IT9019895A1

IT9019895A1 - Procedimento per la separazione dei principali componenti di una miscela di fosfolipidi grezzi deacilati

Info

Publication number: IT9019895A1
Application number: IT019895A
Authority: IT
Inventors: Costantino Coccoli; Giovanni Tronconi
Original assignee: Istituto Chemioterapico; Ora Prime Europ Therapeuticals Spa Euticals S
Priority date: 1990-03-30
Filing date: 1990-03-30
Publication date: 1991-09-30
Also published as: IT9019895A0; WO1991015494A1; EP0522021A1; IT1240614B

Description

( G P S ) x My ( I )

dove GPS è l ' anione della L-alf a-gl i ceri 1 -fosfori 1 -ser i n a

M è: Na, K, Ca, Mg, Ba, Zn, Fe

x assume, approssimativamente, i valori di : 1 e 3 y assume, approssimativamente, i valori di : 1 ,5; 2; 2,5 e 3.

DESCRIZIONE

La presente invenzione riguarda un procedimento per la separazione dei principali componenti di una miscela di fosfolipidi grezzi deacilati .

Tal i componenti principali a cui è rivolto l 'interesse del la presente invenzione sono indicati con le sigle GPS, GPC e GPE.

Nella descrizione che segue, si chiarisce che per comodità di lettura sono utilizzate le sigle GPS, GPC, GPE e GPI per indicare rispettivamente L- al f a-gl i ceri 1 fosfori 1 ser i n a , L-al f a- gl i cer i 1 f osf or i 1 col i na , L-a 1 f a-g 1 i cer i If osf or i T et ano 1 ammi na e L - a 1 fa- g 1 i cer i 1 fosfori 1 i nos i tol o, e le sigle PS, PC, PE e PI rispetti -vamente per fosf at i di 1 seri na, fosfati di 1 col i na, fosfati di 1 etanol ammi n e f o sf at i di 1 nos i tol o .

Con riferimento allo stato del la tecnica, Hawthone (Biochem J. 71 , 195 (1959) ottiene GPS uti l izzando fosfati di 1 seri na purificata e conducendo una cromatografia su resine a scambio ionico basiche forti in forma formiate. La difficoltà della separazione è ben evidenziata dall'autore, che mette in risalto come tra le varie miscele eluenti utilizzate, ottiene risultati positivi solo utilizzando come eluente una miscela di sodio tetraborato e ammonio acetato a gradiente di concentrazione. Il metodo oltre ad essere adatto solo a scopo analitico è anche estremamente oneroso, poiché richiede la preparazione di PS ad un buon grado di purezza.

In Eur. Pat. Appi. EP 217,765 è descritta la preparazione di GPC e GPE da fosfolipidi grezzi da soia. Mediante tale procedimento, dalla soluzione alcolica della miscela deacilata grezza si separa il complesso insolubile (GPC GPE) ZnC12 (I), successivamente, dalla soluzione acquosa del complesso (I) viene eliminato il cloruro di zinco mediante precipitazione e successiva filtrazione del complesso ZnC12 * Py2 insolubile in acqua (dove Py è piridina), ottenendo una soluzione di GPC GPE pura dalla quale vengono poi separate GPC e GPE pure su resine basiche forti.

Il metodo non è però utilizzabile quando anziché lecitine di soia si impiegano fosfolipidi grezzi di origine animale (che sono i soli a contenere, oltre a PC e PE anche quantità significative di PS), poiché non consente di ottenere una miscela GPC GPE pura, dalla quale isolare poi GPC e GPE pure.

In tal caso infatti non si riescono ad ottenere i complessi di formula (I), o complessi (GPC GPE GPS) ZnC12 (II) poiché il trattamento con cloruro di zinco delle soluzioni alcoliche delle miscele deacilate grezze porta solo alla precipitazione della GPS sotto forma di sali GPS Zn e/o (GPS)2 Zn.

Riassumendo non è fino ad oggi descritto in letteratura un metodo per ottenere GPS, GPE, GPC pure da fosfolipidi grezzi che contengono i tre corrispondenti fosfatidi (PS, PE, PC).

Secondo la presente invenzione, è proposto un procedimento che consente di ottenere GPS, GPE, GPC pure mediante deaer azione di fosfolipidi grezzi che contengano quantità significative di PS, PE e PC.

Più specificamente, la presente invenzione propone un procedimento per la separazione dei componenti L-alfa-gliceri1fosfori1serina (GPS), L-alfa-glicerilfosforilcolina (GPC), e L-alfa-glicerilfosfori1etanolammina (GPE) da una miscela di fosfolipidi grezzi che li contiene, caratterizzato dal fatto di comprendere lo stadio di fare reagire detta miscela con almeno un composto scelto tra i seguenti: cloruro, bromuro, acetato di uno dei seguenti metalli: calcio, magnesio, bario, zinco, ferro; oppure solfato, fosfato, alcolato quale metilato, etilato di sodio o di potassio, con tale reazione formandosi almeno un sale di formula generale

(GPS) x My (I)

dove GPS è l'anione della L-alfa-gliceri1-fosfori1-serina

M è: Na, K, Ca, Mg, Ba, Zn, Fe

x assume, approssimativamente, i valori di: 1 e 3 y assume, approssimativamente, i valori di: 1,5; 2; 2,5 e 3.

