DE967663C - Verfahren zur Gewinnung von Cyano-cobalamin - Google Patents

Description

AUSGEGEBEN AM 5. DEZEMBER 1957

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Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung von Cyano-cobalamin, das in einer kombinierten aufeinanderfolgenden Behandlung von Vitamin-B₁₂-enth<a>ltenden Rohstoffen, wie Lösungen bzw. Konzentraten, mit Sulfit- und Cyanidionen besteht.

Bekanntlich gibt es verschiedene Formen oder Modifikationen des'Vitamins B₁₂, die sich dadurch voneinander unterscheiden, daß verschiedene anorganische oder organische Verbindungen am zentralen Kobaltatom koordinativ (komplex) oder auch ionogen (dissoziierbar) gebunden sind. Unter diesen Modifikationen oder Formen des Vitamiris B₁₂ ist am wichtigsten der mit Cyanidionen entstehende Komplex, der als Monocyano-cobalamin oder Cyano-cobalamin schlechthin bezeichnet wurde und der die handelsübliche Form des Vitamins B₁₂ vorstellt.

In natürlichen Substraten liegt das Vitamin B₁₂ ganz überwiegend in Protein- oder Peptidbindung vor. Zu seiner Freisetzung aus dieser gebundenen Form ist eine Behandlung der Ausgangsmaterialien, z. B. mit proteolytischen Enzymen oder durch einfaches Erhitzen zwecks Denaturierung und Koagu-

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lierung der Eiweißstoffe erforderlich. Bei dieser Behandlung geht das Vitamin B₁₂ als Hydroxo- bzw. Aquokomplex in Lösung. Um als Enderzeugnis Cyano-cobalamin zu gewinnen, müssen die in der erwähnten Weise erhaltenen Extrakte oder daraus hergestellten Konzentrate mit Cyanidionen behandelt werden. Am zweckmäßigsten erwies es sich aber, gleich die Vorbehandlung der Ausgangsstoffe in Gegenwart von Cyanidionen vorzunehmen, ίο weil dadurch die Freisetzung von Vitamin B₁₂ gefördert wird. Ferner wird die Ausbeute in Gegenwart von Cyanidionen auch deshalb erhöht, weil die Cyanoform des Vitamins B₁₂ gegenüber Erhitzen bedeutend stabiler ist als die ansonsten vorliegende Hydroxo- bzw. Aquoform.

Zur Erzielung der mit der Cyanidbehandlung verbundenen Effekte sind mehrere Verfahren bekanntgeworden.

Nach der deutschen Patentschrift 912743 bzw. der USA.-Patentschrift 2530416 werden Kulturflüssigkeiten, die durch Züchtung von Vitamin-B₁₂-produzierenden Mikroorganismen in einem geeigneten Medium vergoren wurden, oder Konzentrate solcher Kulturflüssigkeiten mit Cyanidionen behandelt, wodurch die Ausbeute erhöht wird.

Nach dem Verfahren der deutschen Patentschrift 932 981 werden Mikroorganismenmassen, wie z. B. Mycel von Streptomycesarten, die Vitamin-B₁₂-aktive Stoffe enthalten, unter vorangehender oder gleichzeitiger Autolyse unmittelbar mit Cyaniden behandelt.

Ferner werden nach der deutschen Patentanmeldung N 3334 IV a/30 h (Patent 940489) bzw. nach der gleichlautenden britischen Patertschrift 693 125 Konzentrate, die Vitamine der B₁₂-Gruppe enthalten, einer Behandlung mit Cyaniden usw. unterworfen, wobei eventuell während dieser Behandlung eine enzymatisch^ Verdauung (z. B. mit Papain) vorgenommen wird.

Nach der britischen Patentschrift 727 146 wird in der Weise vorgegangen, daß ein Rohmaterial, das wenigstens 1 °/o> Vitamin B₁₂ enthält, in wäßriger Lösung mit Cyanidionen behandelt und der so gebildete Vitamin-B₁₂-Cyanid-Komplex in Gegenwart von Ammonsulfat in n-Butanol aufgenommen wird.

In der deutschen Patentschrift 897316 bzw. in der gleichlautenden USA.-Patentschrift 2 650 896 wird beschrieben, die Ausbeute an Vitamin B₁₂ dadurch zu erhöhen, daß man bereits die zur B₁₂-Erzeugung dienende Fermentation in Gegenwart eines Stoffes ausführt, der in der Lage ist, an den Organismus die Cyangruppe abzugeben. Man verwendet dabei entweder ein ionisierbares Cyanid oder eine Cyankomplexverbindung, wie Kaliumferrocyanid oder Kaliumferricyanid.

