DE2520488A1

DE2520488A1 - Verfahren zur gewinnung reiner 3alpha,7alpha-dihydroxy-5beta-cholansaeure

Info

Publication number: DE2520488A1
Application number: DE19752520488
Authority: DE
Inventors: William H Saltzman
Original assignee: Intellectual Property Development Corp Pty Ltd
Current assignee: Intellectual Property Development Corp Pty Ltd
Priority date: 1973-12-19
Filing date: 1975-05-07
Publication date: 1975-11-20
Also published as: GB1489840A; NL7505386A; GB1450939A; GB1489839A; CA1032530A; DE2400004A1; FR2269957A1; JPS5129211A

Description

INTELLECTUAL PROPERTY DEVELOPMENT CORPORATION New Rochelle, New.York, V.St.A. -

" Verfahren zur Gewinnung reiner 3a,7a-Dihydroxy-5ß-cholansäure "

Priorität; 7. Mai 1974, V.St.A., Nr. 467 710

3a,7oc-Dihydroxy-5ß-cholansäure, die auch als Chenodesoxycholsäure bezeichnet wird, wurde entweder aus animalen Quellen isoliert und gereinigt oder "beispielsweise aus■3a,7oc,12a-Trihydroxy-5ß-cholansäure hergestellt. Ein Verfahren zur Herstellung von Chenodesoxycholsäure wurde von L. F. Fieser und S. Rajagopalan, J. Amer. Chem. Soc, Bd. 72 (1950), S. 5530, und Hofmann, Actä Chem. Scand., Bd. 17 (I963), S. 173, "beschrieben.

Die bisher bekannten Verfahren liefern zwar ein Endprodukt annehmbarer Reinheit, doch besteht die Aufgabe, Chenodesoxycholsäure in möglichst reiner Form zur Verfügung zu stellen, da diese Verbindung als Arzneistoff zum Auflösen von Cholesteringallensteinen in der Humanmedizin eingesetzt wird. Zu

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diesem Zweck wird die Verbindung Patienten .oral über einen längeren Zeitraum verabfolgt, bis die Gallensteine aufgelöst sind. Es müssen verhältnismäßig hohe Tagesdosen in der Größenordnung von 750 bis 1000 mg verabfolgt werden. Deshalb ist es erforderlich, die Verbindung in aöglichst reiner Form einzusetzen.

1963 berichtete Hofmann über die Existenz der Chenodesoxycholsäure in Form nadelähnlicher Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 119°C. Er gab an, daß es sich um reine 3a₅7a-Dihydroxy-5ßcholansäure handele. Ferner ist im Merck Index, 8. Auflage, S. 229 beschrieben, daß die reine Verbindung einen Schmelzpunkt von 119 C aufweise. Bis jetzt scheint es sich bei diesen Veröffentlichungen um die einzigen Berichte über die Existenz einer nadelähnlichen Kristallform der 3a,7a-Dihydroxy-5ßcholansäure zu handeln. Bislang war anscheinend niemand fähig, diese Befunde zu produzieren.

Gemäß einem nicht veröffentlichten älteren Vorschlag gelingt es, 3a,7a-Dihydroxy-5ß-cholansäure in Form von nadelähnlichen Kristallen mit einem Schmelzpunkt von 119⁰C herzustellen.

Außerdem wurde gefunden, daß sich diese nadelähnlichen Kri-

man

stalle herstellen lassen, wenn'die von Hofmann angegebene Vorschrift genau einhält und ein verhältnismäßig reines Ausgangsmaterial einsetzt.

Bei der Herstellung der nadelähnlichen Kristallform der 3<X|7a-Dihydroxy-5ß-cholansäure wurde diese Substanz einer