Secondo una prima forma di attuazione del procedimento della presente invenzione, è previsto un procedimento, caratterizzato dal fatto di comprendere gli stadi seguenti:

a) reazione di una soluzione di detta miscela con un primo di detti composti, costituito da un alcolato di sodio o di potassio, ottenendo un residuo insolubile che viene separato dalla soluzione della miscela di reazione,

b) trattamento di detta soluzione della miscela di reazione con un acido fino a raggiungere un pH compreso tra 7 e 10.5, ottenendo così un residuo insolubile comprendente {GPSlM^ in cui M=Na, K, che viene separato dalla soluzione la quale comprende GPC e GPE ,

c) reazione di detto ( G P S ) M ^ i <n >cui <M >= Na, K , con un secondo di detti composti , scelto tra i seguenti : cloruro, bromuro, acetato di uno dei seguenti metalli : calcio, magnesio, bario, zinco, ferro, così formandosi un sale di detta formul a generale I (GPS)^My

in cui M = Ca, Mg; Ba, Zn, Fe e y ha uno dei valori sopra definiti , detto sale essendo insolubile e venendo separato dall a soluzione di reazione,

d) trattamento di detto sale (GPS)^My formato nello stadio c) , opportunamente purificato, con una resina acida in ambiente acquoso, in tal modo ottenendosi GPS.

Secondo una ulteriore forma di attuazione del l a presente invenzione, è previsto un procedimento, caratterizzato dal fatto di comprendere gl i stadi seguenti :

a) reazione di una soluzione di detta miscela con un primo di detti composti costituito da un alcolato di sodio o di potassio, ottenendo un residuo insolubi le che viene separato dalla soluzione del la misce-1 a di reazi one,

b) trattamento di detta soluzione del la mi scela di reazione con acido cloridrico o acetico fino a raggiungere un pH compreso tra 6 e 9,

c) reazione di detta soluzione avente pH compreso tra 6 e 9 con un secondo di detti composti scelto tra i seguenti: bromuro, cloruro, acetato di uno dei seguenti metalli: Ca, Mg, Ba, Zn, Fe, così formandosi un sale di formula generale I (GPSl^My

in cui M è uno dei metalli appena definiti e y ha il valore sopra specificato, detto sale essendo insolubile e venendo separato dalla soluzione di reazione per ottenere GPS pura.

Quest'ultima forma di attuazione è in particolare utile se si desidera ottenere solo GPS pura.

Una ulteriore forma di attuazione dell'invenzione prevede un procedimento caratterizzato dal fatto di comprendere gli stadi seguenti:

a) reazione di una soluzione di detta miscela con un primo di detti composti costituito da un alcolato di sodio o di potassio, ottenendo un residuo insolubile che viene separato dalla soluzione della miscela di reazione,

b) trattamento della soluzione della miscela di reazione secondo a) con una resina cationica acida in ambiente non acquoso,

c) trattamento della miscela di reazione pròveniente da b) con resine basiche in ambiente acquoso, così separando GPC dalla miscela GPS GPE.

Quest'ultima variante dell'invenzione è in particolare adatta se si desidera separare dalla miscela di partenza la sola GPC.

Secondo il procedimento della presente invenzione, nello stadio a) sopra definito si ottiene sia la deacilazione della miscela di fosfolipidi grezzi di partenza, sia la precipitazione di un residuo insolubile che contiene la maggior parte del GPI. Quest'ultimo viene allontanato mediante filtrazione.

Il procedimento oggetto della presente invenzione nella sua principale forma di attuazione può essere così descritto.

Si tratta la miscela di fosfolipidi grezzi in sospensione alcolica (preferibi1mente metanoìica o etanolica) con un alcolato di un metallo alcalino (preferibi1mente metilato o etilato di sodio o potassio) e si allontana il residuo insolubile (che contiene una gran parte del GPI) mediante filtrazione, ottenendo una soluzione alcolica (1) contenente GPC, GPE, GPS e tracce di GPI. Si porta la soluzione ad un pH tra 7 e 10.5 con un acido minerale (preferibilmente solforico o fosforico), quindi si filtra ottenendo un residuo (2) contenente GPS Na2 o GPS K2 ed una soluzione alcolica (3), contenente GPC, GPE e tracce di GPI. Si lava il residuo (2) con un alcool (preferibilmente metanolo, etanolo o isopropanolo), quindi lo si estrae con un alcol (preferibiImente metanolo, etanolo o isopropanolo) contenente una percentuale di acqua preferibilmente compresa tra 3 e 10% v/v e portato con acido acetico ad un pH compreso tra 5 e 7. Dall'estratto idroalcolico (4), che contiene la GPS Na2 o GPS K2 viene dapprima eliminato il solfato o fosfato di sodio o di potassio mediante filtrazione, quindi si aggiunge una soluzione alcolica (preferibi1mente metanolica o etanolica) di un sale di un metallo bivalente (preferibilmente bromuro/cloruro/acetatp di calcio, bario, magnesio, zinco, ferro) ad una concentrazione preferibilmente compresa tra 10 e 20% p/v. Precipita il sale insolubile (GPS)3 My (III) (dove M iCa, Mg, Ba, Zn, Fe e y assume approssimativamente i valori: 1,5; 2; 2,5; 3), che viene sciolto in acqua preferibilmente ad una concentrazione del 30+60% e precipitato per aggiunta di acido acetico in quantità tale da ottenere un rapporto v/v acido/acqua preferibilmente compreso tra 20 e 50. Dal sale (III) cosi ottenuto, si ottiene GPS pura mediante eliminazione dello ione metallico su una resina acida in ambiente acquoso, concentrazione della soluzione a piccolo volume e precipitazione con acetone.

