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II Verfahren zur Gewinnung von reinen Gallensäuren " Die Erfindung
betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von reinen Gallensäuren, insbesondere von 3α,7α-Dihydroxy-5ß-cholansäure,
aus der Galle von Warm- oder Kaltblütlern.
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Gallensäuren sind natürlich vorkommende Steroide, die in der Leber
synthetisiert werden. Die am häufigsten vorkommenden Gallensäuren haben die folgende
Formel
In Stellung 3, 7 und/oder 12 findet man gegebenenfalls noch Hydroxylgruppen.
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Die Gallensäuren sind der wesentliche Bestandteil der Galle und
werden
je nach Tierart in verschiedener Anzahl und Menge synthetisiert. Die in der tierischen
Galle am häufigsten vorkommenden Gallensäuren sind -3«,7G-Dihydroxy-5ß-cholansäure,
3«,7A,12Z-Trihydroxy-5ß-cholansäure und 30(,120(-Dihydroxy-50-cholansäure.
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Da die Galle diese Gallensäuren und noch andere Verbindungen, z.B.
Pigmente, Lipide und Proteine, enthält, war es bisher sehr schwierig und unwirtschaftlich,
eine spezielle Gallensäure aus der Galle zu isolieren. Die Gallensäuren mussten
daher, obwohl sie natürlich in grosser Menge vorkommen, synthetisch aus verschiedenen
Vorstufen hergestellt werden. Ausserdem war es bisher schwierig, die Gallensäuren
in genügender Reinheit, z.B.
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für die medizinische Therapie, herzustellen.
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Es wurde nun festgestellt, dass man Gallensäuren, insbesondere 3E,7X-Dihydroxy-5B-cholansäure,
in reiner Form aus der Galle von Warm- oder Kaltblütlern direkt leicht und wirtschaftlich
gewinnen kann. Die Reinheit der derart gewonnenen Gallensäuren beträgt über 99,0
Prozent.
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Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Gewinnung von
reinen Gallensäuren aus der Galle von Warm- oder Kaltblüt-.
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lern, das dadurch.gekennzeichnet ist, dass man die Gallen-Rohsubstanz
oder ein daraus durch milde alkalische Hydrolyse bzw. durch Verestern gewonnenes
Produkt in einem mindestens zweiphasigen Lösungsmittelsystem behandelt, in dessen
einer Phase die Gallensäuren bzw. deren Derivate löslich und die Pigmente sowie
andere Verunreinigungen bzw. deren Derivate
unlöslich sind, während
in der (den) anderen Phase(n) die Gallensäuren bzw. deren Derivate unlöslich und
die Pigmente sowie anderen Verunreinigungen bzw. deren Derivate löslich sind, dass
man die Phasen voneinander trennt und die Gallensäuren bzw.
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deren Derivate aus der sie enthaltenden Phase isoliert und gegebenenfalls
weiteren Reinigungsmassnahmen unterwirft.
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In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens
lyophilisiert man zuerst die Gallen-Rohsubstanz, löst das Lyophilisat in einem Lösungsmittel
und. filtriert den sich bildenden Niederschlag ab.
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In. einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen
Verfahrens verestert man. die. Gallen-Rohsubstanz oder ein daraus gewonnenes Lyophilisat
ganz oder teilweise, führt im Fall der Vollveresterung eine selektive Hydrolyse
durch und behandelt dann die Estermischung mit einem mindestens zweiphasigen Lösungsmittel.
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Man kann den die Gallensäuren bzw. deren Derivate enthaltenden Extrakt
gegebenenfalls ansäuern und dann mit.Salzbildnern, insbesondere Verbindungen von
Metallen der Gruppe IIa des-Periodensystems der Elemente, behandeln und anschliessend
die gebildeten Gallensäuresalze mit einem organischen Lösungsmittel behandeln,.
welches ein unterschiedliches Lösungsvermögen für die Salze der verschiedenen Gallensäuren
aufweist.
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Man kann aber auch den die Gallensäuren bzw. deren Derivate enthaltenden
Extrakt gegebenenfalls ansäuern und dann säulenchromatographisch
auftrennen
und die einzelnen Eluate zwecks Gewinnung der freien Säuren weiter aufarbeiten.
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Als Gallen-Rohsubstanz für die erfindungsgemässe Gewinnung von reinen
Gallensäuren ist die Galle von Vögeln, wie Hühnern, Truthähnen, Gänsen, Fasanen,
Eulen, Tauben und Enten, von Säugetieren, wie Rindern, Ratten, Meerschweinchen,
Bären und Schweinen, und Fischen, wie Dorsch, Seebarbe, Sardinen und Rotbarsch,
geeignet. Im erfindungsgemässen Verfahren bevorzugt wird die Galle von Hühnern,
Truthähnen, Gänsen, Fasanen, Tauben und Enten, da sie als Hauptbestandteil die gewünscn-e
3K,7y-Dihydroxy-5ß-cholansäure enthält.