■ sorgfältigen Analyse unterworfen, um die Tatsache zu bestäti- _j

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gen, daß diese Verbindung die reine Form der Verbindung ist, wie dies früher berichtet wurde. Bei der chromatographischen Analyse, das heißt der DünnschichtChromatographie und der GasChromatographie für Gallensäuren,wurde festgestellt, daß die nadelähnliche kristalline Substanz anscheinend im wesentlichen reine 3a,7a-Dihydroxy-5ß~cholansäure ist. Bei weiterer Analyse, beispielsweise der Verbrennungsanalyse, der Säuretitration und des IR-Absorptionsspektrums, wurden Ergebnisse erhalten, die von den Werten erheblich abwichen, die die reine Verbindung haben sollte. Die Verbrennungsanalyse zeigte die Gegenwart von größeren Mengen an Kohlenstoff und Wasserstoff, dan Neutralisationsäquivalent. ergab einen signifikant niedrigeren Säuregehalt und das IR-Absorptionsspektrum wies verschiedene Maxima auf, die auf eine unreine Verbindung hinwiesen. Diese Befunde führten zu der Annahme, daß die nadelälinliche kristalline Form der 3a,7a-Dihydroxy-5ß-cholansäure nicht die reine Form der Verbindung ist, sondern daß sie in Form einer Einschlußverbindung der Gallensäure mit dem zur Umkristallisation verwendeten organischen Lösungsmittel vorliegt. Dies war überraschend, da' man bisher immer der Ansicht war, daß bei den bisher verwendeten Lösungsmittelsystemen, wie einem Gemisch von Äthylacetat mit Hexan oder Heptan, keine Umsetzung mit der Gallensäure erfolgt.

Zum Nachweis, daß sich eine Einschluß verbindung der 3a,7cc-Dihydroxy-5ß-cholansäure mit dem Lösungsmittel bildet, wurden weitere Versuche durchgeführt. Die nadelähnlichen Kristalle wurden durch 96stündiges Erhitzen auf 90 bis 100⁰C im Ölpumpen-

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vakuum bei 2 Torr sorgfältig getrocknet. Eine bestimmte Menge der getrockneten kristallinen Substanz wurde sodann erneut in Äthylacetat gelöst und unter Verwendung von Impfkristallen mit einer bestimmten Menge von C-14 markiertem Hep-.tan zur Kristallisation gebracht. Die erhaltenen Kristalle wurden sodann isoliert und sorgfältig getrocknet. Die getrockneten Kristalle wurden hierauf in einem Scintillationszähler zur Bestimmung der restlichen Radioaktivität analysiert. Es wurde eine verhältnismäßig hohe Radioaktivität festgestellt. Dies kann nur durch die Tatsache erklärt werden, daß die erhaltenen nadelähnlichen Kristalle eine Einschlußverbindung darstellen, in der das Heptan innerhalb des Kristallgitters als clathrat eingeschlossen ist. Ferner wurde festgestellt, daß 4 Mol der Gallensäure etwa 1 Mol Heptan als clathratenthalten.

Es liegt auf der Hand, daß sich die Chenodesoxycholsäure in Form einer Einschlußverbindung nicht als Arzneistoff eignet, selbst wenn die Gallensäure in reiner Form vorliegt. Weitere Untersuchungen ergaben, daß das Kristallisationsverfahren zur Herstellung der nadelähnlichen Kristalle die Reinigung des Endproduktes dadurch unterstützten, daß sie in den Kristallen die Gegenwart unerwünschter Verunreinigungen, wie Lithochol-■ säure," ein bekanntes Hepatotoxin, und Cholsäure, verhinderten. Es wurde ferner festgestellt, daß die Kristallisation in Gegenwart von zwei oder mehr Prozent Verunreinigungen nicht spontan erfolgt. Schließlich wurde festgestellt, daß die Geschwindigkeit der Kristallisation die relative Reinheit des Endproduktes beeinflußt. Je langsamer die Kristalle wachsen, desto reiner ist das erhaltene Produkt. Die Geschwindigkeit des _j

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Kristallwachstums scheint sich durch die Geschwindigkeit des Abkühlens der Kristallisationslösung während des Kristallwachstums steuern zu lassen. Es wurde festgestellt, daß das Kristallwachstum vorzugsweise bei erhöhten Temperaturen, nämlich bei etwa 70 bis 85 C,einsetzen soll. Während des Kristallwachstums wird die Lösung langsam auf Raumtemperatur und sodann weiter auf etwa 4°C abgekühlt, bis das Kristallwachstum beendet ist. Je langsamer die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt wird, desto langsamer wachsen die Kristalle und desto reiner ist das erhaltene kristalline Produkt.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, aus der Einschlußver bindung von 3a,7a-Dihydroxy-5ß-cholansäure und dem zur Umkristallisation verwendeten organischen Lösungsmittel reine 3a,7ct-Dihydroxy-5ß-cholansäure zu gewinnen. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Gewinnung reiner 3a,7a-Dihydroxy-5ß-cholansäure, das dadurch gekennzeich net ist, daß man entweder

