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Verfahren zur Herstellung gereinigter Konzentrate der Vitamine der
Br2-Gruppe
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung gereinigter
Konzentrate der Vitamine der Bl2-Gruppe.
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Bei der Herstellung von Vitaminen der Bl2-Gruppe aus Leber oder Leberkonzentraten
begegnet man fortwährend der Schwierigkeit, daß eine kleine Menge Vitamine von einer
sehr großen. Menge Begleit- oder Ballaststoffe abgetrennt werden muß.
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Bei den Trennungsmethoden benutzt man die Unterschiede in den Eigenschaften
der Vitamine und der Ballaststoffe, beispielsweise den Unterschied in der Löslichkeit
in verschiedenen Lösunglsmitteln und/oder hinsichtlich der Adsorption an Adsorbentien
bei der Chromatographie.
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Ein derartiges Verfahren ist Gegenstand des älteren Patents 859 352
und schlägt die Behandlung einer wäßrigen Lösung eines Witamin-B12-konzentrates
mit einer 10 bis 25 % gewichtsvolumprozentigen Lösung von Phenol in einer apolären
organischen flüssigkeit vor. Das Vitamin B12 geht dabei in die organische Phase
über.
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Ein weiteres Verfahren ist Gegenstand des. älteren deutscen Patents
835 I78 und schlägt eine chromatographische Reinigungsmethode eines Vitamin-Bl2-Konzentrates
vor, wobei als Eluierungsmittel ein Gemisch eines Lösungsmittels für Vitamin B12
und einer organischen Flüssigkeit benutzt wird, die instande ist, Vitamin B12 aus
seiner Lösung zu präzipitieren. Die Verunreimgungen bleiben an der Säule absorbiert.
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Mit Hilfe dieser Methoden gelingt es, einen bestimmten Prozentsatz
der im Ausgangsmaterial be-
findlichen Vitamine der Bl2-Gruppe,
im folgenden Vitamin B12 genannt, in reinem Zustand zu efhalten. Es stellte sich
jedoch heraus, daß es bisher nicht möglich war, praktisch die gesamte Menge der
ursprünglich anwesenden Vitamine in reinem Zustand zu gewinnen. Immer verteilte
sich die biologische Aktivität des ursprünglichen Präparates mehr oder weniger abhängig
vom Stadium der Reinigung, über verschiedene Fraktionen, die jede für sich weiteren
Reinigungsbearbeitungen unterworfen werden mußten.
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Namentlich bei der Chromatographie von Vitamin-B12-Konzentraten ist
dieser Effekt klar wahrnehmbar. Et wurde schon bemerkt von E. Lester Smith, Nature
I6I, 638 (I948), der durch Chromatographie zwei aktive Faktoren. isolieren konnte.
Er Stellte auch schon fest (Proc. Biochem.
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Soc. 29. Mai I948), daß durch Proteolyse der Leber als eines die Vitamine
B12 enthaltenden Grundstoffes eine Verschiebung. des Verhältnisses der beiden Faktoren
bewirkt werden konnte, wodurch die Isolierung und Reinigung dieser Vitamine leichter
durchgeführt werden konnte.
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Bei der Isolierung der kristallinischen Vitamine der B12-Gruppe aus
Leber benutzt man daher die eine oder andere Form der Proteolyse der Konzentrate,
entweder mittels Enzyme oder mittels Bakterien, worauf die Abscheidung der aktiven
Faktoren leichter bewirkt werden kann. Man erhält hierbei den Eindruck, als ob wenigstens
ein Teil der Vitamine B12 im Grundstoff und in den Konzentraten. in konjugierter
Form, wahrscheinlich gebunden an ein Polypeptid, anwesend ist.
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Weiterhin ist Gegenstand des älteren deutschen Patents 9I2 743 ein
Verfahren zur Gewinnung von Vitamin B12 aus Kulturflüssigkeiten, die durch Züchtung
von Vitamin B12 produzierenden Mikroorganismen in einem geeigneten Nährmedium vergoren
wurden und bei dem die betreffenden Flüssilgkeiten oder ihre Konzentrate mit Stoffen
behandelt werden, die befähigt sind, Cyanionen zu liefern.