Hierher gehört ferner die veröffentlichte deutsche Patentanmeldung F 9534 IVa/30h (Patent 939 108), in der Kulturflüssigkeiten nach beendeter B₁₂-Fermentation zwecks Freisetzung des Vitamins B₁₂ mit Cyankomplexverbindungen wie Ferro- und Ferricyankalium usw. oder Nitrilen behandelt werden.

Allen diesen Verfahren haften, wie nachfolgende Ausführungen zeigen, bestimmte Nachteile an.

Soweit man bei den genannten Verfahren Blausäure bzw. Cyanide auf ein großes Flüssigkeitsvolumen und überdies unter Erwärmen einwirken lassen muß, um Vitamin B₁₂ freizusetzen und gegen Zerstörung zu schützen, ist die Handhabung der relativ großen Mengen an Blausäure bzw. Cyaniden nicht ungefährlich und daher mit gewissen Schwierigkeiten verbunden. Es sind jedenfalls besondere Vorsichtsmaßnahmen erforderlich, die den technischen Betrieb erschweren.

Läßt man aber Blausäure oder Cyanide erst auf Konzentrate einwirken, was infolge des weitaus geringeren Volumens bereits viel einfacher und ungefährlicher ist, so muß man auf den Effekt der Freisetzung und Stabilisierung des Vitamins B₁₂ in allen Anfangsstadien des Aufarbeitsprozesses, also auf die Hauptvorteile der Cyanidanwendung, verzichten, wodurch die Ausbeute beträchtlich vermindert wird.

Will man aber schließlich die ungefährlichen Cyankomplexverbindungen oder Nitrile an Stelle von Blausäure oder Cyaniden verwenden, so benötigt man weitaus größere Mengen, wodurch die Wirtschaftlichkeit in Frage gestellt ist.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird ein neuer Weg aufgezeigt, durch den alle den oben angeführten Verfahren anhaftenden Nachteile, wie dem Nachstehenden zu entnehmen ist, überwunden werden.

Vitamin B₁₂ findet sich in der Natur entweder gebunden an Proteine oder Peptide oder in freier Form als Hydroxocobalamin (Vitamin B_{12 a} bzw. Vitamin B_{12 b}). In dieser Form ist es besonders gegen Erhitzen wenig stabil. Es war bereits bekannt, daß nicht nur Cyanidionen, sondern auch Sulfitionen einen schützenden, also stabilisierenden Einfluß auf Vitamin B₁₂ ausüben, wie von H. W. Loy, J. F. Haggerty und O. L. Kline (J. Ass. Off. Agric. Chem., 35, S. 169 [1952]) näher ausgeführt wird. Von dieser stabilisierenden Wirkung der Sulfitionen wurde bereits des öfteren Gebrauch gemacht, so von H. H. Fricke, B. Lanius, A. F. De Rose, M. Lapidus und D. V. Frost (Fed. Proc, 9, S. 173 [1950]) oder R. F. Prier, P. H. Derse und C. H. Krieger (Arch. Biochem. Biophys., 40, S. 474 [1952]) oder J. S. Chiao und W. H. Peterson (Appl. Microbiol., i, S. 42 [1953]) bei der Herstellung von Proben für die Durchführung des mikrobiologischen Testes. Ferner suchte man auch bei der Herstellung von Vitamin - B₁₂ - haltigen Zusatzfuttermitteln die Schutzwirkung der Sulfitionen auszunutzen (V. F. Pfeiffer, C. Vojnovich und E. N. Heger, Ind. Eng. Chem., 46, S. 843 [1954]).

Der in Gegenwart von Sulfitionen entstehende Komplex wurde als Sulfito-cobalamin bezeichnet (siehe dazu Loy et al., a.a.O.) und kann in kristallisierter Form gewonnen werden. So erhielten E. A. Kaczka, D. E. Wolf, F. A. Kuehl und K. FoI-kers (J Am. Chem. Soc, 73, S. 3569 [1951]) bei

der Einwirkung von schwefliger Säure auf Vitamin B₁₂ (Cyano-cobalamin) schlanke dunkelrote Nadeln, die wahrscheinlich Sulfito-cobalamin vorstellen.

Durch Einwirken von Cyanidionen werden bekanntlich alle Formen des Vitamins B₁₂ in Cyanocobalamin umgewandelt. Dies gilt auch für das Sulfito-cobalamin. So wurden von Chiao und Peterson (a.a.O.) Citratextrakte, die Sulfitocobalamin enthalten, zum Zweck des mikrobiologischen Testes mit Cyanidionen behandelt.

