DE3000246A1 - Verfahren zur herstellung von l-(alpha)-glycerilphosphorycholin und das dabei erhaltene produkt - Google Patents
Verfahren zur herstellung von l-(alpha)-glycerilphosphorycholin und das dabei erhaltene produktInfo
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Description
LPB Istituto Farmaceutico s.p.a.
Via dei Lavoratori, 54-
2OO92 Cinisello Balsamo (Milano) Italien
Verfahren zur Herstellung von L-a-Glycerylphosphorylcholin und
das dabei erhaltene Produkt
Die Erfindung betrifft ein""neues Verfahren zur Herstellung von
L-a-Glycerylphosphorylcholin der nachfolgend angegebenen Formel
(i) in einem hochreinen Zustand sowie das dabei erhaltene Produkt«
CH9OH
S 2
HO-C-H 0®
intramuskulär oder oral verabreicht wird, so schützt es, wie festgestellt wurde, das Lebergewebe gegen das Eindringen von
Fett, das durch eine hyperlipoproteinhaltige Diöt oder durch
eine Vergiftung durch Tetrachlorkohlenstoff hervorgerufen wird. Es wurde auch gefunden, daß die Verabreichung von L-a-Glycerylphosphorylcholin
gegen Cholestase schützte
Eine wichtige Tatsache, die festgestellt wurde, ist die, daß
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das Glycerylphosphorylcholin in die Struktur der Lipoproteine
eintritt. Pharmokinetische Untersuchungen haben gezeigt, daß das Glycerylphosphorylcholin von dem Intestinum oder an der
Stelle der intramuskulären Inokulation schnell absorbiert wird. Es zirkuliert im Blutstrom und gelangt in die Organe, insbesondere in die Leber, die Nieren und in das Gehirn. Insbesondere in der Leber wird es in den Kreislauf zurückgeführt,
wobei es in den Lipoproteinen enthalten ist. Aufgrund dieses Verhaltens wird angenommen, daß Glycerylphosphorylcholin das
Serum klärt bzw. reinigt.
L-a-Glycerylphosphorylcholin der oben angegebenen Formel (I) kann
hergestellt werden durch Hydrolyse von Lecithin, insbesondere von Eilecithin. Das Hauptproblem, das bei der Herstellung von
L-a-Glycerylphosphorylcholin auftritt, ist seine Reinigung; die Nebenprodukte, welche das durch Hydrolyse erhaltene L-a-Glycerylphosphorylcholin (i) begleiten, verringern seinen therapeutischen Wert und führen häufig zu unerwünschten Nebenwirkungen.
Es wurden jedoch einige verhältnismäßig erfolgreiche Versuche gemacht, die Verbindung (i) in besonders reiner Form herzustellen.
So ist in der US-Patentschrift 2 864 848 ein Verfahren beschrieben,
bei dem die Hydrolyse von Lecithin in Gegenwart von Quecksilber-(il)chlorid durchgeführt wird, das verwendet wird, um die Nebenprodukte in Form von Quecksilber(ll)salzen auszufällen; bei diesem
Verfahren ist es dann erforderlich, aus dem Glycerylphosphorylcholin die überschüssigen'Quecksilber(ll)ionen zu entfernen, die
bekanntlich toxisch sind, und dies wird durchgeführt unter Anwendung einer komplizierten Behandlung mit H«S und BaCO-. In dieser
Patentschrift ist darüber hinaus angegeben, daß durch diese Behandlung
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nicht alle Quecksilber(ll)ionen in ausreichendem Maße entfernt
werden und daß daher nachfolgende zusätzliche Reinigungsprozesse erforderlich sind. Insbesondere muß das Endprodukt durch Bildung
eines Komplexes mit Cadmiumchlorid gereinigt werden0 Der Gesamtarbeitsgang
ist somit sehr kompliziert und das Endprodukt ist nicht frei von Schwermetallen,?
