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Beschreibung zur Patentanmeldung der betreffend Neue Inositphosphatid-Derivate
und Verfahren zur Herstelt dieser Verbindungen Die vorliegende Erfindung-betrifft
neue Pharmakologisch wirksame Derivate der inosithaltigen Phosshatide, insbesondere
der Monophosphoinositide, mit der folgenden Formel:
wobei R1 und R2 gesättigte oder ungesSttigte geradkettige Alkylgruppen mit 5 - 23
C-Atomen, vorwiegend aber Reste natürlich vorkommender Fettsäuren, wie z.B. Palmitin-,
Stearin-, ö1-, Linol-, Linolen- oder Arachidonsäure, bedeuten.
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R3 kann sein H und/oder 1) gesättigte oder ungesättigte geradkettige
oder verzweigte Alkylcarbons.Surereste mit 1 - 23 C-Atomen, die auch durch ein oder
mehrere Halogenatome, wie F, C1, Br oder J sowie durch OH oder O-Alkylgruppen (wie
-OCH3, -OC2H5 usw.) substituiert sein können. Ferner können die Alkylgruppen der
Carbonsäurereste ganz oder teilweise durch einen aromatisehen, hydroaromatischen
oder heterocyclischen ring substituiert sein (z.B. einen Phenylring, Nanhthylring,
Cyclohexan- oder Pyridinring), der seinerseits mit Halogen, Hydroxyl, Alkyl oder
Alkyl substituiert sein kann,
2) gesättigte oder ungesättigte geradkettige
oder verzweigte Dicarbonsäurereste mit 1 - 6 0-Atomen, die einen oder mehrere Substituenten,
wie Halogen, OH, Alkyl, O-Alkyl im Molekül enthalten können,
wobei X1 und X2 H und/oder Alkylgruppen mit 1 - 5 0-Atomen, OH-, CN-Gruppen bzw.
Halogenatome, ferner p-Chlorsubstituierte Phenyläther oder Phenylthioäther sein
können, Y kann folgende Bedeutung haben:
wobei X3: Halogen- und H-Atome, Alkylgruppen von 1-5 0-Atomen, F3C- und OH-Gruppen
sein können, Z = die 0-, S- oder SO2-Gruppe.
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Hierbei sollte wenigstens ein R3 einen der unter 1 - 3 aufgeführten
Reste darstellen.
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Handelsübliche Phosphatide, sogenannte Rohphosphatide, werden entweder
aus pflanzlichen oder tierischen Quellen gewonnen und bestehen in der Regel aus
Gemischen von chemisch unterschiedlichen Phosphatiden. Hauptsächlich handelt es
sich um Phosphatidylcholin, Phosphatidyläthanolamin und Phosphatidylinositid.
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Es sind eine Reihe von Verfahren beschrieben worden, die eine Trennung
dieser Phosphatidgemische ermöglichen. Hierbei bedient man sich vorwiegend chromatographischer
Methoden,um zu reinen und einheitlichen Phosphatiden zu gelangen.
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Dabei ist es immer besonders vorteilhaft, durch eine Behandlung mit
Alkohol eine Vorfraktionierung in alkohollösliche und alkoholunlösliche Phosphatide
zu erreichen. Aufgrund ihrer Schwerlöslichkeit in Alkohol reichern sich die Inositphosphatide
sehr stark in der alkoholunlöslichen Fraktion von entölten Rohphosphatiden an. Vor
allem pflanzliche Rohphosphatide, wie z. B. Sojalecithin,
Erdnußlecithins
Sonnenblumen- oder Rapslecithin, sind reich an einem inosithaltigen Phosphatid,
nämlich dem Monophosphiinositid, das sich in der alkoholunlöslichen Fraktion bis
zu ca. 33 % anreichern läßt. Durch Säulenchromatographie auf Kieselgel als Adsorbens
kann man mit Chloroform-Methanol-Gemischen reines MPI gewinnen. Es wurde nun überraschenderweise
gefunden, daß die Inositgruppierung des Phosphatidylinositids mit den verschiedensten
Carbonsäuren zu den entsprechenden Phosphatid-Derivaten umgesetzt werden kann, ohne
das ansonsten so empfindliche Phosphatidmolekül aufzuspalten oder eine Beeinträchtigung
der ungesättigten Fettsäuren herbeizuführen.