Das erfindungsgemäße Verfahren beinhaltet eine bewußte Ausnutzung der günstigen stabilisierenden Wirkung von Sulfitionen auf Vitamin B₁₂ im Anfangsstadium des Aufarbeitungsprozesses unter gleichzeitiger Kombination mit einer an sich bekannten Cyanideinwirkung in einem Stadium der Aufbereitung, in dem das Vitamin B₁₂ bereits von der Hauptmenge an Verunreinigungen befreit ist. ao Das erfindungsgemäße Verfahren gestaltet sich folgendermaßen:

Das zu verarbeitende B₁₂-haltige Rohmaterial wird — wie für die Faulschlammverarbeitung bereits in der deutschen Patentschrift 922 126 näher beschrieben — in wäßriger Suspension in Gegenwart von Sulfitionen (0,05 bis 0,2 %» an SO₂) erhitzt, wobei die B₁₂-aktiven Stoffe freigesetzt werden und in den wäßrigen Extrakt übergehen. Anschließend findet die Adsorption an Montmorillonit und die Elution der B₁₂-aktiven Stoffe gleichfalls in Gegenwart von Sulfitionen statt, wie aus der deutschen Patentschrift 929 987 bekannt ist. Auch die nachfolgende Adsorption an Aktivkohle und Elution der Cobalamine aus dem Adsorbat wird vorteilhafterweise in Gegenwart von Sulfitionen vorgenommen. Dies gilt auch für die Konzentrierung des Kohleeluates durch Vakuumverdampfung. Das Volumen ist nun auf etwa 1/400 des ursprünglichen gesunken. Bei der Verarbeitung von z. B. 100 cbm Faulschlamm mit einer mikrobiologisch ermittelten B₁₂-Aktivität von z. B. 0,5 mg/1 (entsprechend einer gesamten B₁₂-Aktivität von 50 g in 100 cbm) liegt nun nach dem beschriebenen Arbeitsprozeß ein Konzentrat von nur noch 250 1 vor, das bei einem Trockensubstanzgehalt von etwa 10% eine B₁₂-Aktivität von 140 mg pro 1 besitzt, entsprechend einer Gesamtaktivität von 35 g in 250 1 bzw. einer B₁₂-Aktivität von 1,4 g je kg Trockensubstanz. Die bisher beschriebenen Maßnahmen sind aus den deutschen Patentschriften 922126 und 929987 bereits grundsätzlich bekannt, werden aber in sinnvoller Weise miteinander verknüpft. Das in diesem Stadium des Aufbereitungsprozesses erhältliche Konzentrat kann nun z. B. zur Trockne gebracht und in diesem Zustand oder in Mischung mit verschiedenen Futtermitteln als APF-Produkt in der Tierfütterung verwendet werden.

Zwecks weiterer Aufbereitung des genannten Konzentrates mit dem Ziel, zu kristallisierten Cyano-cobalamin zu gelangen, wie es der Zweck der vorliegenden Erfindung ist, kann man die Umwandlung der Sulfito-cobalamine in Cyano-cobalamine in verschiedenen Stadien der Aufarbeitung vornehmen. Nachfolgend werden zwei Stadien angeführt, in denen diese Umwandlung vorteilhafterweise erfolgen kann.

In dem einen Fall geht man bereits von dem in der oben geschilderten Weise erhaltenen wäßrigen Konzentrat aus, in dem die B₁₂-Aktivität auf das mehr als 2oofache der ursprünglichen, bezogen auf das Volumen, angestiegen ist. In solchen Konzentraten liegen Sulfito-cobalamine vor und werden nun durch Zusatz von Cyanidionen in Cyanocobalamine umgewandelt. Alle anschließenden Prozesse führt man in Gegenwart von Cyanidionen durch. Man benutzt dabei zur weiteren Reinigung vorteilhafterweise Solventextraktoren und bedient sich z.B. der in der deutschen Patentschrift 932982 und die deutsche Patentanmeldung A17151 IV a/30 h (Patent 940 423) beschriebenen Verfahren. Alle diese Prozesse spielen sich bereits in relativ kleinen Volumina ab.