(a) eine kristalline Einschlußverbindung von 3a,7a-Dihydroxy-5ß-cholansäure mit einem organischen Lösungsmittel mit ' einer wäßrigen Lösung einer Base auf einen pH-Wert von bis 11 einstellt, die erhaltene Lösung sodann mit einer Mineralsäure auf einen pH-Wert von 1 bis 3 ansäuert und die entstandene Fällung der 3a,7a-Dihydroxy-5ß-cholansäure abtrennt, mit Wasser wäscht und trocknet oder

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(b) daß man 3a,7a-Dihydroxy-5ß-cholansäure in einem Gemisch "aus Äthylacetat und einem Cycloalkan zur Kristallisation bringt und die entstandene Cycloalkan-Einschlußverbindung

• bei erhöhter Temperatur unter stark vermindertem Druck trocknet oder

(c) daß man die kristalline Einschlußverbindung in einem Alkohol löst und die erhaltene Lösung zur Trockene eindampft.

Als Lösungsmittelsystem zur Herstellung der kristallinen Einschlußverbindung wird ein Gemisch von Äthylacetat und Heptan bevorzugt. Andere Lösungsmittelsysteme können jedoch ebenfalls zur Herstellung der kristallinen Einschlußverbindungen verwendet werden. Bei Verwendung von Äthylacetat wird eine dieses Lösungsmittel enthaltende Einschlußverbindung erhalten. Bei Verwendung eines Gemisches von Äthylacetat und Hexan zur Umkristallisation wird eine kristalline Einschlußverbindung erhalten, die Hexan enthält.

In der Verfahrensweise (a) wird als Base beispielsweise eine basische Alkalimetallverbindung, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder wäßrige Ammoniaklösung verwendet. Gewöhnlich wird eine vollständige Auflösung der kristallinen Einschlußverbindung erreicht, wenn die Lösung einen pH-Wert von 9 bis 11, vorzugsweise etwa 10 annimmt. Die erhaltene Lösung wird sodann mit einer Mineralsäure, beispielsweise Schwefelsäure oder Salzsäure, auf einen pH-Wert von 1 bis 3, vorzugsweise etwa 2,0 ■eingestellt. Hierbei fällt die 3a,7a-Dihydroxy-5ß-cholansäure aus, die abfiltriert, gründlich mit Wasser gewaschen und griind-

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lieh getrocknet wird. Es wird die reine, lösungsmittelfreie Verbindung erhalten, die unmittelbar als Arzneistoff in der Humanmedizin eingesetzt werden kann.

Bei der Verfahrensweise (b) wird die 3a,7a-Dihydroxy-5ß-cholansäure in einem Gemisch von Äthylacetat und einem Cycloalkan umkristallisiert. Vorzugsweise wird als Cycloalkan Cyclopentan, Cyclohexan oder Cyeloheptan verwendet. Die entstandenen nadelähnlichen Kristalle stellen eine Einschlußverbindung aus ^«,Ta-Dihydroxy-Sß-cholansäure und dem Cycloalkan dar. Diese E.inschlußverbindung wird sodann getrocknet. Die Abtrennung des eingeschlossenen Cycloalkans erfolgt durch Erhitzen unter stark vermindertem Druck. Vorzugsweise wird das Erhitzen etwa 96 Stunden bei einer Temperatur von 90⁰C und einem Druck von etwa 2 Torr durchgeführt. Es fällt praktisch reine, lösungsmittelfreie 3a,7a~Dihydroxy-5ß~cholansäure an.

Gemäß Verfahrensweise (c) wird die kristalline nadeiförmige Einschlußverbindung in einem Alkohol, vorzugsweise Methanol oder Äthanol, gelöst. Die erhaltene Lösung wird sodann zur Trockene eingedampft. Auch nach diesem Verfahren wird praktisch reine, lösungsmittelfreie 3a,7a--Dihydroxy-5ß-cholansäure erhalten.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

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Beispiel 1

50 ml rohe Galle von Hühnern wird gefriergetrocknet. Das erhaltene grünstichig schwarze" Pulver wird sodann in 100 ml wasserfreiem Methanol gelöst und fast zum Sieden erhitzt. Die heiße Lösung wird filtriert und die grüne Fällung mit 10 ml heißem, wasserfreiem Methanol gewaschen und verworfen. Das Filtrat und die Waschlösung werden vereinigt, mit 2 ml konzentrierter Schwefelsäure versetzt, und das Gemisch wird 15 Ms 18 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Sodann wird die Lösung in einen Scheidetrichter gegeben, der 200 ml Chloroform und 20 ml Wasser enthält. Nach Iminütigem Schütteln und Trennung der Phase wird die untere, dunkelgrüne Chloroformschicht, die sämtliche Pigmente und andere Verunreinigungen enthält, abgetrennt und verworfen. Die obere Schicht ist wasserhell und enthält die Gallensäurefraktion.