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Dieses Verfahren bezieht sioh ausschließlich auf die Aufarbeitung
von Kulturflüssigkeiten oder ihrer Konzentrate.
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Erfindungsgemäß wurde erkannt, daß auch Leber und Leberkonzentrate,
die sich hinsichtlich ihrer Entstehung, ihres Charakters und ihrer Zusammensetzung
grundsätzlich von den Kulturflüssigkeiten unterscheiden, bei Behandlung mit Cyanionen
eine bessere Ausbeute an Vitamin B12 ergeben. Das Verdienst der Erfindung besteht
in der Feststellung, daß sich bei Leber und Leberkonzentraten der Effekt der Proteolyse
nicht nur erreichen, sondern noch bedeutend verbessern läßt, wenn man die Leberpräparate
mit einem Cyanid oder mit Blausäure behandelt, worauf alle ursprünglich anweisenden
aktiven Faktoren als ein Ganzes von den begleitenden Verunreinigungen mit Hilfe
der üblichen Reinigungsmethoden abgeschieden werden können.
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Gemäß der Erfindung setzt man dem zu reinigenden Leberpräparat eine
genügende Menge Cyanid oder Blausäure oder Stoffe, die durch Reaktion Cyanide oder
Blausäure bilden können, hinzu und läßt das Gemisch einige Zeit stehen. Sogar sehr
geringe Mengen Cyanid stellten sich als aktiv heraus. Der Einfluß der Temperatur
scheint hierbei von geringer Bedeutung. Vorzugsweise wird diese Behandlung bei einem
pH-Wert zwischen p, 5 und 7 bei Zimmertemperatur durchgeführt, da unter diesen Umständen
die Möglichkeit der Zerstörung der Vitamine B, am geringsten ist. Unter günstigen
Umständen kann eine Behandlungsdauer von 6 Stunden schon genügen.
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Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann man praktisch in allen
Fällen, in denen bis jetzt eine vollständige Gewinnung der anwesenden Vitamine B12
aus Leber unmöglich war, mit den leekannten Reinigungsmethoden die Total menge an
Vitaminen B,9- in reinem Zustand erhalten. Bei der chromatographischen Trennungsmethode
beispiels weise treten bei unbehandelten Konzentraten verschiedene gelb bis braun
gefärbte Bänder auf, die nicht mit den für die Vitamine geeigneten Eluierungsmitteln
entfernt werden können, die jedoch nach biologischer Testung biologisch aktives
Material enthalten. Bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens tritt jedoch
nur ein aktives Band auf, das violettrot gefärbt ist und sich als Ganzes eluieren
läßt, während die übrigen Bänder inaktiv sind.
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Im allgemeinen kann man mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eine
kräftigere und radikalere Reinigung der Leber oder Leberkonzentrate durch führen,
als bis jetzt möglich. war. Die isolierten, kristallinischen Vitamine B12, die aus
mit einem Cyanid behandelten Leberkonzentraten erhalten sind, können nicht von denen
unterschieden werden, die mit Hilfe der Proteolysenmethoden gewonnen werden.
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Eine wissenschaftliche Erklärung dieses Effektes der »Cyanidbehandlung«
kann noch nicht gegeben werden. Dadurch, daß man die totale anwesende Menge Vitamine
durch die Behandlung in einen Zustand übergeführt hat, in dem sie in physikochemischer
Hinsicht gleiche Eigenschaften besitzen, haben die üblichen Reinigungsmethoden jetzt
einen viel größeren Ertrag, als wenn sie auf nicht behandelte Konzentrate angewandt
werden. Demzufolge ist oft ein einziges Reinigungsverfahren aus reichend anstatt
einer mehrmals wiederholten, auf jeden erhaltenen Faktor gesondert anzuwendenden
Reinigungsmethode, wodurch sich bedeutende Vorteile ergeben.
