Produkt mit Kohle SL 50 entfärbt.

Das dabei erhaltene Produkt ist frei von Hydrolyseverunreinigungen, von anorganischen Salzen und von Fettsäureestsrn und es weist keine wesentlichen Unterschied in bezug auf seine Eigenschaften gegenüber den Proben von GPC auf, das durch Bildung des Komplexes mit CdCI₂, aufeinanderfolgende Kristallisationen, Zersetzung desselben durch Überleiten desselben über Austauscherharze und schließlich Kristallisation des dabei erha'tenen L-a-Glycerylphosphorylcholins erha'ten worden war.

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene L-fli-Glycerylphosphorylcholin weist im allgemeinen einen Feuchtigkeitsgehalt von etwa 15 Gew.-% auf. Die Feuchtigkeit kann gewünschtenfalls entfernt werden durch Trocknen über P2O5 unter einem Hochvakuum und anschließende wiederholte Kristallisationen aus Äthanol/Diäthyläther oder Äthanol/Äthylacetat; der dabei erhaltene farblose hygroskopische Feststoff schmilzt bei 130 bis 131°C und hat die Summenformel C₈H₂₀NO₆P.

Eine solche Arbeitsweise ist nicht erforderlich, wenn es erwünscht ist, das L-aGlycerylphosphorylcholin in wäßriger Lösung oder sonst in Verbindung mit anderen aktiven Wirkstoffen in injizierbaren lyophilisierten gesetzlich geschützten Arzneimitteln zu verwenden, wie dies üblicherweise der Fall ist. Es ist heute möglich, das amorphe Produkt als solches zu verwenden, ohne daß es aufeinanderfolgenden Reinigungen unterworfen werden muß, da die Reinheit des deacylisiertin Phosphatids von allen Gesichtspunkten aus betrachtet mehr als zufriedenstellend ist.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.

Beispie! 1
a) Reinigung von Lecithin

Als Ausgangsmaterial wurde Lecithin aus einem rohen Ei (alkalilabiler P 2,7 bis 2,85%, P von Glycerylphosphorylcholin 2,24 bis 2,52%) verwendet.

Eine Lösung von 0,5 kg rohem Lecithin in 1 I Methylenchlorid wurde in 6 1 Aceton gegossen, das bei 5°C gerührt wurde. Nach 60 Minuten wurde die Flüssigkeit dekantiert und die Reinigung wurde durchgeführt durch Auflösen des Rückstandes in 1 I Methylenchlorid und Gießen der Lösung in 6 I Aceton wie oben angegeben. Der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert und bei Umgebungstemperatur unter Vakuum (12 mm Hg) getrocknet (320 g).

Eine Lösung von 320 g Lecithin in 650 ml Chloroform/Methanol (Volumenverhältnis 1:1) wurde an 1,4 kg Al₂O₃ Chromatographien, wobei die Elution mit 3,51 Chloroform/Methanol (Volumenverhältnis 1:1) durchgeführt wurde. Das Eluat wurde bei einer Temperatur von 40°C unter Vakuum (12 mm Hg) zur Trockne eingeengi und dar..-; erneut in 350 ml Methylenchlorid gelöst, zentrifugiert und bei 5° C unter Rühren in 2,41 Aceton gegossen.

Nach 60minütigem Stehenlassen bei 5°C wurde der jo gebildete Niederschlag abfiltriert und bei Umgebungstemperatur unter Vakuum (12 mm Hg) getrocknet, wobei man 210 g reines Lecithin erhielt (alkalilabiler P: 3,70—3,80%, P von Glycerylphosphorylchoiin 3,70 bis 3,80%). 'S

b) Herstellung von L-a-Glycerylphosphorylcholin

Eine Lösung von etwa 500 g (0,7 Mol) des in dem obigen Abschnitt (a) erhaltenen gereinigten Lecithins in 1 i wasserfreiem Methanol, das 0,039 Mol Natriummethylat enthielt, wurde 60 Minuten lan^, bei Umgebungstemperatur stehen gelassen. Die gebildete ölige Schicht wurde abgetrennt und dann wurde die Lösung durch ein Bett aus 80 g des Harzes IRC 50 H® mit einer Höhe von 50 cm filtriert, wobei das adsorbierte Material anschlie-Bend mit Methanol eluiert wurde, das jeweils in I 1-Mengen verwendet wurde. Das Eluat wurde bei 40° C unter Vakuum (12 mm Hg) bis auf ein Volumen von etwa 1 1 eingeengt, dann mit 550 ml Wasser verdünnt und mit 4 χ 400 ml Chloroform extrahiert.