Ein zu dem vorstehend beschriebenen Verfahren analoges Verfahren ist in "Biochemical Preparation1", Band 6, S0 16 bis 19, beschrieben* Die Entfernung des Cadmiums am Ende der Reaktion
erfolgt in diesem Falle Ir- der Weise,, daß man da§ Reaktionspro«
dukt über ein Gemisch von Austauscherharzen laufen lößto Dadurch
wird ebenfalls das Verfahren kompliziert und dies führt darüber hinaus zu einer Abnahme der Produktausbeuteo
Als Alternative zur Hydrolyse beschreibt Brockerhoff im "Journal Li pid Research", 4, 96 (1963) die Methanolyse einer sehr verdünnten
Lecithinlö'sung (etwa 21 g/l) mit Natriummethylat, das in einer
Menge von 3 Hol Methylat pro Mol Phosphatid verwendet wird« Die
unter diesen Bedingungen durchgeführte Methanolyse führt, wie
gefunden wurde, zu einer partiellen Spaltung der P-O-Bindung
unter Bildung von schädlichen Nebenprodukten sowie zu der ge« wünschten Spaltung der Aeyl-Sauerstoff-Bindung, Okui et al beschreiben
in "Yakugaku Zasshi", 84 (12), 1200-1209 (1964), die
■Herstellung der Verbindung (l) aus Eilecithin durch Hydrolyse,
die unter Verwendung von Erdalkalimetallhydroxiden durchgeführt wird. Das dabei erhaltene Produkt ist jedoch durch Sekundärekom=·
ponenten sehr stark verunreinigto Brockerhoff und Yurkowski
weisen in einer kurzen Notiz im "Canadian Journal of Biochemistry",
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43, 1777 (1965), darauf hin, daß die Herstellung der Verbindung
(I) erfolgen kann durch Hydrolyse von Lecithin mit einer quaternären Ammoniumbase (Tetrabutylammoniumhydroxid); dabei schreitet
die Hydrolyse in zufriedenstellender Weise fort, wie Chadha in
"Chem. Phys. Lipids", 4, 104-108 (1970), gezeigt hat. Die Gesamt
hydrolyse mit dieser Base ist jedoch kommerziell kostspielig und ~-
man erhält kein Glycerylphosphorylcholin, das frei von Tetrabutylammoniumhydroxid ist, das in einem Kristallisationsgang von der
Verbindung (i) abgetrennt werden muß. Darüber hinaus eignet sich dieses unbefriedigende Verfahren nicht für die Herstellung in einem
großtechnischen Maßstabe, da es nicht reproduzierbar ist.
Schließlich wird von Cubero Robles und Roels in "Chem. Phys. Lipids",
6, 31-38 (1971), ein Verfahren beschrieben, bei dem L-a-Glycerylphosphorylcholin erhalten wird durch Methanolyse eines Fettextrakts,
der beim Zerkleinern von Eigelb (Eidotter) erhalten wird. Das von diesen Autoren beschriebene Verfahren umfaßt die Extraktion des
Pulvers mit Chloroform/Methanol, die Verdampfung dieses Lösungsmittelgemisches, die Auflösung des Rückstandes in Äther und die
Behandlung der ätherischen Lösung mit Lithiummethylat. Dieses
zuletzt genannte Reagens wird in einer Menge von 1 Mol pro Mol
Phosphatid verwendet. Die Behandlung mit diesem Reagens fuhrt ζυ
einer Mischung aus Glycerylphosphorylcholin (GPC) und Glycerylphosphoryläthanolamin
(GPE). Nach der Neutralisation dieser Mischung mit HCl werden das GCP und das GPE durch Chromatographie
an Siliciumdioxid voneinander getrennt. In der Praxis wurde festgestellt, daß diese Chromatographie zu GPC führt, das durch
kolloidale Kieselsäure verunreinigt ist (wie voraussehbar, wenn man Wasser als Eluierungsmittel verwendet)» Das Kieselsäure-
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Verunreinigungsmittel ist nur durch wiederholte Kristallisationen
des Endproduktes entfernbar» Diese Kristallisationen sind sehr schwierig durchzuführen.