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Die Galle wird den Tieren in an sich bekannter Weise und unter den
üblichen Vorsichtsmassnahmen entnommen.
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Das erfindungsgemässe Verfahren besteht im wesentlichen aus zwei Stufen.
Die erste Stufe ist die Abtrennung von Pigmenten und anderen Verunreinigungen, die
zweite die Reinigung und Gewinnung.der erwünschten Gallensäure.
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In Vorversuchen wurde festgestellt, dass man die Pigmente und anderen
Verunreinigungen von der Gallen-Rohsubstanz durch direkte Extraktion mit einem Lösungsmittel,
in dem die Gallensäure löslich, die Verunreinigungen und die Pigmente jedoch unlöslich
sind, abtrennen kann. Als Lösungsmittel geeignet is-t ein Alkohol, wie Methanol
oder Äthanol, ein Keton, wie Aceton, oder eine Säure, wie Essigsäure. Man kann dann
die als Niederschlag ausfallenden Verunreinigungen einfach abfiltrieren.
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Durch- dieses Verfahren erhielt man zwar befriedigende Ergebnisse,
es wurden jedoch nicht alle Verunreinigungen abgetrennt, so dass weitere Reinigungsschritte
notwendig waren.
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Man kann zur Abtrennung. der unerwünschten Verunreinigungen die Gallen-Rohsubstanz
auch zuerst einer milden alkalischen Hydrolyse, z.B. mit Natrium- oder-Kaliumhydroxid,
unterwerfen.
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Das hydrolysierte Material wird dann neutralisiert und mit einem geeigneten
zweiphasigen Lösungsmittelsystem, z.B. Chlor form und Methanol, in dessen einer
Phase die Gallensäuren löslich und die Verunreinigungen unlöslich sind, während
in der anderen Phase die Gallensäuren unlöslich und die Verunreinigungen löslich
sind, extrahiert. Die die. Gallensäuren enthaltende Phase wird dann abgetrennt und
weiterverarbeitet.
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Auch in diesem Verfahren können nicht alle Merunreinigungen abgetrennt.
werden,. so dass weitere Reinigungsschritte notwendig sind.
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Im erfindungsgemässen Verfahren kann. man die Gallen-. Rohsubstanz
zuerst einer milden alkalischen Hydrolyse, z.B. mit Natrium-oder Kaliumhydroxid,
unterwerfen, die entstehende Lösung neutralisieren und dann entwässern, z.B. durch
Sprühtrocknen, Lyophilisation, Thermotrocknung, Trocknung durch eine Membran oder
Gefriertrocknung. Obwohl die Hydrolyse zur Abtrennung einiger Verunreinigungen geeignet
ist, kann sie bei der Gewinnung von Gallensäuren aus der Galle von Hühnern oder
Truthähnen unterbleiben. Die Qualität und die Eigenschaften des Endprodukts werden
dadurch nicht beeinträchtigt.
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In der bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens
wird daher die Gallen-Rohsubstanz zunächst in an sich bekannter Weise lyophilisiert.
Bevorzugt ist die Gefriertrocknung oder die Lyophilisation, doch erhält man mit
anderen bekannten Verfahren ebenfalls zufriedenstellende Ergebnisse.
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Das aus der Gallen-Rohsubstanz gewonnene Lyophilisat wird dann verestert.
Je nach Tierart, aus der die Galle stammt, kann man verschiedene Vçresterungsmittel
verwenden. Bevorzugt sind aliphatische Alkohole, die gesättigt oder. ungesättigt
und/oder gegebenenfalls substituiert sein können, und aromatische Alkohole.
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Als aliphatische Alkohole bevorzugt sind Methanol, Propanol oder Butanol,
Äthenol oder Propenol, Cyclohexanol oder Cyclooctanol. Als aromatische Alkohole
bevorzugt sind Phenol, enzylalkohol oder Cinnamylalkohol. Als Substituenten für
die als Veresterungsmittel verwendeten Alkohole geeignet sind Halogenatome, z.B.
Chlor oder Brom, Schwefel- oder Sauerstoffatome.
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Besonders bevorzugt sind Alkanole, z.B.. -Methanol in einem sauren
Medium, z.B. Schwefelsäure. Im erfindungsgemässen Verfahren kann man aber auch Diazomethan
verwenden.
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Bei der Veresterung der Gallen-Rohsubstanz bzw. des daraus gez .B.
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wonnenen Lyophilisats erhält man/auch die Alkylester der Verunreinigungen.