Die wäßrige Phase wurde bei 40° C unter Vakuum (12 mm Hg) zur Trockne eingeengt, der Rückstand wurde in 410 ml Wasser gelöst, es wurden 12 g entfärbende Kohle zugegeben und die wäßrige Phase wurde 15 Minuten lang bei Umgebungstemperatur gerührt. Dann wurde über Millipore filtriert und das Lösungsmittel wurde bei 40° C unter vermindertem Druck (12 mm Hg) entfernt, wobei man 165 g L-a-Glycerylphosphorylcholin in reiner amorpher Form erhielt

H₂O Gesamt-P

15,5o/o 84,1%

Phosphor nach der

chromatographischen Trennung 83,94%

Vicinales Glycol 84,59%

Cholin 85%

Spaltungsprodukte der P—O-Bindung wurden nicht testgestelh, was durch Durchführung einer Analyse mit der Probe gemäß Brockerhoff (vgl. »J. Lipids Research«, 4,96 (1963)) oder gemäß Dawson (vgl. »J. Biochem.«, 75, 45 (I960)) überprüft wurde. Eine bei 0,05 mm Hg über P₂O₅ getrocknete Probe wurde aus Äthanol/Äthyläther (mit 99% Äthanol) kristallisiert, wobei man einen weißen, hygroskopischen, kristallinen Feststoff erhielt, der bei 130 bis 131°C schmolz, «_D=-2,84° (10% in H₂O).

ber.: C 3735, H 7,84, N 5,45, P 12,04%; gef.: C 37,50, H 7,70, N 5,38, P 12,06;

ber.: Cholinester 47,12% gef.: 46,92

Vicinales Glykol = 99,8%. Beispiel 2

Als Ausgangsmaterial wurde Sojalecithin (alkalilabiler Phosphor: 2%, minimaler P von GPC; 0,5%) verwendet. Eine Suspension von 600 g dieses Lecithins in 600 ml Methanol wurde 60 Minuten lang bei Umgebungstemperatur gerührt. Sie wurde 60 Minuten lang bei 5° C stehen gelassen und dann wurde das Lösungsmittel dekantiert, der Rückstand wurde mit 300 ml Methanol gewaschen. Der Methanolextrakt wurde mit 300 ml Methanol gewaschen. Der Methanolextrakt wurde 18 Stunden lang bei 5°C stehen gelassen, dann wurde er filtriert und bei 40° C unter vermindertem Druck (12 mm Hg) zur Trockne eingeengt (70 g) (alkalilabiler P: 3,0-3,1%; P von Glycerylphosphorylcholin:-2,0 bis 2,1%). Nach wiederholter Reinigung des Rückstandes erhielt man 20 g reines Lecithin.

Das Lecithin wurde auf die gleiche Weise wie das in Beispiel 1 verwendete Eilecithin behandelt Dabei wurde GPC in gleicher Reinheit und mit praktisch identischer Ausbeute wie in Beispiel 1 erhalten.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung von L-e-Glycerylphosphorylcholin der Formel

   CH₂OH

   HO-C-H Ο^θ

   CH₂-O-P

   O 0-CH₂-CH₂-N(CH)₃

   in reinem Zustand, dadurch gekennzeichnet, daß man gereinigtes Lecithin einer durch Natriummethylat katalysierten Methanolyse unterwirft.

   Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von L-ff-Glycerylphosphorylcholin der nachfolgend angegebenen Formel (1) in einem hochreinen Zustand sowie das dabei erhaltene Produkt.

   Wenn L-a-Glycerylphosphorylcholin der Formel

   CH₂OH
   HO-C-H

   O^e

   CH₂-O-P

   ll\

   O 0-CH₂-CH₂-N(CH)₃

   intramuskulär oder oral verabreicht wird, so schützt es. wie festgestellt wurde, das Lebergewe.be gegen das Eindringen von Fett, das durch eine hyperlipoproteinhaltige Diät oder durch eine Vergiftung durch Tetrachlorkohlenstoff hervorgerufen wird. Es wurde auch gefunden, daß die Verabreichung von L-a-Glycerylphosphorylcholin gegen Cholestase schützt.

   Eine wichtige Tatsache, die festgestellt wurde, ist die, daß das Glycerylphosphorylcholin in die Struktur der Lipoproteine eintritt. Pharmokinetische Untersuchungen haben gezeigt, daß das Glycerylphosphorylcholin von dem Intestinum oder an der Stelle der intramuskulären Inokulation schnell absorbiert wird. Es zirkuliert im Blutstrom und gelangt in die Organe, insbesondere in die Leber, die Nieren und in das Gehirn. Insbesondere in der Leber wird es in den Kreislauf zurückgeführt, wobei es in den Lipoproteinen enthalten ist. Aufgrund dieses Verhallens wird angenommen, daß Glycerylphosphorylcholin das Serum klärt bzw. reinigt.