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Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Ester der Inositphosphatide
wird beispielsweise reines MPI aus Sojabohnen- oder eine inositphosphatidangereicherte
MPI-Fraktion in einem aliphatischen, cyclischen oder chlorierten Kohlenwasserstoff
bzw. THF gelöst und in Gegenwart von Alkalicarbonaten oder Pyridin bzw.
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Triäthylamin in an sich bekannter Weise mit einem Säurechlorid bzw.
Säureanhydrid 0 0 bei Temperaturen zwischen 10 und 60 C, vorzugsweise bei Raumtemperatur,
zur Umsetzung gebracht, wobei je nach den molaren Mengen des verwendeten Säurechlorids
bzw. Anhydrids unterschiedliche Veresterungsraten möglich sind. Der Reaktionsverlauf
kann durch Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel-Platten im Laufmittel Chloroform-Methanol-Wasser
(65:25:4) leicht verfolgt werden. Zur Aufarbeitung wird das Reaktionsgemisch zunächst
mit Eiswasser, dann wiederholt mit methaolhaltigem Wasser gewaschen und schließlich
die substanzhaltige organische Phase abgetrennt und im Vakuum unter dem Schutz eines
inerten Gases vom Lösungsmittel befreit. Die Reinigung des 90 erhaltenen Rohproduktes
geschieht zweckmäßigerweise durch fraktionierte Fällung oder Chromatographie auf
Kieselgelsäulend Als Ausgangsmaterial für die Isolierung von reinen Inositphosphatiden
oder stark angereicherten Inositphosphatidhaltigen Fraktionen sind grundsätzlich
alle natürlich vorkommenden Phosphatidgemische geeignet 9 bevorzugt aber solche
pflanzlicher Herkunft, die zweckmäßigerweise frei von Pbosphatidylcolamin und Phosphatidylserin
sein sollten. Diese Forderung wird durch das nachfolgend beschriebene erfindungsgemäße
Verfahren in besonderer Weise erfüllt Inosit-haltige Phosphatidgemische, vorzugoweise
alkoholunlösliche pflanzliche Phoephatidfraktionen, wie sie durch Entölung handelsüblicher
Rohphosphatide und anschlisßonde erschöpfende Extraktion mit Alkohol zurückbleiben,
werden zur weiteren Vorarmung an Lecithin (Phosphatidylcholin) in einem Mixgerät
zunächst mit der 2-lOfachen Menge Alkohol, dann mit derselben Menge Aceton behandelt
und
Inosit-haltige Phosphatidgemische, vorzugsweise alkoholunlösliche
pflanzliche Phosphatidfraktionen, wie sie durch Entölung handelsüblicher Rohphosphatide
und anschließende erschöpfende Extraktion mit Alkohol zurückbleiben, werden zur
weiteren Verarmung an Lecithin (Phosphatidylcholin) in einem Mixgerät zunächst mit
der 2- bis 10-fachen Menge Alkohol, dann mit derselben Menge Aceton behandelt und
jedesmal das Lösungsmittel durch Dekantieren abgetrennt. In dem so vorbehandelten
Phosphatidgemisch wird durch Umsetzung mit Acetanhydrid das Kephalin (Phosphatidylserin)
in N-Acetyl-kephalin überführt, das dann durch wiederholte Behandlung mit Aceton
ausgewaschen wird.
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Die zurückbleibende Phosphatidfraktion besteht in der Regel aus ca.
50 - 60 % Phosphatidylinositid und ist als Ausgangsmaterial für die Synthese der
verfahrensgemäßen pharmakologisch aktiven Inositphosphatid-Derivate ohne weitere
Aufarbeitung gut geeignet.
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Die Reinigung der Umsetzungsprodukte geschieht in an sich bekannter
Weise mit Hilfe von chromatographischen Verfahren oder durch einfache Lösungsmittelfraktionierung
bzw. Umfällung.
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Die verfahrensgemäßen Phosphatidylinositid-Derivate zeigen an der
Maus per os eine akute Toxizität (DL50) von >5000 mg/kg und an der Ratte eine
DLo über 7 Tage von =>5000 mg/kg Körpergewicht. Sie zeichnen sich an verschiedenen
Tiermodellen durch eine gute bis sehr gute antilipämische und antiatherosklotische
Wirkung aus, ferner zeigen sie einen deutlichen Effekt auf die Herabsetzung der
Blutplättchenaggegration und erhöhen die periphere Durchblutung.
