CH642083A5 - Processo per la preparazione di l-alpha-glicerilfosforilcolina. - Google Patents
Processo per la preparazione di l-alpha-glicerilfosforilcolina. Download PDFInfo
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Description
La presente invenzione ha per oggetto un procedimento per la preparazione industriale di L-a-glicerilfosforilcolina (I) allo stato di elevata purezza.
È noto che la L-a-glicerilfosforilcolina (I)
ch2oh «
ho-g-h ch2-0-p
0
/
0
(I)
o-ch2-ch2-n(ch3)3
somministrata per via intramuscolare o orale protegge in modo molto evidente il tessuto epatico dalla infiltrazione grassa indotta da dieta iperlipidica-ipoproteica o determinata da avvelenamento da tetracloruro di carbonio e pure protegge dalla constasi sperimentale.
È importante mettere in evidenza che la glicerilfosforilcolina entra nella costituzione delle lipoproteine. Ricerche di farmaco-cinetica dimostrano che la glicerilfosforilcolina si assorbe rapidamente dall'intestino o dal focolaio di inoculazione intramuscolare: dal circolo si distribuisce agli organi, specialmente al fegato, al rene ed al cervello. Particolarmente dal fegato è nuovamente reimmessa in circolo, incorporata nelle lipoproteine. Questo particolare dato spiega il motivo per il quale la glicerilfosforilcolina manifesta un'azione chiarificante il siero.
È altresì noto che (I) viene ottenuta per idrolisi della lecitina, in particolare della lecitina di uovo.
La maggior difficoltà di questa operazione è costituita dalla purificazione; i prodotti secondari che accompagnano la L-a-glicerilfosforlicolina (I) ottenuta per idrolisi non soltanto ne diminuiscono il valore terapeutico, ma presentano spesso sfavorevoli effetti secondari. Non sono quindi mancati tentativi per ottenere (I) in forma particolarmente pura.
Così, in USP 2 864 848 del 16 dicembre 1958 si descrive l'idrolisi in presenza di cloruro mercurico, allo scopo di precipitare i componenti secondari sotto forma di sali mercurici; ciò comporta la necessità di allontanare poi dalla glicerilfosforilcolina gli ioni mercurici (dei quali è superfluo sottolineare la tossicità), e ciò viene realizzato mediante un complicato trattamento con HiS e BaCC>3. Lo stesso brevetto, tuttavia, avverte che sovente tale trattamento non basta a eliminare tutti gli ioni mercurici, e a tal fine si rendono necessarie ulteriori operazioni. Per di più il prodotto finale dev'essere purificato attraverso la formazione di un complesso con cloruro di cadmio. L'operazione è quindi assai complicata, il prodotto finale non esente da metalli pesanti.
Una tecnica analoga alla precedente è descritta in Biochemi-cal Préparation (Vol. 6, pag. 16-19); l'eliminazione finale del 5 cadmio è in questo caso effettuata mediante passaggio su una miscela di resine scambiatrici, che rende il procedimento ancora più complesso e deprime ulteriormente le rese.
Brocherhoff [Journal Lipid Research 4, 96 (1963)] descrive la metanolisi di una soluzione molto diluita di lecitina (circa 21 io g/litro) con metossido di sodio in ragione di 3 moli di metossido per mole di fosfatide.
In queste condizioni si verifica tuttavia, oltre alla desiderata scissione del legame acile-ossigeno, anche una parziale scissione del legame P-O, con formazione di sottoprodotti.
15 Okui e collaboratori [Yakugaku Zasshi (12), 1206-9 (1964)] descrivono la preparazione di (I) da lecitina di uovo mediante idrolisi con idrossidi di metalli alcalinoterrosi. Il prodotto così ottenuto risulta notevolmente impuro di componenti secondari.
20 Brockerhoff e Yurkowski descrivono in una breve nota [Ca-nadian Journal of Biochemistry, 43, 1777 (1965)] la preparazione di (I) mediante idrolisi di lecitina con una base ammonica quaternaria (idrossido di tetrabutilammonio): le rese sono soddisfacenti, come ha posto in evidenza anche Chadha [Chem. 25 Phys. Lipids, 4, 104-108 (1970)]; tuttavia l'idrolisi compiuta con questa base, commercialmente costosa, non consente di ottenere glicerilfosforilcolina esente da idrossido di tetrabutilammonio, rendendo pertanto necessaria la cristallizzazione di (I). Inoltre questo procedimento male si presta per preparazioni su 30 larga scala, mancando di riproducibilità.