La soluzione alcolica (3) , che contiene GPC e GPE, viene eluita su una resina cationica in forma acida ambientata in alcoli (CI - C 4 ) o tetr ai drof ur ano, acetonitrile, acetone (con un contenuto di acqua pref er i bi 1 mente compreso tra 0,1 e 10%). Si lava la resina con il solvente già utilizzato fino ad eliminazione di tutte le impurezze, quindi con acqua, ottenendo una soluzione acquosa di GPE e CPC pure dalla quale si separano facilmente GPC e GPE pure mediante eluizione su resine basiche in forma idrossido.

Alternativamente si concentra prima la soluzione alcolica (3) a piccolo volume, si elimina la fase oleosa separatasi e si purifica, come prima descritto, la fase alcolica contenente GPC, GPE grezze.

Qualora occorra ottenere solo GPS, si porta la soluzione alcolica (1) ad un pH compreso tra 6 e 9 con acido cloridrico o acetico, quindi si aggiunge una soluzione alcolica ( pref er i bi 1 mente metanolica o etanolica) di un sale di un metallo bivalente (preferibilmente br omuro/cl orur o/ acet ato di calcio, bario, magnesio, zinco, ferro) ad una concentrazione preferibilmente compresa tra 10 e 20% p/v e si isola il sale insolubile (III). Si purifica il sale così ottenuto mediante precipitazione da acqua/acido acetico e si isola la GPS come prima descritto.

Se invece della sola GPS occorre ottenere anche GPC e GPE è più conveniente isolare GPS Na2 o GPS K2, poiché in tal caso la soluzione contenente GPC e GPE, che deve essere purificata, non contiene MX2 e possono quindi essere utilizzate minori quantità di resine cationiche in forma acida per la purificazione.

Qualora invece occorra ottenere solo GPC è più conveniente eluire direttamente la soluzione alcolica (1) su una resina cationica in forma acida e in ambiente non acquoso. Si ottiene cosi dapprima una soluzione acquosa di GPC GPE GPS pura dalla quale si ottiene facilmente GPC pura (come meglio evidenziato nell'esempio IV), poiché la GPS viene trattenuta dalle resine basiche insieme alla GPE, e si evita così la precipitazione, separazione e lavaggio dei sali (III), (VII) e (Vili).

Allo scopo di meglio comprendere caratteristiche e vantaggi della presente invenzione, se ne descrivono di seguito esempi non limitativi di pratica attuazione.

ESEMPIO I: Preparazione di GPS, GPC e GPE

a) Preparazione di GPS

La sospensione di 250 g di fosfolipidi grezzi (PC circa 18%, PE circa 18%, PS circa 5%, PI circa 3%) in 1,2 1 di metanolo contenente 11,2 g di metilato di sodio e agitata a temperatura ambiente e in ambiente anidro per 18 ore. Si filtra lavando il residuo con metanolo (3 x 50 mi) che è riunito al filtrato. Si porta a pH 9 la soluzione metanolica (1) con H2S0440%, si agita per 30 minuti, si filtra lavando il residuo con 2 x 50 mi di metanolo che è aggiunto al filtrato (2). Si scioglie il residuo (GPS Na2) in 50 mi di acqua contenente 10 mi di acido acetico, si diluisce con 500 mi di metanolo e si agita a temperatura ambiente per 2 ore. Si filtra lavando il residuo (Na2S04) con 2 x 50 mi di metanolo che è riunito al filtrato. Alla soluzione idroalcolica (3) cosi ottenuta, si aggiungono sotto agitazione 30 mi di una soluzione metanolica di acetato di zinco al 10% p/v. Si agita a temperatura ambiente per 3 ore, quindi si filtra, si lava con metanolo (2 x 50 mi). Si scioglie il solido in acqua (5 mi) si aggiungono 200 mi di acido acetico, si agita a temperatura ambiente per 12 ore. Si filtra, si lava il solido con metanolo quindi si essicca sotto vuoto a 40°C su P205 ottenendo 3,3 g di una miscela di sali di formula approssimativa (GPS)3 Zn2

ca l co l ato Zn++ = 1 3 , 89% = 1 4 , 46%

GPS 85 , 50% 85 , 54%

Il solido è sciolto in acqua (10 mi) ed eluito su 50 mi di IR200 H ambientata in acqua. Si lava la resina con 100 mi di acqua. Si concentra a piccolo volume sotto vuoto (circa 8 mi), si aggiungono 10 mi di metanolo quindi si versa la soluzione in 200 mi di acetone. Si agita a temperatura ambiente per 8 ore, si filtra, si lava il solido con etanolo (2 x 20 mi) quindi si essicca sotto vuoto su P205.