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Beispiel 1 MPI-penta-Nikotinat Zu einer konzentrierten Lösung von
368 g Nikotinsäurechlorid in 100 ml dest. Chloroform und 269 g Soda werden 300 g
technisches Inositphosphatid (ca. 70%ig) in 2,5 1 dest. Chloroform unter Eiskühlung
zugetropft.
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Die Umsetzung verläuft in 60 Stunden bei Raumtemperatur. Anschließend
wird das Reaktionsgemisch auf Eis gegossen, wobei sich die Soda auflöst und zur
Neutralisation des überschüssigen Säurechlorids dient.
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Die Chloroformphase wird mehrfach mit Wasser bis zu einem pH-Wert
von 6-7 gewaschen. Nach anschließender Phasentrennung mit Methanol trocknet man
die Chloroformphase mit Calciumchlorid. Nach dem Verdampfen des Chloroforms im-Vakuum
unter Stickstoff wird der Rückstand mehrfach mit Methanol ausgerührt. Nach Konzentrieren
der MPI-Nikotinatenthaltenden Methanollösung auf 800 ml tropft man in 2,5 1 Wasser,
das 40 g Ca-Acetat gelöst enthält, ein. Dabei fällt das Ca-MPI-Nikotinat feinflockig
aus. Nach Absaugen des Niederschlags wird über Phosphorpentoxid getrocknet. Ausbeute:
180 g Ca-MPI-Nikotinat.
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Der Nikotinsäuregehalt wird photometrisch bestimmt: theoretisch: 43
% gefunden: 40 % Calcium: theoretisch: 1,4 % Phosphor: theoretisch: 2,18 % gefunden:
1,6 % gefunden: 2,19 % Rf-Wert: 0,5 auf Kieselgel-Fertigplatten 60 F-254, Laufmittel:
CHCL3/CH30H/H20 80 : 20 : 2 Die -Substanz ist im UV nm sichtbar und zeigt mit Bromthymolblau
eine positive Reaktion.
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Beispiel 2 MPI-penta-Isobutyrat .50 g technisches Inositphosphatid,
gelöst in 800 ml dest. Chloroform, werden zu einer Lösung von 62,5 g Isobutyrylchlorid
in 100 ml Chloroform und 93,9 Natriumcarbonat unter Eiskühlung und gutem Rühren
zugetropft. Das Reaktionsgemisch läßt man solange reagieren, bis dünnschichtchromatographisch
kein Monoinositphosphatid mehr nachweisbar ist. Die Aufarbeitung erfolgt nach Beispiel
1. Ausbeute: 18 g. Schmelzpunkt: 91-95°C, Phosphor: theoretisch: 2,48 %, gefunden:
2,30 %.
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Beispiel 3 MPI-penta-(p-Chlorphenoxy-isobutyrat) 10 g technisches
Inositphosphatid werden in 200 ml Hexan gelöst und zu einer Lösung von 43,2 g p-Chlorphenoxy-isobuttersäurechlorid
und 26,1 ml Triäthylamin in 200 ml Hexan unter Eiskühlung zugetropft.
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Man läßt 20 Stunden bei Raumtemperatur rühren, wonach das Inositphosphatid
vollständig umgesetzt ist. Das Reaktionsgemisch wird auf Eiswasser gegossen und
überschüssiges Triäthylamin als Hydrochlorid mit Salzsäure und Wasser ausgewaschen.
Nach dem Trocknen der Hexanphase mit Natriumsulfat dampft man das Lösungsmittel
im Vakuum ab. Zur weiteren Reinigung des Produktes wird das Calciumsalz wie in Beispiel
1 gefällt.
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Ausbeute 7 g. Schmelzpunkt: 118 - 123 0C.
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Phosphor: theoretisch: 1,66 %, gefunden: 1,75 t.
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Beispiel 4 MPI-penta-Trimethoxybenzoat Zu 180 g Trimethoxybenzoylchlorid,
gelöst in Dichloräthan, tropft man 135 g technisches Monophosphoinositid, gelöst
in 350 ml Dichloräthan und 75 ml Pyridin, unter Eiskühlung zu. Da die Umsetzung
relativ langsam verläuft, ist es zweckmäßig, 4-Dimethylaminopyridin als Katalysator
hinzuzugeben. Man rührt 2 Tage bei Raumtemperatur und erwärmt anschließend ca.