Secondo Cuberò Robles e Roels [Chem. Phys. Lipids, 6, 31-38 (1971)], si può ottenere L-a-glicerilfosforilcolina mediante metanolisi di un estratto lipidico ottenuto da polvere di tuorlo d'uovo. Il metodo descritto da questi autori comprende l'e-35 strazione della polvere con cloroformio/metanolo, l'evaporazione della miscela di solventi, la dissoluzione del residuo in etere e il trattamento della soluzione eterea con metossido di litio. Quest'ultimo viene usato in ragione di 1 mole/mole di fosfatide. Ne risulta una miscela di GPC e di GPE che, previa 40 neutralizzazione con HCl metanolico, viene separata mediante cromatografia su silice. In pratica si è osservato che questa cromatografia fornisce GPC inquinata da acido silicico colloidale (come era prevedibile, dato che l'eluente è acqua), eliminabile soltanto mediante ripetute cristallizzazioni (notoriamente diffi-45 coltose) del prodotto finale.
Riassumendo, si può affermare che i processi sinora descritti per ottenere GPC di soddisfacente purezza comportano inconvenienti che ne rendono insostituibile l'attuazione economica, soprattutto su scala industriale.
so Si è ora inaspettatamente trovato che si può ottenere GPC pura con alte rese e con un metodo relativamente semplice, attuabile senza difficoltà su scala industriale, se si effettua la metanolisi della lecitina purificata in soluzione molto concentrata e operando con quantità catalitiche di metossido di sodio. 55 II prodotto al quale si perviene ha un grado di purezza tale da renderne superflua sia la cristallizzazione (che, come si è detto è particolarmente difficoltosa) sia la formazione del complesso con CdCl2, sostanzialmente inattuabile su scala industriale.
Secondo l'invenzione, la metanolisi è condotta trattando per 60 60', a temperatura ambiente, una soluzione metanolica di lecitina purificata (39% in peso di lecitina) con quantità catalitiche di CH}ONa (da 0,01 a 0,1, di preferenza 0,05 moli/mole). Al termine della reazione gli esteri degli acidi grassi che si sono separati durante la reazione vengono allontanati e la soluzione 65 metanolitica residua è trattata con circa 8 equivalenti di resina cationica debole IR-C 50 (H +) per equivalente di metossido di sodio, allo scopo di eliminare lo ione sodio.
L'eluato e il lavaggio della resina sono concentrati a piccolo
3
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volume mediante evaporazione a pressione ridotta (12 mm Hg) e, dopo diluizione con acqua, sono estratti con cloroformio per allontanare le ultime tracce degli esteri degli acidi grassi, le eventuali tracce di lecitina non deacilata o parzialmente deacila-ta e le tracce di sfingomieline cha a volte accompagnano la lecitina di partenza. Si evapora la fase acquosa a secco a pressione ridotta, quindi, se necessario, si decolora il prodotto con carbone SL 50.
Il prodotto ottenuto è esente da impurezze di idrolisi, da sali inorganici e da esteri degli acidi grassi e non mostra differenze significative rispetto a campioni ottenuti per formazione del complesso con CdCl2, successiva cristallizzazione, decomposizione del medesimo per passaggio su resine scambiatrici e cristallizzazione finale della L-a-glicerilfosforilcolina così ottenuta.
La L-a-glicerilfosforilcolina ottenuta col metodo dell'invenzione contiene generalmente circa il 15% di umidità.
L'umidità può essere eliminata, se nesessario, mediante essiccamento su P2O5 sotto alto vuoto e successiva cristallizzazione da etanolo/dietiletere o da etanolo/acetato di etile; si ottiene così un solido incolore igroscopico a p.f. 130-131°C, di formula bruta CgHhoNOfiP.
Tale operazione è ovviamente inutile qualora si debba utilizzare la L-a-glicerilfosforilcolina in soluzione acquosa oppure in associazione ad altri principi attivi in specialità farmaceutiche iniettabili liofilizzate, come quasi sempre accade; è allora possibile utilizzare il prodotto amorfo tal quale senza ricorrere a successiva purificazione poiché la purezza del fosfatide deacila-to è più che soddisfacente sotto ogni punto di vista.
Gli esempi che seguono valgono a illustrare il procedimento secondo l'invenzione, senza peraltro limitarla in modo alcuno.
Esempio 1
a) Purificazione della lecitina
Si impiega come materia prima la lecitina da uovo grezza (P alcalilabile: 2,7-2,85%; P della glicerilfosforilcolina: 2,24-2,52%).