Das durch Veresterung gewonnene Produkt wird nun mit dem mindestens zweiphasigen
Lösungsmittelsystem behandelt, in dessen einer Phase die Gallensäuren bzw. deren
Derivate löslich und die Pigmente sowie die anderen Verunreinigungen bzw.
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deren Derivate unlöslich sind, während in der (den) anderen Phase(n)
die Gallensäuren bzw. deren Derivate unlöslich und die
Pigmente
sowie die anderen Verunreinigungen bzw. deren Derivate löslich sind. Als Lösungsmittel
für das zweiphasige System geeignet sind halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform,
Methylenchlorid oder Methylendichlorid, aromatische organische Lösungsmittel, wie
Benzol oder Toluol, Alkohole, wie Methanol und Äthanol, Alkane, wie Hexan oder Heptan,
Ketone, wie Aceton, Benzophenon oder Cyclohexanon, Äther, wie Methyl- oder Äthyl
äther, Carbonsäuren, wie Essigsäure. Besonders geeignete Systeme sind Chloroform/Methanol,
Chloroform/Äthanol, Methylenchlorid/ Methanol, Toluol/Methanol, Benzol/Methanol,
Benzol/Hexan, Toluol/Hexan, Methyläther/Methanol und Chloroform/Aceton.
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Als Lösungsmittel, in dem die Pigmente sowie die anderen Verunreinigungen
bzw. deren Derivate löslich sind, wird ein halogenierter KohlenWasserstoff bevorzugt.
Im erfindungsgemässen Verfahren wird daher ein Lösungsmittelsystem, das aus einem
halogenierten Kohlenwasserstoff, wie Chloroform, und einem Alkohol, wie Methanol,
besteht, bevorzugt.
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Es wurde festgestellt, dass die Weiterverarbeitung der lyophilisierten
Gallen-Rohsubstanz unter wasserfreien Bedingungen die besten Ergebnisse liefert.
Es scheint, dass die Anwesenheit von Wasser entweder in der Gallen-Rohsubstanz oder
in den bereits gewonnenen Produkten die Qualität der Endprodukte beeinträchtigt.
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Im -erfindungsgemässen Verfahren wird die Gallen-Rohsubstanz oder
das daraus durch milde alkalische Hydrolyse bzw. durch Verestern gewonnene Produkt
mit dem Lösungsmittel innig vermischt
und gegebenenfalls mit einem
Phasen-Trennungsmittel versetzt.
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Als Phasen-Trennungsmittel geeignet sind verdünnte Mineralsäuren,
z.B. Salz- oder Schwefelsäure oder Wasser. Auf diese Weise erhält man alle Pigmente
und Verunreinigungen in einer einzigen Phase, die verworfen wird, und die von Verunreinigungen
freien Gallensäuren in der anderen Phase. Die die Pigmente und Verunreinigungen
enthaltende Phase ist von dunkelgrüner oder grünschwarzer Farbe, während die die
Gallensäure enthaltende Phase farblos ist und keine nachweisbaren Verunreinigungen
enthält.
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Im allgemeinen liegen die Gallensäuren in der Natur in Form eines
Konjugats von einem Peptid bzw. Aminosäuren vor, hauptsächlich gebunden an Glycin
und Taurin. Im Fall von Gallensäuren-Glycin-Konjugaten ist eine leichte Abänderung
des erfindungsgemässen Verfahrens von Vorteil. Die Gallen-Rohsubstanz wird wie oben
lyophilisiert und dann ganz verestert, so dass die Pigmente, die Verunreinigungen
und die Gallensäuren als Ester vorliegen. Diese veresterten Produkte werden dann
einer selektiven Hydrolyse unterworfen, bei der nur die veresterten Gallensäuren
hydrolysiert werden. Diese selektive Hydrolyse kann bei einem stark sauren pH-Vert,
z.B. bei etwa 1 bis 3, oder bei sehr alkalischem pH-Wert, z.B. bei etwa 9 bis 12,
durchgeführt werden. Das Reaktionsgemisch wird dann wie oben mit dem mindestens
zweiphasigen Lösungsmittelsystem behandelt.
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Die die Gallensäuren enthaltende Lösung wird gegebenenfalls neutralisiert,
das Lösungsmittel wird abgedampft, dabei erhält man ein Rohgemisch der freien Gallensäuren,
das weiter gereinigt werden kann.
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Zur Reinigung der im erfindungsgemässen Verfahren isolierten Roh-Gallensäuren
kann man das Rohgemisch der Gallensäuren zur Abspaltung der Aminosäure-Konjugate
hydrolysieren, z.B. durch.