Zusammenfassend kann gesagt werden, daß die vorstehend beschriebenen
Verfahren zur Herstellung von GPC mit einer zufriedenstellenden Reinheit im allgemeinen umständlich und unwirtschaftlich für die
Durchführung in einem großtechnischen Maßstabe sind«
Es wurde nun überraschend gefunden, daß GPC in hoher Reinheit und
in hoher Ausbeute und nach jsinern verhältnismäßig einfachen Verfahren,
das ohne Schwierigkeiten in einem großtechnischen Maßstäbe durchgeführt werden kann, erhalten werden kann, wenn die Methanolyse
von gereinigtem Lecithin in Gegenwart einer katalytischen Menge Natriummethylat, bezogen auf die verwendete Lecithinmenge, durchgeführt
wird.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von L-a-Glycerylphosphorylcholin der Formel
. CH0OH
I 2
I 2
HO-C-H (F . (I)
CR-O-PC
in einem reinen Zustand, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man gereinigtes Lecithin einer durch Natriummethylat katalysierten
Methanolyse unterwirft.
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Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung erhält man L-a-Glycerylphosphorylcholin
in reinem Zustand, wenn man Lecithin in Gegenwart einer katalytischen Menge Natriummethylat einer Methanolyse
unterwirft. Das Verfahren kann in einem großtechnischen Maßstabe wirtschaftlich durchgeführt werden,· weil das gewünschte
Reakiionsprodukt leicht abgetrennt (gewonnen) werden kann.
•Das dabei erhaltene Produkt ist genügend rein, so daß es weder
einer Umkristallisation, die wie oben angegeben besonders schwierig ist, noch einer Komplexbildung mit CdCl^ unterworfen
werden muß, wobei diese-beiden Reinigungsverfahren für die
Durchführung in einem großtechnischen Maßstabe nicht geeignet
sind*
Die Methanolyse wird bei der Durchführung des erfindungsgemäßen
Verfahrens vorzugsweise in der Weise durchgeführt, daß man eine methanolische Lösung von gereinigtem Lecithin, die vorzugsweise
etwa 39 Gew„-# Lecithin und katalytische Mengen CH0ONa enthält,
etwa 60 Minuten lang bei Umgebungstemperatur stehen läßt. Das Cf-LONa wird vorzugsweise in einer Menge von 0,01 bis 0,1, insbesondere
von 0,05 Mol pro Mol Lecithin verwendet. Am Ende der Reaktion werden die Fettsäureester, die sich während der Umsetzung
abgeschieden haben, entfernt und die zurückbleibende Methanollösung wird mit etwa 8 Äqaivalenten eines schwach kationischen
Harzes IR-C50 (FT) pro Äquivalent Natriummethylat behandelt,
um die Natriumionen zu eliminieren.
Das Eluat und die Waschwässer aus dem Harz werden durch Eindampfen
unter vermindertem Druck (beispielsweise von 12 mm Hg) auf ein ge-
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ringes Volumen eingeengt und nach dem Verdünnen mit Wasser mit Chloroform extrahiert zur Entfernung der letzten Spuren der
Fettsäureester, der letzten Spyren von nicht=deacyliertem oder
teilweise deaeyliertem Lecithin und der Spuren von Sphingomyelin,
die im allgemeinen in dem aus Eiern erhaltenen Lecithin zu finden sindo Die wäßrige Phase wird unter vermindertem Druck zur Trockne ■
©ingedampft und dann wird gewUnschtenfalls das Produkt mit Kohle 1SL 50 entfärbte
Das dabei erhalten© Produkt ist frei von Hydrolyseverunreinigungen,
von anorganischen Salzen und von Fettsäureestern und es weist
keine wesentlichen Unterschiede in bezug auf seine Eigenschaften gegenüber den Proben von GPC auf, das durch Bildung des Komplexes
mit CdCl«, aufeinanderfolgende Kristallisationen, Zersetzung desselben
durcH Überleiten desselben über Austauscherharze und
schließlich Kristallisation des dabei erhaltenen L-a-Glyceryl=
phosphoryichoiins erhalten worden war ο
Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene L=a~Glyceryi»
phosphorylcholin v/eist im allgemeinen ©inen Feuchtigkeitsgehalt von etwa 15 GeWo·=^ auf ο Die Feuchtigkeit kann gewUnschtenfalls
entfernt werden durch Trocknen über P0Og unter einem Hochvakuum
und onschließende wiederholte Kristallisationen aus Äthanol/Di =>
öthyiäther oder Äthanol/Xthylacetat; der dabei erhaltene farblose
hygroskopische Feststoff schmilzt bei 130 bis 1310C und hat die
Summenformel CQH,.ANOJPo *
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ο 20 6
Eine solche Arbeitsweise ist nicht erforderlich, wenn es erwünscht
ist, das L~a~Glyeerylphosphorylchoiin in wäßriger Lösung oder
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.10 _
sonst in Verbindung mit anderen aktiven Wirkstoffen in injizierbaren
lyophilisierten Arzneimitteln zu verwenden, wie dies üblicherweise
der Fall ist. Es ist heute möglich, das amorphe Produkt als solches zu verwenden, ohne daß es aufeinanderfolgenden Reinigungen
unterworfen v/erden muß, da die Reinheit des deacylierten Phosphatide
von allen Gesichtspunkten aus betrachtet mehr als zufriedenstellendist.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.