Si ottengono 2,2 g di GPS (solido molto idroscopico )

calcolato per C6 H14 N 08 P (PM = 259,154) C = 27,90 C = 27,81

H = 5,51 H = 5,44

N = 5,35 N = 5,40

À D = - 2,20 (c = 2,8 H20)

Λ D = 4,52 (c = 2,1 HC1 IN)

H<1 >NMR (D20):

cS= 3,60 - 3,90 (m2H)

6 - 3,90 - 4,15 (m3H)

«5= 4,30 - 4,70 (m3H)

b) Preparazione di GPC

La soluzione metanolica (2) è neutralizzata con acido acetico e concentrata ad un volume di 350 mi circa. Si separa la fase oleosa (inferiore), quindi si eluisce la fase metanolica (superiore) su 250 mi di I R ZOO H, ambientata in metanolo. Si lava la resina con metanolo (circa 1 1 ) fi no a completa eliminazione delle impurezze (controllo TLC del metanolo eluito) , quindi si lava con acqua (circa 800 mi ) . La soluzione acquosa (contenente GPC GPE pure) è trattata con 2 g di carbone decolorante, fi ltrata ed eluita dapprima su 120 mi di resina IR 93 OH (1 ), ambientata in acqua lavando l a resina con 200 mi di acqua successivamente su 120 midi resina IR 401 OH (2) , ambientata in acqua, l avando la resina con 200 mi di acqua ed infine su 20 mi di IRC50 H (3), ambientata in acqua lavando la resina con 40 mi di acqua. Dalla soluzione acquosa ottenuta si elimina l ' acqua sotto vuoto, ottenendo 10,1 g di GPC pura:

(KF = 12,1%)

liquido limpido molto viscoso:

di D : -2,8

(C = 3,1% in H20 )

titolo (HC104) = 87,8%

Il prodotto cristallizzato da etanolo ed essiccato sotto vuoto su P2 05 è un solido estremamente igroscopico con:

pf = 135-1 36°C

Calcolato per C8 H20 N06 P ( PM = 257,20)

trovato

C = 37,36 37,29

H 7,84 7,89

N 5,44 5,42

c) Preparazione di GPE:

Dopo la separazione della GPC, si lava prima la resina IR401 OH (2) con 200 mi di una soluzione acquosa di acido acetico allo 0,5% (che viene eliminato). Successivamente si lava con 500 mi circa di una soluzione acquosa di acido acetico al 5%. Si concentra a piccolo volume, si tratta la soluzione con carbone decolorante, si filtra e si concentra sotto vuoto, ottenendo 9 g di GPE pura. Olio che solidifica per riposo a temperatura ambiente KF = 8,2%. Titolo (HC104)= 91,6%

oL D = - 3,1 (c = 4,1 H20)

Utilizzando il procedimento dell'esempio (I), ma trattando la soluzione idroalcolica 3) con una soluzione metanolica di cloruro, bromuro o acetato di calcio, magnesio, bario, ferro si ottengono o corrispondenti sali, dai quali si ottiene GPS, come prima descri11o.

ESEMPIO II: Preparazione di GPS

La soluzione alcolica 1) dell'esempio (I) ottenuza utilizzando 250 g di fosfolipidi grezzi è portata a pH 6 con acido acetico glaciale. Si aggiungono 23 mi di una soluzione metanolica di cloruro di zinco al 10% p/v, si agita a temperatura ambiente per 1 ora, quindi si filtra. Si sospende il residuo in metanolo (100 mi), si filtra, quindi si scioglie il residuo in acqua (8 mi).

Si aggiungono 200 mi di acido acetico, si agita a temperatura ambiente per 10 ore, quindi si filtra e si lava il residuo con metanolo (3 x 30 mi). Il solido ((GPS)3 Zn2,5 contenente circa un 8% di NaCl) è sciolto in acqua ed eluito su 60 mi di IR200 H ambientata in acqua. Si lava la resina con 150 mi di acqua. Si eluisce la soluzione acquosa su 1 mi di IR93 OH (per eliminare l’HCl), quindi si concentra a piccolo volume e si procede come descritto nell'esempio (la), ottenendo 1,9 g di GPS. Utilizzando il procedimento dell'esempio (II), ma utilizzando cloruro, bromuro, acetato di magnesio, bario, zinco, ferro, si ottengono i corrispondenti sali, dai quali si ottiene poi GPS.

ESEMPIO III : Preparazione di (GPS)2Ca

Nella soluzione idroaìcolica 3) dell'esempio (I) ottenuta utilizzando 500 g di fosfolipidi grezzi, si aggiungono 46 mi di una soluzione metanolica di ZnC12 al 10% p/v. Si agita a temperatura ambiente per 1 ora, quindi si filtra lavando il precipitato con metanolo (3 x 40 mi). Si scioglie il solido((GPS)3 Zn2 contenente un 33⁄4 circa di NaCl) in acqua (30 mi), quindi si eluisce su 150 mi di resina IR200H ambientata in acqua e lavando la resina con 300 mi di acqua. Si tratta la soluzione acquosa sotto agitazione con IR 401 (fino ad eliminare gli ioni cloruro, circa 2 g), quindi si filtra. Alla soluzione si aggiungono 6 g di CaC03 e si agita a temperatura ambiente per 3 ore. Si filtra, si concentra a piccolo volume (circa 10 mi) quindi si diluisce con 300 mi di acido acetico. Si agita per 16 ore quindi s1 filtra. Si risospende il solido in metanolo, si filtra, e si essicca sotto vuoto a 40°C su P205:

Si ottengono 3,5 g di (GPS)2Ca

Solido non igroscopico

Calcolato, per C12 H26 N2 016 P2 Ca (PM = 556,372)

trovato

C = 25,90 25,81

H = 4,71 4,79

N 5,03 5,10

Ca 7,20 7,08

Λ. D = - 12,32 (c = 2,3 H20)

o( D = 2,72 (c = 3,6 HC1 IN).