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Behandeln des Gemisches mit einer Alkalimetallbase, wie Kalium-oder
Natriumhydroxid. Das hydrolysierte Gemisch wird dann angesäuert, z.B. mit einer
Mineralsäure, wie Salzsäure oder Schwefelsäure, und in ein organisches Lösungsmittel,
wie Äthylacetat, Athyläther, Isopropyläther oder Diisopropyläther, extrahiert. Der
Extrakt wird dann zur Trockene eingedampft, man erhält eine Rqh-Trockensubstanz.
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Diese Roh-Trockensubstanz kann dann verestert werden, vorzugsweise
durch Behandeln mit einem gesättigten oder ungesättigten und gegebenenfalls substituierten
aliphatischen Alkohol, wie einem Alkanol, z.B. Methanol, Propanol oder Butanol,
einem Alkenol, z.B. Propenol, einem Cycloalkanol, z.B. Cyclohexanol,-oder einem
aromatischen Alkohol, z.B. Phenol, Benzylalkohol oder Cinnamylalkohol. Als Substituenten
für diese Alkohole geeignet sind Halogenatome, z.B. Chlor oder Brom, oder Schwefelatome.
Zur Veresterung der Roh-Trockensubstanz kann aber auch Diazomethan verwendet werden.
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Vorzugsweise wird jedoch die Roh-Trockensubstanz mit Methanol in einem
sauren Medium, z.B. in Schwefelsäure, oder mit Diazomethan in Äther, verestert.
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Das erste Gemisch der Gallensäuren wird dann einer Säulenextraktion
unterworfen, bei der die einzelnen Gallensäureester aufgetrennt werden. So erhält
man in einer.Aluminiumoxidsäule
mit Äthylacetat-Benzol als Eluiermittel
zuerst den Roh-Alkylester von 3E,7i-Dihydroxy-5ß-cholansäure. Stammt die Galle aus
Hühnern oder Truthähnen, so erhält man bei der weiteren Elution z.B. mit Methanol/Äthylacetat
diesen Alkylester zusammen mit dem Alkylester der ,7,12o(-Dihydroxy-ß-cholansäure.
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Dieses zweite Eluat kann dann nochmals einer Säulenextraktion unterworfen
werden, wobei man dann mit Äthylacetat/Benzol den 3α,7α-Dihydroxy-5ß-cholansäure-alkylester
abtrennen kann.
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Die die Alkylester der Gallensäuren enthaltenden Eluate werden dann
hydrolysiert, z.B. mit Kalium- oder Natriumhydroxid.
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Das Hydrolysat wird angesäuert, in ein geeignetes.Lösungsmittel extrahiert,
filtriert und zur Trockene eingedampft.
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Dieser Rückstand wird mit einem geeigneten Lösungsmittel, wie Äthylacetat,
bei erhöhter Temperatur behandelt. Beim Abkühlen dieser Lösung erhält man reine
kristalline Gallensäure, z.B.
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3m,7<-Dihydroxy-5ß-cholansäure, die durch Filtrieren gewonnen werden
kann.
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Das Rohgemisch der Gallensäuren kann aber auch noch auf andere Weise
gereinigt werden. Nach der Hydrolyse1 der Abtrennung der Aminosäure-Konjugate und
dem Ansäuern wird die Lösung der Roh-Säuren mit Salzbildnern, insbesondere mit Verbindungen
von Metallen der Gruppe IIa des Periodensystems der Elemente behandelt. Als Salzbildner
geeignet sind Barium-, Strontium- und Calciumchloride, -acetate oder sitrate. Die
die Gallensäuren enthaltende Lösung wird zuerst in wässriger Lösung mit dem Salzbildner,
z.B. mit Bariumchlorid, dann in einem geeigneten
Lösungsmittel,
in dem das eine der entstehenden Gallensäuresalze löslich, das andere Salz nicht
löslich ist, behandelt.
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Bei. Gallensäuren, die aus. der Galle von Hühnern oder Truthähnen
stammen, wird das Gallensäuren-Bariumsalz mit einem organischen Lösungsmittel, wie
einem Alkohol, z.B. Methanol, behandelt.
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Auf diese Weise wird das. erwünschte Gallensäuresalz abgetrennt.
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Es wird anschliessend mit einer Säure, z.B. mit Salzsäure, dissoziiert.
Dabei erhält man die freie Gallensäure in reiner Form.
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Diese reine freie Gallensäure kann gegebenenfalls noch weiter gereinigt,
.z.B. durch Umkristallisieren aus iTim geeigneten Lösungsmittel, und getrocknet
werden.
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Als organisches Lösungsmittel, das ein unterschiedliches Lösungsvermögen
für die Salze der verschiedenen Gallensäuren aufweist, sind auch Äthylacetat, Hexan
und Essigsäure geeignet.
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Stammen die Gallensäuren aus der Galle von Hühnern, -so kann man die
zugleich mit der 3A,7«-Dihydroxy-5ß-cholansäure gewonnene, jedoch nicht abgetrennte
und gereinigte 3,73(,12s(-Trihydroxy-5ß-cholansäure in an sich bekannter Weise.
weiter reinigen.