a} Reinigung von Lecithin
Als Ausgangsmaterial wurde Lecithin aus einem rohen Ei (alkalilabilerP
2,7 bis 2,85 %, P von Glycerylphosphorylcholin 2,24 bis
2,52 %) verwendet. Eine Lösung von 0,5 kg rohem Lecithin in 1 1
Methylenchlorid wurde in 6 1 Aceton gegossen, das bei 5 C gerührt wurde0 Nach 60 Minuten wurden die Flüssigkeiten dekantiert und
die Reinigung wurde durchgeführt durch Auflösen des Rückstandes
in 1 1 Methylenehlorid und Gießen der Lösung in 6 1 Aceton wie
oben angegeben. Der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert und bei Umgebungstemperatur unter Vakuum (12 mm Hg) getrocknet (320 g)o
Eine Lösung von 320 g Lecithin in 650 ml Ghloroform/Methanol menverhältnis IiI) wurde an 1,4 kg Al«0g ehromatographiert, wobei
die Elution mit 3,5 1 Chloroform/Methanol (Volumenverhältnis lsi)
durchgeführt wurde* Das Eluat wurde bei einer Temperatur von
40 C unter Vakuum (12 mm Hg) zur Trockne eingeengt und dann erneut
*tgesetzlich geschützten
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in 350 ml Methylenchlorid gelöst, zentrifugiert und bei 5 C unter
Rühren in 2,4 1 Aceton gegossen»
Nach 60-minütigem Stehenlassen bei 5 C wurde der gebildete Niederschlag abfiltriert und bei Umgebungstemperatur unter Vakuum
(12 mm Hg) getrocknet, wobei man 210 g reines Lecithin erhielt (alkalilabiler Ps 3,70 - 3,80 %, P von Glycerylphosphorylcholin
3,70 bis 3,80 %).
b) Herstellung von. L°«°Glycerylphosphorylcholin
Eine Lösung von etwa 500 g„(0,7 Mol) des in dem obigen Abschnitt
(a) erhaltenen gereinigten Lecithins in 1 1 wasserfreiem Methanol,
das 0,039 Mol Natriummethylat enthielt, wurde 60 Minuten lang bei Umgebungstemperatur stehen gelassen ο Die gebildete ölige
Schicht wurde abgetrennt und dann wurde die Lösung durch ein Bett aus 80 g des Harzes IR C 50 » mit einer Höhe von 50 cm filtriert,
wobei das adsorbierte Material anschließend mit Methanol eluiert wurde, das jeweils in 1 !^Mengen verwendet wurdeo Das Eluat
wurde bei 40 C unter Vakuum (12 mm Hg) bis auf ein Volumen von etwa 1 1 eingeengt, dann mit 550 ml Wasser verdünnt und mit
4 χ 400 ml Chloroform extrahierte
Die wäßrige Phase v/urde bei 40 C unter Vakuum (12 mm Hg) zur
Trockne eingeengt, der Rückstand wurde in 410 ml Wasser gelöst, es wurden 12 g entfärbende Kohle zugegeben und die wäßrige Phase
wurde 15 Minuten lang bei Umgebungstemperatur gerührte Dann wurde über Millipore filtriert und das Lösungsmittel wurde
bei 40 C unter vermindertem Druck (12 mm Hg) entfernt, wobei man 165 g L-tt-Giycerylphosphorylchoiin in reiner amorpher Form erhielt.