Con lo stesso procedimento dell 'esempio (III), ma utilizzando ossido di zinco, carbonato di magnesio invece del carbonato di calcio, si ottengono i sali di formula approssimativa:

( GPS ) 3 Zn2 calcolato Zn% = 14,50 trovato = 14,95 D = - 14,9 ( c = 2,16 H20 )

0( D = 1 ,88 (c = 2,28 HC1 IN)

( GPS ) 3 Mg2 calcolato Mg% = 5,92 trovato = 5,60 i D = -11 ,87 (c = 2,03 H20 )

1 D = 3 ,29 (c = 2, 12 HC1 IN)

ESEMPIO IV: Preparazione di GPC

La soluzione alcolica 1) dell 'esempio (I), ottenuta utilizzando 250 g di fosfolipidi grezzi , è eluita su 300 mi di IR200 H ambientata in metanolo. Si lava la resina con 1,4 1 di metanolofino ad eliminazione completa delle impurezze (controllo TLC), quindi con acqua (1 1). La soluzione acquosa contenente GPC GPE GPS è trattata con 2 g di carbone decolorante e quindi eluita su 120 mi di 1 R 93 OH lavando la resina con 200 mi di acqua, successivamente su 120 mi di IR401 OH lavando la resina con 200 mi di acqua ed infine su 20 mi di IRC50 H lavando la resina con 40 mi di acqua. Dalla soluzione acquosa così ottenuta si elimina l 'acqua concentrando sotto vuoto. Si ottengono 11 ,2 g di GPC pura ( K F = 15, 2%). (La GPS viene trattenuta insieme alla GPE dalla IR93 e dalla IR401).

ESEMPIO V: Preparazione di GPC e GPE da lecitina di soia grezza

a) La sospensione di lecitina di soia grezza (500 g) (PC circa 12%, PE circa 15%, PI circa 8%) in metanolo (21) contenente metilato di sodio (23 g) è agitata a temperatura ambiente e in ambiente anidro per 4 ore. Si filtra lavando il residuo con metanolo (2 x 100 mi) che è riunito al filtrato. Si neutralizza la soluzione alcolica (pH circa 6) con acido acetico, quindi si concentra ad un volume di 600 mi circa. Si separa la fase metanolica inferiore (che contiene GPC e GPE grezza), quindi la si eluisce su 250 mi di resina IR200 H ambientata in md3⁄4nolo. Si lava la resina con metanolo (1 1) fino ad eliminazione completa delle impurezze (controllo TLC del metanolo eluito), quindi si lava con acqua (500 mi).

Tutte le operazioni in metanolo anidro su resina (eluizione e lavaggio con metanolo) devono essere completate in un tempo non superiore ad 1 ora.

La soluzione acquosa contenente GPC GPE pura è trattata con 3 g di carbone decolorante, filtrata ed eluita su 120 mi di resina IR93 OH, poi su 120 mi di IR401 OH ed infine su 20 mi di IRC50 H, come descritto nell'esempio (1 b).

Si ottengono 16,5 g di GPC {KF 10,2%).

Resa (circa 95% calcolata sul contenuto di PC). b) Dopo la separazione della GPC si procede come descritto nell'esempio (I c) ottenendo 20 g di GPE (KF 16%).

Resa (circa 89% sul contenuto di PE).

Si può rilevare che

1) con il procedimento dell’Esempio V, ma utilizzando 250 mi di resina Dowex X4 H, si ottengono risultati analoghi in \ ora;

2) con il procedimento dell'Esempio V, ma eluendo la fase metanolica prima su 200 mi di IR120 H, ambientata in metanolo/acqua (9/1) e passando successivamente l'eluato ed il lavaggio della prima colonna (metanolo/acqua 9/1) su una seconda colonna di 130 mi di IRÌ20 H (tempo di permanenza \ ora), si ottengono risultati analoghi a quelli descritti nell'esempio V;

3) con il procedimento dell'Esempio V, ma utilizzando acqua come solvente e una qualsiasi delle resine sopra descritte, non si ottiene la miscela GPC GPE pura.

ESEMPIO VI: Preparazione di PC da fosfolipidi da uovo grezzi (lecitina da uovo)

La soluzione di 150 g di fosfolipidi da uovo (PC circa 45% PE, circa 10%) in etanolo (400 mi) contenente 2,5 g di metilato di sodio è agitata a temperatura ambiente e in ambiente acido per 3 ore. Si neutralizza (pii circa 6) con acido acetico, si aggiunge una miscela di 3 g di carbone decolorante 3 g di farina fossile, si filtra, quindi si eluisce la soluzione su 320 mi di resina IRC50H ambientata in etanolo. Si lava la resina con etanolo fino a completa eliminazione delle impurezze (controllo TLC dell'etanolo eluito), quindi con acqua (circa 600 mi). La soluzione acquosa che contiene GPC GPE pura è trattata come descritto nell'esempio I b), utilizzando 60 mi di IR93 OH, 90 mi di IRI47 OH e 15 mi di IRC50 H.