Beispiel 2

Die Gallensäurefraktion von Beispiel 1 wird stark eingedampft. Die zurückbleibende wäßrige Lösung, die Konjugate der Gallensäuren mit Peptiden enthält, wird mit lOprozentiger Natronlauge verdünnt. Die entstandene farblose alkalische Lösung wird 3. Stunden

sodann!bei einem Druck von 1 atü verseift. Die verseifte Lösung wird in einem Eisbad abgekühlt und durch tropfenweise Zugabe von 4 η Salzsäure unter Rühren angesäuert. Es wird eine hellgelbe schmierige Fällung erhalten*· Die Fällung wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und*sodann unter Rühren in 80 ml wäßriger Ammoniaklösung gelöst und fast zum Sieden erhitzt. Die erhitzte Lösung wird unter Rühren tropfenweise mit 40 ml einer lOprozen-

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tigen wäßrigen Bariumchloridlösung versetzt. Hierbei bildet sich eine weiße kristalline Fällung. Die Fällung wird abfnitriert, mit Methanol gewaschen und unter vermindertem Druck bei 6O⁰C getrocknet. Es werden 4,9 g rohes Bariumsalz der 3a,7a-Dihydroxy-5ß-cholansäure erhalten. Das rohe Bariumsalz wird in 100 ml Äthylacetat suspendiert und mit 100 ml 3 η Salzsäure versetzt. Das Gemisch wird geschüttelt, bis die Fällung vollständig gelöst ist. Sodann wird die Äthylacetatschicht abgetrennt, die wäßrig-saure Schicht mit 50 ml Äthylacetat extrahiert und der Äthylacetatextrakt mit der Äthylacetatschicht vereinigt. Die Äthylacetatlösung wird mit Wasser neutral gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Die wäßrigen Schichten werden verworfen.

Die getrocknete Äthylacetatlösung wird eingedampft, der Rückstand in 100 ml Methanol gelöst und tropfenweise und unter Rühren mit 10 ml einer lOprozentigen wäßrigen Bariumchloridlösung und sodann mit 1 ml einer konzentrierten wäßrigen Ammoniaklösung versetzt. Die erhaltene Lösung wird zum Sieden erhitzt, sodann auf Raumtemperatur abkühlen gelassen und filtriert.

Das Filtrat wird mit weiterer wäßriger Bariumchloridlösung versetzt, um die Vollständigkeit der Ausfällung zu überprüfen.

entstandene

Eine gegebenenfalls /Ausfällung wird auf die vorstehend geschilderte Weise- aufgearbeitet. Es wird eine weitere Ausfällung erhalten, die sodann mit der ursprünglichen Ausfällung vereinigt, mit Methanol gewaschen und unter vermindertem Druck

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bei 6O⁰C getrocknet wird. Es werden 4,1 g rohes Bariumsalz der" 3a, 7a-Dihydroxy-5ß-cholansäure erhalten.

Das rohe Bariumsalz wird mit 100 ml 3 η Salzsäure und 100 ml Äthylacetat geschüttelt, "bis alles in Lösung gegangen ist. Nach der Phasentrennung wird die Äthylacetatphase abgelassen und die wäßrig- saure Phase mit Äthylacetat extrahiert. Der Äthylacetatextrakt und die Äthylacetatphase werden vereinigt, mit ¥asser neutral gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Die wäßrigen Schichten werden verworfen.

Die erhaltene Äthylacetatlösung von 3a,7a-Dihydroxy-5ß~cholansäure wird im Luftstrom bei 50⁰C auf ein Volumen von 40 ml eingedampft. Die eingedampfte Lösung wird sodann auf 4°C abgekühlt und bei 4 C mit η-Hexan versetzt, bis die Lösung etwas trübe wird. Sodann wird die Lösung 15 bis 18 Stunden bei 4⁰C stehengelassen. Hierbei kristallisiert reine 3a,7a-Dihydroxy-5ß-cholansäure an der Wand des Gefäßes aus. Die Kristalle werden abfiltriert, mit η-Hexan gewaschen und unter vermindertem Druck bei 6O⁰C getrocknet. Ausbeute 3₅2 g reine 3a,7a-Dihydroxy-5ß-cholansäure vom F. 140 bis 142⁰C. Die gaschromatographische Analyse ergibt eine Reinheit von 99,0 %.