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Nach der Hydrolyse wird die 3«,7q -Trihydroxy-5ß-cholansäure gemäss
Fieser u.Mitarb., in J. Amer. Chem. Soc. 72 (1950) Seite 5530, weiter behandelt.
Man erhält dabei noch zusätzliche Mengen an der gewünschten 3α,7α-Dihydroxy-5ß-cholansäure.
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Die Reinheit der im erfindungsgemässen Verfahren gewonnenen Gallensäuren,
insbesondere 34,70(-Dihydroxy-50-cholansäure, wurde durch Dünnschichtchromatographie,
Gas-Flüssig-Chromatographie und Schmelzpunkt bestimmt. Sie beträgt über. 99 Prozent.
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Der Schmelzpunkt scheint höher zu sein als in der Literatur angegeben,
was darauf hindeutet, dass das im erfindungsgemässen Verfahren gewonnene Produkt
ausserordentlich rein ist.
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Die Beispiele erläutern die Erfindung.
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Beispiel 1 10 ml Hühner-Galle werden mit 200 ml heissem Methanol
gerührt.
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Der beim Abkühlen der Lösung ausfallende Niederschlag wird abfiltriert,
die a1kohülishe Lösung wird unter vermindertem Druck bei 600C zur Trockene eingedampft.
Der Rückstand wird in 25 ml 10 prozentiger Natronlauge gelöst und in einem verschlossenen
Reaktionsgefäss 3 Stunden bei 0,984 kp/cm2 Überdruck hydrolysiert. Die Lösung wird
dann in einem Eisbad abgekühlt, mit 4n Salzsäure auf pH 1,0 angesäuert und viermal
mit je 50 ml Äthylacetat extrahiert. Die organischen Phasen werden mit Wasser fast
neutral gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und zur Trockene eingedampft.
Der Rückstand wird in -25 ml wasserfreiem Methanol, das 2 Prozent konzentrierte
Schwefelsäure enthält, gelöst, die Lösung wird über Nacht stehengelassen, dann mit
einem entsprechenden Volumen Wasser versetzt.
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Die entstandene Lösung wird dreimal mit je 50 ml Diäthyläther Benzol
im Verhältnis 2 : 1 extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit 5
ml Wasser, dann mit 5 ml gesättigter Natriumbicarbonatlösung und anschliessend noch
dreimal mit 5 ml Wasser gewaschen. Die Lösung wird über Natriumsulfat getrocknet,
filtriert und zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in 50 ml Äthylacetat/Benzol
im Verhältnis 1 : 9 gelöst und auf
eine Säule mit 200 g Aluminiumoxid,
Aktivitätsstufe III, aufgegeben. Die Säule wird zuerst mit 400 ml Äthylacetat/Benzol
im Verhältnis 3 : 7 gewaschen, um gefärbte Verunreinigungen zu entfernen. Dann wird
der Methylester der D«,7z-Dihydroxy-5ß-cholansäure mit 800 ml Äthylaoetat/Benzol
im Verhältnis 4 : 6 aus der Kolonne eluiert. Das Lösungsmittel dieses Eluats wird
bei 600C abgedampft. Der Rückstand wird in 50 ml einer 5 prozentigen methanolischen
Kaliumhydroxidlösung gelöst und eine Stunde auf 600C erwärmt. Die Lösung wird in
einem Eisbad abgekühlt und mit 4n Salzsäure auf pH 10 angesäuert. Die saure Lösung
wird dann mit 100 ml Wasser verdünnt und viermal mit je 75 ml Äthyläther extrahiert.
Die Ätherphase wird mit Wasser gewaschen, bis der pH-Wert 5,0 beträgt, über Natriumsulfat
getrocknet, filtriert und zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in 30 ml
heissem Äthylacetat gelöst und bei Raumtemperatur stehengelassen.
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Beim Abkühlen fällt ein Niederschlag aus, der durch ein Buchner-Filter
abgenutscht und über Nacht unter vermindertem Druck getrocknet wird. Man erhält
447 mg (54,7 Prozent) 3o(,7-Dihydroxy-5ß-cholansäure, Fp. 142 bis 144°C. Die Reinheit
wird durch Dünnschichtchromatographie mit Toluol/Essigsäure/ Wasser im Verhältnis
5 : 5 : 1 und 50 prozentiger wässriger Schwefelsäure bestimmt.
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Beispiel 2 50 ml Hühner-Galie werden lyophilisiert. Man erhält ein
trockenes grünlichschwarzes Pulver, das in 100 ml wasserfreiem Methanol gelöst wird.