Si ottengono 19 g di GPC (KF = 13,2%).

Note:

1) con il procedimento dell'Esempio VI, ma utilizzando come solvente di purificazione una miscela tetraidrofurano/acqua 9/1 o n-propanolo, si ottengono risultati analoghi;

2) con il procedimento dell'Esempio VI, ma utilizzando come solvente di purificazione metanolo, non si ottiene una miscela GPC GPE pura.

A generale commento di quanto sopra descritto, si può aggiungere che - con particolare riguardo agli stadi di trattamento con resine - per ottenere una miscela GPC GPE pura è stata studiata la purificazione su resine cat ioniche in forma acida e in solvente non acquoso delle mi scele deacilate grezze ottenute dopo la separazione del la GPS come sali ( I II) , (VII) e (Vi li ) (intendendo per solventi "non acquosi" solventi anidri o contenenti limitate quantità di acqua: < 10% v/v) .

Si è notato che, dato il carattere anfotero di GPC e GPE, è possibi le sfruttare la basicità delle GPE e GPC ed eliminare le impurezze acide (tra cui GPI ) , le impurezze neutre idrosolubili e le impurezze basiche più forti di GPC e GPE ottenendo una miscela di GPC e GPE pura.

La purificazione prima accennata consiste nel ì 'eluire su una resina cationica in forma acida ambientata in solvente non acquoso le soluzioni grezze provenienti dalla deaer azione, l avare la resina prima con solvente e poi con acqua.

Durante l 'eluizione dell a soluzione deaci lata grezza in ambiente non acquoso GPC e GPE, e le altre sostanze basiche sono fissate stabilmente alla resina, che può così essere abbondantemente l avata con solvente, consentendo la totale eliminazione di tutte le impurezze acide e neutre, senza eluire GPC e GPE. Quando poi si lava la resina con acqua, poiché GPC e GPE sono basi molto debol i , in ambiente acquoso l'equilibrio tra basi legate alla resina e basi libere è praticamente totalmente spostato verso le basi libere, e quindi GPC e GPE vengono eluite immediatamente ed in modo quantitativo. Vengono in tal modo anche eliminate le impurezze con caratteristiche di basicità più spiccate di GPC e GPE, quali ad esempio tracce di etanolammina e colina, perchè utilizzando resine cationiche in forma acida, queste vengono eluite solo utilizzando eluenti acidi o basici, ma non con acqua.

Questo procedimento di purificazione è molto vantaggioso anche quando si utilizzando fosfolipidi da soia e permette di ottenere GPC ad elevato grado di purezza, in modo più semplice e con rese più elevate rispetto al metodo descritto in Eur. Pat. Appi. EP 217,765, 8.4.1987. Come infatti è anche riportato nel brevetto citato, per ottenere GPC pura occorre condurre la deacilazione sul1<1>estratto etanolico della lecitina di soia e si ottiene GPC con una resa del 62% circa (calcolata sul contenuto in PC mediamente presente nella lecitina di soia). Se si conduce la deacilazione sull'estratto metanolico o direttamente sulla sospensione metanolica, si ottiene GPC con resa molto maggiore (circa 95%), ma il prodotto ottenuto ha un grado di purezza non soddisfacente e deve essere ripurificato mediante nuova formazione del complesso GPC ZnC12 e, in tal caso, il procedimento diventerebbe alquanto laborioso.

Mediante il procedimento di purificazione descritto nel presente metodo si ottiene invece direttamente GPC GPE pure anche operando in metanolo e questo consente di ottenere GPC ad elevato grado di purezza in modo semplice e con rese del 92-95% circa.

Le miscele deacilate grezze dalle quali non è stata separata prima la GPS come sali (III), (VII) e (Vili) mostrano lo stesso comportamento, come anche prevedibile dato il carattere anfotero di GPS e da queste, dopo la purificazione su resine acide in ambiente non acquoso, si ottiene una miscela pura GPC GPE GPS. Poiché le considerazioni descritte in seguito si applicano indifferentemente a miscele GPC GPE (A) e GPC GPE GPS (B), per comodità sarà utilizzata la sola dicitura GPC/E/S per indicare indifferentemente le miscele (A) o (B).

La purificazione di miscele grezze GPC/E/S su resine cationiche in forma acida e in ambiente non acquoso sfruttando la loro basicità non è descritta in letteratura e richiede condizioni operative ben definite (particolari accoppiamenti resina/solventi), senza le quali non è possibile formare legami stabili GPC/E/S-resina e non è possibile evitare la forte degradazione (a volte anche totale) che in generale GPC/E/S subiscono in ambiente non acquoso su resine cationiche forti in forma acida (utilizzando le resine cationiche in forma acida ma in ambiente acquoso la degradazione è molto meno significativa se non addirittura assente, però non è possibile formare legami stabili e condurre quindi la purificazione descritta). Ad esempio in GB 2,058,792 (1983) viene eluita una soluzione metanolica di GPC pura su resina acida debole, ma tale operazione è però condotta solo per eliminare lo ione sodio e la GPC non viene legata alla resina quantitativamente e in modo praticamente irreversibile perchè, come sarà meglio chiarito in seguito, l'accoppiamento resina/solvente utilizzato non consente di sfruttare la basicità di GPC/E/S e quindi la purificazione delle miscele deacilate grezze (A) o (B).