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m 12..
H2O = 15,5 %
Gesamt-P =84,1 %
Phosphor nach der chromatographischen Trennung: 83,94 %
Vicinales Glycol: 84,59 %
Spaltungsprodukte der P-O-Bindung wurden nicht festgestellt,
was durch Durchführung einer Analyse mit der Probe gemäß Brockerhoff (vgl. "J. Lipids Research", 4, 96 (1963)) oder
gemäß Dawson (vgl. "J. Biochem.", 75, 45 (i960)) überprüft wurde.
Eine bei 0,05 mm Hg über Pn^ 5 getrocknete Probe wurde aus
Äthanol/Athyläther (mit- 99, % Äthanol) kristallisiert, wobei man
einen weißen, hygroskopischen, kristallinen Feststoff erhielt, der bei 130 bis 131°C schmolz, «D = -2,84° (10 % in H2O).
ber.: C = 37,35, H = 7,84, N = 5,45, P = 12,04 gef.: 37,50 7,70 5,38 12,06 %
ber.: Cholinester = 47,12 %
gef.: 46,92 %
gef.: 46,92 %
vicinales Glykol = 99,8 %.
Als Ausgangsmaterial wurde Sojalecithin (alkalilabiler Phosphor: 2 %,
minimaler P von GPC: 0,5 %) verwendet. Eine Suspension von 600 g
dieses Lecithins in 600 ml Methanol wurde 60 Minuten lang bei Umgebungstemperatur gerührt. Sie wurde 60 Minuten lang bei 50C
stehen gelassen und dann wurde das Lösungsmittel dekantiert, der Rückstand wurde mit 300 ml Methanol gewaschen. Der Methanolextrakt
wurde 18 Stunden lang bei 5 C stehen gelassen, dann wurde er filtriert und bei 40 C unter vermindertem Druck (12 mm Hg)
zur Trockne eingeengt (70 g) (alkalilabiler P: 3,0-3,1 %-,
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P von Glycerylphosphorylcholins 2,0 bis 2,1 %)* Nach wiederholter
Reinigung des Rückstandes erhielt man 20 g reines Lecithin.
Das Lecithin wurde auf die gleiche Weise wie das in Beispiel 1
verwendete Eilecithin behandelt. Dabei wurde GPC in gleicher
Reinheit und mit praktisch identischer Ausbeute wie in Beispiel 1 erhalten.
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Claims (8)
- 8900 Augsburg 22, 4.1.1980SS S9 . TRlSt-ON 96096AUGSBURG 22Patentanspruch\ 1 · J Verfahren zur Herstellung von L-a-Glycerylphosphoryl» cholin der FormelCH9OH .,HO-C-H (P t rO 0-CH2-CH2-W(CH3).in reinem Zustand, dadurch gekennzeichnet daß man gereinigtes Lecithin einer durch Natriummethylqt katalysierten Methanolyse unterwirft«
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, man pro Mol Lecithin 0,01 bis 0,1 Mol QLONg verwendet.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man pro Mol Lecithin 0,05 Mol CH-ONa verwendet«
- 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man es bei Umgebungstemperatur durchfuhrt.1300U/0913
- 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man es über einen Zeitraum von etwa Minuten durchführt.
- 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man gereinigtes Eilecithin verwendet.
- 7» Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man gereinigtes Sojalecithin verwendet.
- 8. L-a-Glycerylphosphor^lcholin, dadurch gekennzeichnet, daß es nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis hergestellt worden ist.130014/0913
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8110 | Request for examination paragraph 44 | ||
| D2 | Grant after examination | ||
| 8363 | Opposition against the patent | ||
| 8366 | Restricted maintained after opposition proceedings | ||
| 8305 | Restricted maintenance of patent after opposition | ||
| D4 | Patent maintained restricted | ||
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