Die Lösung wird fast bis zum Siedepunkt erhitzt und heiss filtriert., Der grüne
Niederschlag wird mit
10 ml heissem wasserfreiem Methanol gewaschen
und verworfen.
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Das Methanol-Waschwasser wird mit der methanolischen Lösung vereinigt.
Es werden 2 ml konzentrierte Schwefelsäure zugegeben, die Lösung wird über Nacht
bei Raumtemperatur stehengelassen.
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Die Lösung wird dann in einem Scheidetrichter mit 200 ml Chlor roform
und 20 ml Wasser eine Minute lang geschüttelt. Die Phasen werden getrennt, die obere
alkoholische Phase ist farblos und enthält die Gallensäuren, die untere Chloroformphase
ist dunkelgrün und enthält die Pigmente sowie die anderen Verunreinigungen. Sie
wird abgetrennt und verworfen.
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Beispiel 3 50 ml Hühner-Galle werden lyophilisiert. Man erhält ein
trockenes grünlich-schwarzes Pulver, das in 100 ml Methanol gelöst wird. Die Lösung
wird fast bis zum Siedepunkt erhitzt, dann filtriert. Der entstandene grünlich-schwarze
Niederschlag wird verworfen; Die filtrierte Methanollösung wird bei Raumtemperatur
unter Rühren mit 5 g Kaliumhydroxid versetzt. Die Lösung wird über Nacht stehen
gelassen, dann unter Rühren mit konzentrierter Schwefelsäure neutralisiert. Die
Lösung wird dann mit 2 ml konzentrierter Schwefelsäure angesäuert und über Nacht
bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Lösung wird anschliessend in einem Eisbad
abgekühlt, mit 20 ml Eiswasser und einer gesättigten Natriumbicarbonatlösung tropfenweise
versetzt, bis der pH-Wert 8,0 bis 9,0 beträgt. Die Lösung wird filtriert und in
einem ScheTdetrichter mit 200 ml Chloroform und 20 ml Wasser 2 Minuten geschüttelt.
Die Phasen werden getrennt, die obere methanolische Phase ist fast farblos und enthält
die Gallensät a
die untere Chloroformphase ist grünlich und enthält
die Verunreinigungen.
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Beispiel 4 50 ml Hühner-Galle werden mit 2 g Natriumhydrqxid bis
zur Lösung gerührt und über Nacht stehen gelassen. Die Lösung wird in einem Eisbad
abgekühlt und mit 4n Salzsäure tropfenweise unter Rühren versetzt, bis der pH-Wert
unter 2,0 beträgt. Die Lösung wird anschliessend mit 1 ml konzentrierter Salzsäure
angesäuert und unter Rühren mit 9 ml Dimtho':apan je ml Lösung bei Raumtemperatur
versetzt. Das Gemisch wird eine Stunde gerührt, die entstandene Lösung wird über
Nacht stehen gelassen.
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Dann wird die Lösung in einem Eisbad abgekühlt, mit 10 ml Eiswasser
und einer gesättigten wässrigen Natriumbicarbonatlösung versetzt, bis der pH-Wert
der Lösung alkalisch ist. Die Lösung, wird filtriert und in einem Scheidetrichter
mit 200 ml Chloroform eine Minute geschüttelt. Die Phasen werden getrennt, die obere
wässrige Methanol-Aceton-Phase ist farblos und enthält die Gallensäuren, die untere
Chloroformphase enthält die Verunreinigungen und wird verworfen.
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Beispiel 5 Aus der gemäss Beispiel 2 gewonnenen klaren Lösung werden
die organischen Lösungsmittel abdestilliert. Die zurückbleibende wässrige Lösung,
die Gallensäuren-Peptid-Konjugate enthält, wird mit Natronlauge versetzt. Man erhält
100 ml einer Lösung, die 10 Prozent Natronlauge enthält. Diese farblose alkalische
2 Lösung wird 3 Stunden bei 0,984 kp/cm' Überdruck in einem verschlossenen
Reaktionsgefäss
hydrolysiert. Das entstandene Hydrolysat wird in einem Eisbad abgekühlt und tropfenweise
unter Rühren mit 4n Salzsäure angesäuert. Man erhält ein schwachgelbes gummiartiges
Produkt, das abfiltriert, mit Wasser gewaschen und in 80 ml 10 prozentigem wässrigem
Ammoniumhydroxid unter Rühren gelöst wird. Die Lösung wird bis fast zum Siedepunkt
erhitzt und unter Rühren tropfenweise mit 40 ml 10 prozentiger Bariumchloridlösung
versetzt. Man erhält einen weissen kristallinen Niederschlag, der abfiltriert, mit
Methanol gewaschen und bei 600C unter vermindertem Druck getrocknet wird. Man erhält
4,9 g Roh-Bariumsalz von 5y,7«-Dihydroxy-5B-cholansåure, das in 100 ml Äthylacetat
suspendiert und mit 100 ml 3n Salzsäure versetzt wird. Die entstandenen drei Phasen
werden geschüttelt, bis sich der Niederschlag wieder aufgelöst hat. Die Äthylacetat-Phase
wird abgetrennt, die wässrige saure Phase wird mit 50 ml Äthylacetat gewaschen.