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0 5 h auf 30 C. Das Reaktionsgemisch ist dann laut Dünnschichtchromatographie
umgesetzt,und die Aufarbeitung erfolgt nach Beispiel 3.Ausbeute: 75 g; 0 Schmelzpunkt:
112 - 144 C; Rf-Wert: 0,80 auf Kieselgel-Fertigplatten 60 F-254, Laufmittel: CHCL3/CH30H/H20
80:20:2.
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Beispiel 5 MPI-penta-(o-Acetylsalicylat) 57 g technisches Inositphosphatid,
das gelöst wird in 250 ml dest. Chloroform, tropft man zu einer Mischung aus 64,3
g o-Acetylsalicylsäurechlorid, 68,6 g Soda und als Katalysator 4-Dimethylaminopyridin
in 200 ml dest. Chloroform unter Eiskühlung. Man läßt 18 Stunden rühren und fügt
anschließend weitere 6,5 g Säurechlorid hinzu. Es wird 6 h auf 250C erwärmt und
anschließend analog zu Beispiel 1 aufgearbeitet. Ausbeute: 22 g; Rf-Wert: 0,80 auf
Kieselgel-Fertigplatten 60 F-254, Laufmittel: CHCL3/CH30H/H20 80:20:2.
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Phosphor: theoretisch: 1,83 %, gefunden: 1,90 %.
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Beispiel 6 MPI-penta-Phenylbutyrat 5 g technisches Monophosphoinositid
werden in 80 ml Toluol gelöst und zu einer Mischung, bestehend aus 8,45 g Phenybuttersäurechlorid,
6,75 g Soda und 1 Spatelspitze 4-Dimethylaminopyridin in 50 ml Toluol unter Eiskühlung
zugetropft. Nach 48 h Reaktionsdauer ist die Umsetzung beendet. Die Aufarbeitung
erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben, Ausbeute: 2,5 g; Rf-Wert: 0,75 g auf Kieselgel-Fertigplatten
60-F-254, Laufmittel: CHCL3/CH3OH/H20 80:20:2.
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Beispiel 7 MPI-penta-(4-Methyl-valerianat) 24 g technisches Monophosphoinositid
werden in 350 ml Dichloräthan gelöst und in eine Mischung aus 46,3 g 4-Methylvaleriansäurechlorid
und 42,4 g Soda in 50 ml Dichloräthan unter Eiskühlung getropft. Man läßt 48 h bei
Zimmertemperatur reagieren und arbeitet das Reaktionsgemisch nach Beispiel 1 auf,
da dünnschichtchromatographisch kein MPI mehr zu erkennen ist. Ausbeute: 8 g; Rf-Wert:
0,80 auf Kieselgel-Fertigplatten 60 F-254, Laufmittel: CHCL3/CH30H/H20 80:20:2,
FP.: 88 - 910 C.
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Beispiel 8 MP I-tri-Nikotinat 150 g technischeslnositphosphatid (ca.
70%ig), gelöst in 1 1 dest. Chloroform, werden zu einer konzentrierten Lösung von
120 g Nikotinsäurechlorid in 40 ml dest. Chloroform und 90 g Soda unter Eiskühlung
zugetropft. Das Gemisch wird 30 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, anschließend
gießt man auf Eis. Die Chloroformphase wird mehrmals bis zu einem PH-Wert von 6
- 7 gewaschen. Nach Phasentrennung mit Methanol wird die organische Phase mit Calciumchlorid-
getrocknet. Anschließend verdampft man das Chloroform im Vakuum und rührt den verbleibenden
Rückstand mehrfach mit Methanol aus.
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Die Methanollösung wird auf 350 ml konzentriert und langsam in eine
Lösung, bestehend aus 1,1 1 Wasser und 20 g Ca-Acetat, eingetropft. Dabei fällt
das Ca-tri-Nikotinat feinflockig aus. Der Niederschlag wird abgesaugt und über Phosphorpentoxid
getrocknet. Ausbeute: 50 g Ca-tri-Nikotinat.
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Der Nikotinsäuregehalt wird photometrisch bestimmt; theoretisch: 26,0
%, Phosphor: theoretisch: 2,55 %, gefunden: 24,0 %. gefunden: 2,63 %.
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Rf-Wert: 0,4 auf Kieselgel-Fertigplatten 60 F-254, Laufmittel: CHCL3/CH30H/H20
80 : 20 : 2.
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Die Substanz ist im UV254 sichtbar gnd zeigt mit Bromthylblau eine
positive Reaktion.