   L-ft-Glycerylphosphorylcholin der oben angegebenen Formel (I) kann hergestellt werden durch Hydrolyse von Lecithin, insbesondere von Eilecithin. Das Hauptproblem, das bei der Herstellung von L-a-Glycerylphosphorylcholin auftritt, ist seine Reinigung; die Nebenprodukte, welche das durch Hydrolyse erhaltene L-A-Glycerylphosphorylcholin (I) begleiten, verringern seinen therapeutischen Wert und führen häufig zu unerwünschten Nebenwirkungen. Es wurden jedoch einige verhältnismäßig erfolgreiche Versuche gemacht, die Verbindung (I) in besonders reiner Form herzustellen. So ist in der US-Patentschrift 28 64 848 ein Venahren beschrieben, bei dem die Hydrolyse von Lecitin in Gegenwart von Quecksilber^ I)chlorid durchgeführt wird, das verwendet wird, um die Nebenprodukte in Form von Quecksiiber(ll)salzen auszufällen; bei diesem Verfahren ist es dann erforderlich, aus dem Glycerylphosphorylcholin die überschüssigen Quecksilber(ll)ionen zu entfernen, die bekanntlich toxisch sind,

   ίο und dies wird durchgeführt unter Anwendung einer komplizierten Behandlung mit H₂S und BaCU3. In dieser Patentschrift ist darüber hinaus angegeben, daß durch diese Behandlung nicht alle Quecksilber^ I)ionen in ausreichendem Maße entfernt werden und daß daher nachfolgende zusätzliche Reinigungsprozesse erforderlich sind. Insbesondere muß das Endprodukt durch Bildung eines Komplexes mit Cadmiumchlorid gereinigt werden. Der Gesamtarbeitsgang ist somit sehr kompliziert und das Endprodukt ist nicht frei von Schwermetallen.

   Ein zu dem vorstehend beschriebenen Verfahren analoges Verfahren ist in »Biochemical Preparation«, Band 6, S. 16 bis 19, beschrieben. Die Entfernung des Cadmiums am Ende der Reaktion erfolgt in diesem Falle in der Weise, daß man das Reaktionsprodukt über ein Gemisch von Austauscherharzen laufen läßt. Dadurch wird ebenfalls das Verfahren kompliziert und dies führt darüber hinaus zu einer Abnahme der Produktausbeute.

   Als Alternative zur Hydrolyse beschreibt Brockerhoff im »Journal Lipid Research«, 4, 96 (1963) die Methanolyse einer sehr verdünnten Lecithinlösung (etwa 21 g/l) mit Natriummethylat, das in einer Menge von 3 Mol Methylat pro Mol Phosphatid verwendet wird. Die unter diesen Bedingungen durchgeführten Melhanolyse führt, wie gefunden wurde, zu einer partiellen Spaltung der P-O-Bindung unter Bildung von schädlichen Nebenprodukten sowie zu der gewünschten Spaltung der Acyl-Sauerstoff-Bindung. Okui et al beschreiben ii· »Yakugaku Zasshi«, 84 (12), 1206-1209 (1964), die Herstellung der Verbindung (I) aus Eilecithin durch Hydrolyse, die unter Verwendung von Erdalkalimetallhydroxiden durchgeführt wird. Das dabei erhaltene Produkt ist jedoch durch Sekundärkomponenten sehr stark verunreinigt. Brockerhoff und Yurkowski weisen in einer kurzen Notiz im »Canadian Journal of Biochemistry«, 43,1777 (1965), darauf hin. daß die Herstellung der Verbindung (I) erfolgen kann durch Hydrolyse von Lecithin mit einer quatemären Ammoniumbase (Tetrabutylammoniumhydroxid); dabei schreitet die Hydrolyse in zufriedenstellende Weise fort, wie Chadha in »Chem. Phys. Lipids«, 4, 104-108 (1970), gezeigt hat. Die Gesamthydrolyse mit dieser Base ist jedoch kommerziell kostspielig und man erhält kein Glycerylphosphorylcholin, das frei von Tetrabutylammoniumhydroxid ist, das in einem Kristallisationsgang von der Verbindung (I) abgetrennt werden muß. Darüber hinaus eignet sich dieses unbefriedigende Verfahren nicht für die Herstellung in einem großtechnischen Maßstabe, da es nicht reproduzierbar ist.

   Schließlich wird von Cubero Robles und Roels in »Chem. Phys. Lipids«, 6, 31-38 (1971), ein Verfahren beschrieben, bei dem L-a-Glycerylphosphorylcholin erhalten wird durch Methanolyse eines Fettextrakts, der beim Zerkleinern von Eigelb (Eidotter) erhalten wird.

   Das von diesen Autoren beschriebene Verfahren umfaßt die Extraktion des Pulvers mit Chloroform/Methanol, die Verdampfung dieses Lösungsmittelgemisches, die Auflösung des Rückstandes in Äther und die