Die vereinigten Äthylacetatlösungen werden mit Wasser neutral gewaschen und über
Natriumsulfat getrocknet.
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Die wässrige Phase wird verworfen.
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Die Äthylacetatphase wird eingedampft. Der Rückstand wird in 100 ml
Methanol gelöst und unter Rühren mit 10 ml einer 10-prozentigen Bariumchloridlösung,
anschliessend tropfenweise mit 1 ml konzentriertem Ammoniumhydroxid versetzt. Die
entstandene Lösung wird zum Sieden erhitzt, dann auf Raumtemperatur abgekühlt und
filtriert.
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Das Filtrat wird zur Überprüfung nochmals mit einer Bariumchloridlösung
versetzt. Ein gegebenenfalls gebildeter Niederschlag
wird wie
oben behandelt und mit dem Niederschlag aus der Mutterlauge vereinigt. Die vereinigten
Niederschläge werden mit Methanol gewaschen und bei 600C unter vermindertem Druck
getrocknet. Man erhält 4,1 g Roh-Bariumsalz von 3,7C(-Dihydroxy-5ßcholansäure.
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Dieses Roh-Bariumsalz wird mit 100 ml 3n Salzsäure und 100 ml Äthylacetat
geschüttelt, bis der Niederschlag vollständig in Lösung gegangen ist. Die Äthylacetatphase
wird abgetrennt, die wässrige saure Phase wird mit Äthylacetwaschen. Die vereinigten
Äthylacetatphaserl werden mit Wasser neutral gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet.
Die wässrigen Phasen werden verworfen.
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Die so erhaltene Äthylacetatlösung von 3O(,7O(-Dihydroxy-5ß cholansäure
wird bei 50 0C in einem Luftstrom auf 40 ml eingemit engt. Die erhaltene Lösung
wird auf 40C abgekühlt unv n-Hexan versetzt, bis die Lösung schwach trüb ist. Die
Äthylacetat-n-Hexanlösung wird bei 40C über Nacht stehen gelassen, wobei an den
Wänden des Gefässes reine 3xs7«-Dihydroxy-5ß-cholansäure auskristallisiert. Die
Kristalle werden durch Filtrieren gesammelt, mit n-Hexan gewaschen und unter vermindertem
Druck bei 600C getrocknet. Man erhält 3,2 g 3t,7A-Dihydroxy-5ß-cholansäure, Fp.
140 bis 1420C, in einer Reinheit von 99,0 Prozent (bestimmt durch Gas-Flüssig-Chromatographie).
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Man kann dieses Produkt gegebenenfalls gemäss den Beispielen 6 bis
8 weiter reinigen.
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Beispiel 6 Die gemäss Beispiel 5 gewonnene Gallensäure wird in Äthylacetat,
das n-Hexan enthält, gelöst. Die Lösung wird einer 5-Stufen-Gegenstromverteilung
zwischen 25 ml 70 prozentiger wässriger Essigsäure und 40 ml 40 prozentigem Isopropyläther
in n-Hexan unterworfen. Die gereinigte Gallensäure befindet sich in der Isopropyläther-Phase,
, aus der sie durch Eindampfen gewonnen werden kann.
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B e i-s p i e 1 7 Die gemäss Beispiel 5 gewonnene Gallensäure kann
durch Säulen-Verteilungs-Chromatographie auf Diatomeenerde mit 70 prozentiger Essigsäure
als stationäre Phase und 40 prozentigem Isopropyläther-n-Hexan als mobile Phase
weiter gereinigt werden.
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Mit einer g-Saule kann man 1 g Roh-Gallensäure reinigen.
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Beispiel 8 Die gemäss Beispiel 5 gewonnene Gallensäure kann durch
Adsorptions-Chromatographie auf saurem Aluminiumoxid, Aktivitätsstufe V, weiter
gereinigt werden. Die Gallensäure wird in Äthylacetat oder Aceton gelöst und auf
die Säule aufgegeben. Die Säule adsorbiert die Verunreinigungen, die die Gallensäure
enthaltende Lösung läuft durch.
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Beispiel 9 Die gemäss Beispiel 4 gewonnene, die Gallensäuren enthaltende
Lösung. kann entweder mit Diazomethan oder;Methanol in Schwefe'-säure
gemäss
Beispiel 1 verestert werden. Das Estergemisc- wird dann gemäss Beispiel 1 auf einer
Aluminiumoxid-Säule weiter gereinigt.