La possibilità di formazione di legami stabili GPC/E/S-resina dipende dalla acidità della resina e dal tipo di solvente o miscela di solventi impiegati (molto probabilmente l'influenza del solvente o della miscela di solventi è funzione del valore della costante dielettrica e del pKs, per cui, per poter legare stabilmente GPC/E/S sulla resina, occorre adattare tali parametri al tipo di resina utilizzato, poiche in caso contrario GPC/E/S vengono eluite insieme alle impurezze acide e neutre) . Infatti util izzando esempio resine acide deboli (carbossiliche) ambientate in metanolo e soluzioni metanoliche della miscela deacilata grezza, GPC/E/S vengono eluite insieme al le impurezze acide e neutre

Metanolo: pKs = 16,7 6 = 32,70

Se invece si ambientano le resine carbossiliche in etanolo e si utilizza una soluzione etanol ica del la miscela deacilata grezza GPC/E/S vengono fi ssate stabilmente sulla resina e la purificazione può essere condotta come prima descritto

Etanolo: pKs = 19,1 £ = 24,55

Utilizzando resine acide forti (solfoniche) GPC/E/S vengono invece stabi lmente legate al la resina operando in metanolo, in etanolo e in metanolo o etanolo contenenti percentuali di acqua inferiori al 10% v/v. Non si formano invece legami stabili quando, pur uti l izzando soluzioni metanoliche o etanoliche delle mi scele deacilate grezze, si uti lizzino le resine ambientate in acqua

Acqua: pKs = pKw = 14 £ = 78

La decomposizione che GPC/E/S subiscono in ambiente non acquoso su resine cationiche in forma acida dipende dalla acidità della resina, dal numero e dalla distribuzione dei gruppi acidi della resina e dal tempo in cui GPC/E/S rimangono legate stabilmente alla resina. Utilizzando infatti resine carbossi1iche (debolmente acide) non si osserva decomposizione anche con tempi di permanenza in forma legata estremamente lunghi.

Utilizzando invece resine solfoniche (fortemente acide) si osserva una degradazione variabile secondo il tipo di resina: le resine a struttura tipo gel provocano normalmente una degradazione molto forte (a volte anche totale), mentre le resine a struttura macroreticolare provocano normalmente una degradazione minore. Scegliendo però opportunamente il rapporto equivalenti resina/moli GPC/E/S in funzione del tipo di resina ed utilizzando brevi tempi di permanenza di GPC/E/S in forma legata alla resina in ambiente non acquoso, è possibile rendere praticamente trascurabile la decomposizione e condurre la purificazione come descritto. Non sembra invece esistere un’influenza (almeno facilmente apprezzabile) del solvente o miscela di solventi sulla degradazione.

La stabilità che si osserva utilizzando le resine solfoniche in acqua è probabilmente dovuta al fatto che in tali condizioni GPC/E/S, non sono legate in modo stabile alla resina ma vengono eluite dalla resina stessa (se infatti si utilizza ad esempio una resina solfonica tipo gel in acqua utilizzando tempi di eluizione molto lunghi si osserva degradazione apprezzabile, sebbene non rilevante).

Il meccanismo della degradazione non è stato ovviamente chiarito, ma, quasi certamente, è determinato dalla presenza degli OH liberi della catena glicerica (più ragionevolmente 1<1 >OH sul carbonio in posizione 2, che per analogia con il meccanismo di idrolisi di GPC in soluzione acquosa fortemente acida proposto da BAER e Kates in J. Biol. Chem., 175, 79 (1948) potrebbe dare intermedi ciclici con il fosforo) e dalla presenza di gruppi solfonici acidi liberi. Nelle stesse condizioni non si riscontra infatti degradazione, almeno in quantità apprezzabile, quando i gruppi ossidrilici sono esterificati o protetti come chetali ciclici o quando si opera in modo da minimizzare il numero di gruppi solfonici acidi liberi.

Riassumendo, per poter condurre la purificazione di GPC/E/S su resine cationiche in forma acida e in ambiente non acquoso, occorre utilizzare:

a) resine carbossi1iche, ma con solventi o miscele di solventi con pKs maggiore del valore del metanolo e £ minore del valore del metanolo;

b) resine solfoniche, ma scegliendo opportunamente il tipo di resina e il rapporto equivalenti resina/ /moli GPC GPE GPS per mantenere GPC/E/S legata stabilmente alla resina per tempi ben precisi e molto 1imitati.

Per quanto poi riguarda lo stadio iniziale del procedimento dell'invenzione, si può osservare che il trattamento della miscela deacilata grezza con solfato o fosfato di sodio o potassio porta alla coprecipitazione di GPS Na,, o GPS «2 con solfato o fosfato di sodio o potassio.

La quantità di solfato o fosfato di sodio o potassio che accompagna rispettivamente GPS Na2 o GPS dipende dalle condizioni di precipitazione. Sembra però che per separare pressoché quantitativamente la GPS Na2 o K2 occorra operare in modo da ottenere un rapporto molare GPS Na^ / fosfato o solfato di sodio e GPS K2 / fosfato o solfato di potassio di almeno 1 / 12. Non essendo fissa e ben determinata la quantità di solfato o fosfato di sodio/potassio, la GPS Na2 e GPS K2 così ottenute sono indicate semplicemente come GPS Na2 e GPS l<2.