Beispiel 3

20 g des gemäß Beispiel 2 erhaltenen Endprodukts werden unter Rühren in 500 ml auf 75 bis 85⁰C erhitztem Äthylacetat gelöst. Die erhaltene Lösung wird noch heiß filtriert und das Filtrat unter Rühren auf 60⁰C abgekühlt. Sodann wird die Lösung

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unter Rühren mit 300 ml n-Heptan versetzt. Die Lösung wird langsam auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Innerhalb einiger Minuten bilden sich Rosetten von nadelähnlichen Kristallen. Die erhaltenen Kristalle werden 4 Stunden bei Raumtemperatur wachsen gelassen. Sodann wird 15 bis 18 Stunden auf etwa 4°C abgekühlt, bis das Kristallwachstum beendet ist. Die erhaltenen Kristalle werden abfiltriert und 96 Stunden bei 85°C und einem Druck von 2 Torr getrocknet. Die Kristalle schmelzen bei

Beispiel 4

20 g des gemäß Beispiel 2 erhaltenen Endnrodukts werden nach .

S. 173, Hofmann, Acta Chem. Scand, Bd. 17 (1963),/ behandelt. Es v/erden nadelähnliche Kristalle der 3a,7a-Dihydroxy-5ß-cholansäure vom F. 119°C erhalten.

Beispiel 5

20 g dee gemäß Beispiel 2 erhaltenen Endprodukts v/erden unter Rühren in 500 ml auf 75 bis 85°C erhitztem Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird noch heiß zweimal filtriert und das Filtrat unter Rühren bei 85°C gehalten. Das Äthylacetat wird verdampfen gelassen. Nach dem Verdampfen eines Teils des Äthylacetats bilden sich Rosetten von nadelähnlichen Kristallen. Die erhaltene, kristallhaltige Lösung wird sodann auf Raumtemperatur abkühlen gelassen und im Kühlschrank stehengelassen, bis das Kristallwachstum vollständig ist. Die Kristalle werden abfiltriert und getrocknet. Es wird ein kristallines Produkt vom F. 117 bis 119°C erhalten.

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Beispiel 6

Die in den Beispielen 3, 4 und 5 erhaltenen Produkte werden der gaschromatographischen Analyse unterworfen. Aus der Analyse ergibt sich, daß die kristallinen Produkte Einschlußverbindungen von 3a,7a-Dihydroxy-5ß~cholansäure mit Heptan, Heptan bzw. Äthylacetat sind. Die eingeschlossenen Lösungsmittel liegen in einer Menge von mehr als 5 % vor.

Beispiel 7

5 g des in Beispiel 4 erhaltenen kristallinen Produkts werden in 125 ml warmem Methanol unter Rühren gelöst. Das Gemisch wird weitere 30 Minuten gerührt. Sodann wird die Temperatur erhöht, um das Methanol zu verdampfen. Die Lösung wird zur Trockene eingedampft. Es hinterbleibt lösungsmittelfreies 3cc, 7a-Dihydroxy-5ß-cho!ansäure vom F. 143 bis 145°C als v/eißes Pulver, Dies ergab sich bei der dünnschichtchromatographisehen und gaschromatο graphi sehen Analys e.

Beispiel 8

20 g des gemäß Beispiel 4 erhaltenen Produkts werden mit 25pro~ zentiger wäßriger Ammoniaklösung versetzt, bis alles in Lösung gegangen ist und der pH-Wert 10,0 erreicht hat. Die erhaltene Lösung wird sodann abgekühlt, filtriert und bei 25⁰C mit 2 η Salzsäure auf einen pH-Wert von 2,0 eingestellt. Die entstandene Fällung wird abfiltriert, dreimal mit 500 ml Wasser gewaschen und 15 bis 18 Stunden bei 85⁰C und bei ζ Torr getrocknet.