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Die Behandlung gemäß der Erfindung kann vor, während oder nach den
üblichen Reinigungsmethoden durchgeführt werden in Abhängigkeit von der sich in
dem besonderen Fall ergebenden vorteilhaftesten Ausbeute.
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Vorzugsweise werden lösliche Cyanide, wie Kaliuimcyanid oder Natriumcyanid,
benutzt; aber auch andere Cyanide sind durchaus brauchbar.
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Eine besonders günsteige Ausführungsform der Erfindung liegt in einer
gleichzeitigen Anwendung der Cyaiiidbehandlung und der Proteolyse bei der Reinigung
der aus Leber gebildeten Vitamin-B12 -
Konzentrate. Gemäß der Erfindung
unterzieht man diese Konzentrate während der Behandlung mit einem Cyanid einer enzymatischen
Verdauung. Von den in Betracht kommenden Enzymen hat sich das Papain als am geeignetsten
herausgestellt, da es zu gleicher Zeit von Cyanid aktiviert wird. Die Ausbeute und
die Aktivität des gereinigten Präparates sind größer als die des nach proteolyse
allein erhaltenden Präparates.
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An sich ist die Proteolyse von beispielsweise Leberextrakten mit
Papain bekannt (schwedische Patentschrift 124 855), während gleichfalls die Aktivierung
von Papain im allgemeinen mit H C N, Thiolgruppen enthaltenen Stoffen, wie Cystein
oder H2S, bekannt ist (Laboratory Methods of Biochemistry, S. II7, I938, von A.
Bertho und W.
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Grass mann). Es wurde festgestellt, daß die Vitamine B12 durch H2
S zerstört werden, während dies jedoch in Gegenwart von Cyaniden nicht der Fall
ist.
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Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen erläutert.
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Beispiel I 100 ccm eines einigermaßen gereinigten Leberextraktes
mit 300/0 Trockensubstanz werden nach einer Methode, die Gegenstand des älteren
Patents 835 I78 ist, durch Chromatographie über neutrales, gewaschenes Aluminiumoxyd
(330 g) gereinigt.
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Diese Reinigung liefert ein rotes Eluat, aus dem 8,2 mg kristallinische
Vitamine B, 2 gewonnen werden. Die in der Säule zurückgebliebenen braunen und gelben
Bänder werden mit 0,1 0/0 Ammoniaklösung eluiert, worauf das Eluat sofort auf einen
pHWert von p pH 6,5 eingestellt wird. Hierzu wird noch das braune Eluat zugesetzt,
das nach dem Auffangen des genannten roten Eluates noch mit Wasser aus der Säule
entfernt werden konnte. Aus diesem Gemisch können mit den bis jetzt bekannten Methoden
keine kristallinischen Vitamine B12 isoliert werden.
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Hierzu wird nun 75 mg KCN zugesetzt, worauf der pH-Wert auf pH 6
eingestellt wird. Nach einer Einwirkung von 2 Tagen bei einer Temperatur von 520
wird die Lösung im Vakuum bis auf ungefähr 100 ccm eingedampft und darauf chromatographiert
über eine Säule von 250 g Aluminijmoxyd. Man erhält nach Reinigung in bekannter
Weise 7,4 mg kristallinische Vitamine B12 aus dem roten Eluat.
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Beispiel 2 37 g eines Pulvers mit einer vitamin-B12-Aktivität von
21 mg + 10%, das als Abfallprodukt bekannter Reinigungsmethoden entstanden ist und
aus dem mit diesen Methoden keine rotgefärbte Lösung mehr isoliert werden kann,
werden während I6 Stunden bei Zimmertemperatur mit 250 mg Na C N behandelt. Darauf
wird das Gemisch über eine Säule von 400 g neutralem Aluminiumoxyd chromatographiert,
wobei sich ein einziges violettrotes Band während der Elution mit Wasser nach unten
verschiebt. Das hieraus erhaltene Präparat besitzt nach mikrobiologischer Testung
19 mg # 10% vitamine B12, d. h. alle ursprünglich anwesenden Vitamine. Der trockenrest
ist ungefähr 15 g.