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.B e i s p i e 1 10 Gemäss Beispiel 5 wird das trockene rohe Bariumsalz
von 3o(, 7o(-Dihydroxy-5ß-cholansäure hergestellt (erste Ausfällung).
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Dieses trockene Salz wird mit 100 ml wasserfreiem Methanol veM-setzt
und bis zur vollständigen Lösung des Salzes unter-Rühren bis fast zum Sieden erhitzt.
Beim Abkühlen der heissen Lösung fallen weisse Kristall-e aus. Die Lösung wird filtriert,
der Niederschlag wird getrocknet. Man erhält 4,0 g 98 Prozent reines Bariumsalz
von 3«,7«-Dihydroxy-5ß-cholansäure. Das Bariumsalz wird mit 100 ml 3n Salzsäure
und 100 ml Äthylacetat geschüttelt, bis das Salz vollständig in Lösung gegangen
ist.
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Die Äthylacetat-Phase wird abgetrennt, die wässrige saure Phase wird
mit Äthylacet'at gewaschen. Die vereinigten Äthylacetat-Phasen werden mit Wasser
neutral gewaschen und über Natrium--sulfat getrocknet.
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Diese Äthylacetatlösung wird bei 500C in einem Luftstrom auf 45 ml
eingeengt, dann auf etwa 40C abgekühlt und über Nacht stehen gelassen.. Dabei kristallisiert
reine 3α,7α-Dihydroxy-5ß-cholansäure aus. Die Kristalle werden gesammelt
und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 3,1 g 3o(,76(-Dihydroxy-5ß-cholansäure,
Fp. 141 bis 143°C, in über 99,0 prozentiger Reinheit (bestimmt durch Gas-Flüssig-Chromatographie).
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Man kann das wasserfreie Methanol durch entsprechende Mengen an wasserfreiem
Äthanol, Aceton oder Essigsäure ersetzen.
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B e i 5 p i e 1 11 Es wird gemäss Beispiel 5 verfahren, mit dem Unterschied,
dass das n-Hexan durch entsprechende Mengen an n-Heptan, n-Octan oder n-Pentan ersetzt
wird.
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B e i s p i e 1 12 Es wird gemäss Beispiel 2 verfahren, mit dem Unterschied,
dass als Gallen-Rohsubstanz die Galle von Sardinen, Rotbarsch, Dorsch oder Schaf
verwendet wird. Man erhält eine klare schwach gefärbte Lösung, die die entsprechenden
Gallensäuren, jedoch keine Verunreinigungen, enthält.
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B e i s p i e 1 13 Es wird gemäss Beispiel 1 bis 5 verfahren, mit
dem Unterschied, -dass als Gallen-Rohsubstanz die Galle von Truthähnen, Gänsen und
Enten verwendet wird.
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B e i 5 p i e 1 14 50 ml Schweine-Galle werden lyophilisiert. Man
erhält ein schwach grünlich-gelbes Pulver, das in wasserfreiem Methanol gelöst wird.
Die Lösung wird erhitzt, filtriert und mit weiterem Methanol versetzt. Die methanolische
Lösung wird mit Schwefelsäure versetzt, bis das Lyophilisat vollständig verestert
ist. Das Estergemisch wird einer selektiven Hydrolyse
unterworfen
durch Umsetzen mit einer Alkalimetallbase bei erhöhter Temperatur in Gegenwart eines
alkalischen Puffers, der den-pH-Wert des Reaktionsgemisches zwischen 10 und 11 hält.
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Die Hydrolyse wird so lange fortgesetzt, bis die Gallensäuren hydrolysiert
sind. Das Gemisch wird in einem Scheidetrichter mit 200 ml Chloroform und 20 ml
Wasser eine Minute lang geschüttelt. Die untere Chloroformphase ist intensiv grünlichgelb
und enthält die Pigmente sowie andere Verunreinigungen.
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Die obere alkoholische Phase ist klar und schwach gelb und enthält
die Gallensäuren. Die Chloroformphase wird abgetrennt und verworfen.
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Die weitere Reinigung dieser schwachgelben Lösung erfolgt gemäss Beispiel
5.
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B e i s p i e 1 1'5 Es wird gemäss Beispiel 2 verfahren, mit dem
Unterschied, dass an Stelle von Methanol entsprechende Mengen von Hexan, Dimethyläther,
Aceton oder Essigsäure verwendet werden.
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B e i s p i e l 16 Es wird gemäss Beispiel 2 verfahren, mit dem Unterschied,
dass an Stelle von Chloroform entsprechende Mengen von Toluol, Methylenchlorid,
B.enzol oder Methylendichlorid verwendet werden.