Una soluzione di 0,5 kg di lecitina grezza in cloruro di metilene 1 litro è versata, sotto agitazione a 5°C, in 6 litri di acetone. Dopo 60' si decantano le acque, quindi si ripete la purificazione sciogliendo il residuo in cloruro di metilene (1 litro) e versando nuovamente la soluzione in acetone (6 litri). Si filtra e si essicca il precipitato sotto vuoto (12 mm Hg) a temperatura ambiente (320 g).
La soluzione di lecitina (320 g) in cloroformio-metanolo 1 : 1 (650 mi) è cromatografata su AI2O3 (1,4 kg) eluendo con cloroformio-metanolo 1 : 1 (3,5 litri). L'eluato, concentrato a secco sotto vuoto (12 mm Hg) alla temperatura di 40°, è ripreso con cloruro di metilene (350 mi), centrifugato e versato a 5°C, sotto agitazione in acetone (2,4 litri).
Dopo riposo per 60' a 5° si filtra e si essicca il precipitato sotto vuoto (12 mm Hg) a temperatura ambiente ottenendo 210
g di lecitina pura. (P alcalilabile: 3,70-3,80%; P della glicerilfosforilcolina: 3,70-3,80%).
b) Preparazione della L-a-glicerilfosforilcolina 5 La soluzione di lecitina purificata (500 g circa; 0,7 moli) in metanolo anidro (1 litro) contenente 0,039 moli di metilato di sodio è lasciata a riposo, a temperatura ambiente, per 60'. Si separa lo strato oleoso formatosi, quindi si percola la soluzione su resina IR C 50 H + . (80 g altezza dello strato = cm 50) 10 eluendo successivamente con metanolo (1 litro). Si concentra l'eluato sotto vuoto, (12 mm Hg) a 40° ad un volume di circa 1 litro, quindi si diluisce con acqua (55o mi) e si estrae con cloroformio (4 x 400 mi).
Si concentra a secco la fase acquosa sotto vuoto (12 mm 15 Hg) a 40°, si scioglie il residuo in acqua (410 mi), si aggiungono 12 g di carbonio decolorante e si agita a temperatura ambiente per 15'. Si filtra su millipore e si elimina il solvente a pressione ridotta (12 mm Hg) a 40°C, ottenendo 165 g di L-a-glicerilfosforilcolina pura amorfa.
20 H20 = 15,5%
P totale = 84,1%
Fosforo dopo separazione cromatografica: 83,94%
Glicole vicinale: 84,59%
Colina: 85%.
25 Non si notano prodotti di scissione del legame P-O, come si può verificare effettuando l'analisi del campione secondo Broc-kerhoff [J. Lipids Research^, 96 (1963)] 0 secondo Dawson [Biochem. J._75. 45 (I960)]. Un campione, essiccato su P2O5 a 0,05 mm Hg, è stato cristallizzato da etanolo 99% - etere etili-30 co, ottenendo un solido cristallino, bianco, igroscopico. P.f.: 130-131°C; aD = —2,84 (10% in H20).
C = 37,50; H = 7,70; N = 5,38; P = 12,06; colina estere = 46,92; glicole vicinale: 99,8%.
Calcolato:
35 C = 37,35; H = 7,84; N = 5,45; P = 12,04; colina estere = 47,12.
Esempio 2
Si parte da lecitina da soia (P alcalilabile: 2%; P della GPC 40 minimo: 0,5%).
Una sospensione di questa lecitina (600 g) in metanolo (600 mi) è agitata a temperatura ambiente per 60'. Si lascia a riposo a 5° per 60' quindi si decanta il solvente lavando il residuo con metanolo (300 mi).
45 L'estratto metanolico è lasciato a riposo a 5°C per 18 h, quindi è filtrato e concentrato a secco a pressione ridotta (12 mm Hg) a 40°C (g 70) (P alcalilabile: 3,0-3,1%); P della glicerilfosforilcolina: 2,0-2,1%).
La successiva purificazione del residuo fornisce 23 g di leci-50 tina pura.
Si procede come descritto nell'esempio 1 per la lecitina da uovo. Si ottiene GPC di eguale purezza, con rese sostanzialmente identiche.
v
Claims (3)
- 642 083
- 2. Processo secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto che si impiegano da 0,01 a 0,1 moli di CH3ONa/mole di lecitina.2(I)RIVENDICAZIONI 1. Processo per la preparazione di L-a-glicerilfosforilcolinaOH OHiHO-C-Hgii2-o-p(I)Û O-C=H2-CH2-N(ch3)3allo stato puro caratterizzato dal fatto che si sottopone la lecitina purificata a una metanolisi catalizzata da metossido di sodio.
- 3. Processo secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che si impiegano 0,05 moli di CH3ONa/mole di lecitina.
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