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Das getrocknete Produkt hat einen anfänglichen Schmelzpunkt von 108 bis 115°C. Bei dieser Temperatur wandelt sich das Produkt in eine glasähnliche Modifikation um, die bei 140 bis 145°C schmilzt. Eine Probe des getrockneten Materials wird in heißem Äthylacetat gelöst. Die erhaltene Lösung ist etwas trübe. Dies zeigt die Gegenwart von unerwünschten Verunreinigungen an, die offensichtlich durch das Waschen mit Wasser nicht vollständig abgetrennt wurden. Das getrocknete Material wird sodann nochmals kräftig und gründlich mit Wasser gewaschen. Nach 24-stündigem Trocknen bei 85°C im Ölpumpenvakuum schmilzt die Verbindung bei 142 bis 145°C

Die dünnschichtchromatographische und gas.chromatographische Analyse zeigen, daß das Produkt reine, lösungsmittelfreie 3a,7a-Dihydroxy-5ß-cholansäure ist.

Beispiel 9

20 g des Endprodukts von Beispiel 5 werden in 500 ml Äthylacetat gelöst und 30 Minuten auf 70⁰C erhitzt und gerührt. Die Lösung wird sodann mit 300 ml Cyclohexan versetzt und auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Innerhalb weniger Minuten bilden sich Rosetten nadelähnlicher Kristalle. Das Gemisch wird abkühlen gelassen, bis das Kristallwachstum vollständig ist. Sodann werden die Kristalle abfiltriert und an der Luft getrocknet. Die an der Luft getrockneten Kristalle werden der dünnschichtchromatographischen und gaschromatographischen Analyse unterworfen. Diese Analysen zeigen die Gegenwart von Cyclohexan als Einschlußverbindung an. Die kristalline Ein-

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Schlußverbindung wird 15 bis 18 Stunden bei 85 C und bei einem Druck von 2 Torr getrocknet. Das erhaltene getrocknete Produkt wird hierauf der.dünnschichtchromatographischen und gaschromatographischen Analyse unterworfen. Das Produkt ist lösungsmittelfreie, reine 3a,7a-Dihydroxy-5ß-cholansäure vom F. 142- bis 145⁰C.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch mit kristallinen, nadelähnlichen Einschlußverbindungen der 3a,7a-Dihydroxy-5ßcholansäure durchgeführt werden, die nach dem von Hofmann, Acta Chern. Scand., Bd. 17 (1973), S. 173, beschriebenen Verfahren hergestellt wurde.

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Claims

Patentansprüche

1. / Verfahren zur Gewinnung reiner 3a,7a-Dihydroxy-5ß-cholansäure, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) entweder eine kristalline Einschlußverbindung'von 3*,7<K-Dihydroxy-5ß-cholansäure mit einem organischen Lösungsmittel mit einer wäßrigen Lösung einer Base auf einen pH-Wert von 9 Ms 11 einstellt, die erhaltene Lösung sodann mit einer Mineralsäure auf einen pH-Wert von 1 bis 3 ansäuert und die entstandene Fällung der 3a,7a-Dihydroxy-5ß-cholansäure abtrennt, mit Wasser wäscht und trocknet oder

(b) daß man 3a,7a-Dihydroxy~5ß~cholansäure in einem Gemisch aus Äthylacetat und einem Cycloalkan zur Kristallisation bringt und die entstandene Cycloalkan-EinschlußverMndung bei erhöhter Temperatur unter stark vermindertem Druck trocknet oder

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als kristalline Einschlußverbindung nadelähnliche Kristalle mit einem anfänglichen Schmelzpunkt von etwa 119°C einsetzt.

3· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als kristalline Einschlußverbindung eine Einschlußverbindung mit Äthylacetat, Hexan, Heptan, Cyclopentan, Cyclohexan oder Cycloheptan einsetzt.

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4. Verfahren nach Anspruch 1 (a), dadurch gekennzeichnet, daß man die kristalline Einschlußverbindung mit einer wäßrigen Lösung der Base auf einen pH-Wert von etwa 10 einstellt und die erhaltene Lösung sodann mit einer Mineralsäure auf einen pH-Wert von etwa 2,0 ansäuert.

5. Verfahren nach Anspruch 1(b), dadurch gekennzeichnet, daß man die entstandene Cycloalkan-Einschlußverbindung etwa

96 Stunden auf 9O⁰C und einem Druck von 2 Torr erhitzt.

6. Verfahren nach Anspruch 1 (c), dadurch gekennzeichnet, daß man die kristalline Einschlußverbindung in Methanol oder Äthanol löst und die erhaltene Lösung zur Trockene eindampft.

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