Claims

RIVENDICAZIONI Procedimento per la separazione dei componenti L-alfa-glicerilfosfori1serina (GPS), L-alfa-gliceri1-fosforilcolina (GPC), e L-alfa-glicerilfosforiletanolammina (GPE) da una miscela di fosfolipidi grezzi che li contiene, c ar at t e r i z z a to dal fatto di comprendere lo stadio di fare reagire detta miscela con almeno un composto scelto tra i seguenti : cloruro, bromuro, acetato di uno dei seguenti metalli : calcio, magnesio, bario, zi nco, ferro; oppure solfato, fosfato, alcolato quale metilato, etilato di sodio o di potassio, con tale reazione formandosi almeno un sale di formul a generai e (GPS) x My ( I ) dove GPS è l 'anione della L-alf a-gl iceri 1 -fosfori 1 -ser i n a M è: Na, K, Ca, Mg, Ba, Zn, Fe x assume, approssimativamente, i valori di : 1 e 3 y assume, approssimativamente, i valori di : 1 ,5; 2; 2,5 e 3. Procedimento secondo la rivendicazione 1 , caratter i zzato dal fatto di comprendere gl i stadi seguenti : a) reazione di una soluzione di detta miscela con un primo di detti composti , costituito da un alcolato di sodio o di potassio, ottenendo un residuo insolubile che viene separato dalla soluzione della mi -scela di reazione, b) trattamento di detta soluzione della miscela di reazione con un acido fino a raggiungere un pH compreso tra 7 e 10.5, ottenendo così un residuo insolubile comprendente (GPSlM^ in cui M=Na, K, che viene separato dalla soluzione la quale comprende GPC e GPE, c) reazione di detto (GPS)M^ in cui M = Na, K, con un secondo di detti composti, scelto tra i seguenti: cloruro, bromuro, acetato di uno dei seguenti metalli: calcio, magnesio, bario, zinco, ferro, così formandosi un sale di detta formula generale (I) (GPS)3My in cui M = Ca, Mg; Ba, Zn, Fe e y ha uno dei valori sopra definiti, detto sale essendo insolubile e venendo separato dalla soluzione di reazione, d) trattamento di detto sale (GPS)3My formato nello stadio c), opportunamente purificato, con una resina acida in ambiente acquoso, in tal modo ottenendosi GPS. ^ΤΓΓ) Procedimento secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che detta soluzione che comprende GPC e GPE provenienti da detto stadio b) viene trattata con una o più resine, così separando GPC da GPE. Procedimento secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che detto acido di detto stadio b) è scelto tra solforico e fosforico. 5J Procedimento secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che detto residuo insolubile comprendente (GPSlM^ in cui M = Na o K formato in detto stadio b) e separato dalla soluzione, viene estratto con solvente idroalcolico e portato a pH compreso tra 5 e 7, così separando (GPS)M^ dalle impurezze, principalmente solfato o fosfato di metallo alcalino 6.)Procedimento secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che detto stadio d) viene condotto facendo passare detto (GP$),M in cui M = Ca, Mg, Ba, Zn, Fe su detta resina, concentrando la soluzione e precipitando con acetone GPS allo stato puro. ^77^ Procedimento secondo la rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che detta soluzione è dapprima fatta passare su una resina cationica in forma acida e in ambiente non acquoso per eliminare le impurezze, quindi si aggiunge acqua ottenendo una soluzione acquosa di GPC GPE pure, e quindi detta soluzione acquosa è fatta passare su resine basiche per la separazione di GPC da GPE. ^57^ Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto di comprendere gli stadi seguenti: a) reazione di una soluzione di detta miscela con un primo di detti composti costituito da un alcolato di sodio o di potassio, ottenendo un residuo insolubile che viene separato dalla soluzione della miscela di reazione, b) trattamento di detta soluzione della miscela di reazione con acido cloridrico o acetico fino a raggiungere un pH compreso tra 6 e 9, c) reazione di detta soluzione avente pH compreso tra 6 e 9 con un secondo di detti composti scelto tra i seguenti: bromuro, cloruro, acetato di uno dei seguenti metalli: Ca, Mg, Ba, Zn, Fe, cosi formandosi un sale di formula generale (I) (GPSj^My in cui M è uno dei metalli appena definiti e y ha il valore sopra specificato, detto sale essendo insolubile e venendo separato dalla soluzione di reazione per ottenere GPS pura. Procedimento secondo la rivendicazione 8, caratterizzato dal fatto che per ottenere GPS pura si purifica detto sale facendolo precipitare da acqua/acido acetico. 101. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto di comprendere gli stadi seguenti: a) reazione di una soluzione di detta miscela con un primo di detti composti costituito da un alcol ato di sodio o di potassio, ottenendo un residuo insolubi le che viene separato dal l a soluzione del la mi scel a di reazi one, b) trattamento del l a soluzione del la mi scel a di reazione secondo a) con una resi na cationica aci da i n ambiente non acquoso, c) trattamento del l a mi scel a di reazi one proveniente da b) con resi ne basiche in ambiente acquoso, così separando GPC dal l a mi scela GPS GPE . /0 Procedimento secondo come sopra descritto, i n particol are negl i esempi .