Im zweiten Fall führt man auch noch die extraktiven Reinigungsprozesse in Gegenwart von SuI-fitionen durch. Man muß sich dann eines besonderen Verfahrens bedienen, das von den bisher noch nicht beschriebenen besonderen Eigenschaften der Sulfito-cobalamine Gebrauch macht, nämlich von dem Farbumschlag von Gelb oder Orangerot in Rot bis Violett beim Zusatz von Cyanidionen zu Lösungen von Sulfit-cobalaminen. Bei der extraktiven Reinigung der Cobalamine in Gegenwart von Sulfitionen ist es nämlich schwieriger, den Verlauf der Reinigung visuell festzustellen, weil die meisten Verunreinigungen gelb bis gelbbraun gefärbt sind und sich daher von den rötlichgelb- bis rotorangegefärbten Lösungen der Sulfitocobalamine rein äußerlich nur schwer unterscheiden lassen. Wenn man aber Proben aus den verschiedenen Extraktionsphasen entnimmt und mit Cyanidionen beim p_H 6,5 versetzt, so zeigt ein Farbumschlag in Rot bis Violett sofort an, in welchen Fraktionen die Cobalamine jeweils vorliegen. Dadurch ist man in der Lage, die Extraktionsprozesse leicht zu kontrollieren. Man kann in dieser Weise in Gegenwart von Sulfitionen praktisch ebenso arbeiten, wie es sonst in Gegenwart von Cyanidionen üblich ist. Anschließend gewinnt man ein mit den Sulfito-cobalaminen beladenes Kieselgurpräparat, im Prinzip nach der von W. Friedrich und K. Bernhauer (Z. Naturforschg., 9b, S.755 [1954]) beschriebenen Methode. Die B₁₂-Aktivität ist nun im Kieselgurpräparat auf das mehr als 20 ooofache der Ausgangsaktivi ■ tat, bezogen auf das Volumen, angestiegen. Die im nun erreichten Stadium der Aufarbeitung in bereits sehr hoch gereinigter Form vorliegenden Sulfito-cobalamine werden nun erfindungsgemäß während der anschließenden chromatographischen Reinigung und Trennung der verschiedenen Vitamin-B₁₂-Faktoren durch Anwendung von Cyanidionen bei der Chromatographie in Cyano-cobalamine umgewandelt. Man bedient sich dabei z. B. des in der deutschen Patentschrift 930651 geschilderten Verfahrens, bei dem man Zellulosesäulen be-

nutzt und die Trennung mit wasserhaltigem Butanol in Gegenwart von Cyanidionen bewerkstelligt, wonach schließlich die erhaltenen Fraktionen auf kristallisierte Cyano-cobalamine verarbeitet werden.

Das Wesen der Erfindung besteht demnach in einer Kombination, derzufolge man die gesamten ersten Stufen des Aufarbeitungsprozesses, bei denen große Volumina zu bewältigen sind, in ίο Geg nwart von Sulfitionen durchführt, erst in einem Stadium, in dem bereits kleine Volumina vorliegen, die Sulfito-cobalamine in Cyano-cobalamine umwandelt und schließlich die weitere Reinigung und Endfertigung bis zur Gewinnung von kristallisierten Cyano-cobalaminen in Gegenwart von Cyanidionen vornimmt.

Zur Abgrenzung des erfindungsgemäßen Prozesses von den bisher bekanntgewordenen Verfahren mögen noch folgende Ausführungen dienen: Bei allen bisherigen Verfahren werden Cyanide oder Cyankomplexverbindungen bzw. Nitrile auf Kulturflüssigkeiten oder Konzentrate einwirken gelassen, in denen die Cobalamine als Proteinkomplexe oder in der Hydroxoform vorliegen, keinesfalls aber in der Sulfitoform, da es sich um natürliche Substrate handelt, die keine Sulfitionen enthalten. In allen diesen Fällen wird demnach unter der Einwirkung der Cyanidionen usw. vor allem eine Umwandlung der Hydroxoform in die Cyanoform bewerkstelligt. Zum Unterschied von allen diesen Verfahren wird bei dem erfindungsgemäßen Prozeß die natürliche Hydroxoform zunächst in die Sulfitoform und erst diese in die Cyanoform umgewandelt. Zum Unterschied von jenen Methoden, bei denen eine Umwandlung von Sulfito-cobalaminen in Cyano-cobalamine noch im Stadium der ursprünglichen nicht vorgereinigten Lösungen erfolgt, wie dies z. B. beim mikrobiologischen Test der Fall sein kann, wird bei dem erfindungsgemäßen Prozeß die Umwandlung von Sulfito- in Cyano-cobalamine erst in einem Stadium der Reinigung vorgenommen, bei dem die B₁₂-Aktivität im Verlauf der Reinigung bereits auf das mehr als 2oofache der ursprünglichen angestiegen ist, was besondere verfahrensmäßige Vorteile mit sich bringt.

Wie leicht ersichtlich, wird durch das vorliegende Verfahren ein bedeutender Fortschritt erzielt, der sich vor allem bei der Gewinnung von Cyano-cobalamin im großtechnischen Maßstab auswirkt. Das Verfahren ist einfach zu handhaben, da Sulfitionen in den angewendeten Mengen völlig ungefährlich sind und die Umwandlung der Sulfito-cobalamine in Cyano-cobalamine erst in einem Stadium erfolgt, bei dem nur noch relativ kleine Volumina zu verarbeiten sind. Die allen bisherigen Verfahren anhaftenden Nachteile werden durch das erfindungsgemäße Verfahren beseitigt.

Dieses Verfahren kann auf B₁₂-haltige Ausgangsmaterialien jeglicher Art angewendet werden, so z. B. auf Fermentationsflüssigkeiten, die zum Zweck der Vitamin-B₁₂-Gewinnung hergestellt werden, auf Faulschlamm- bzw. Rückstände der i Methangärung, auf Belebtschlamm, Fischpreßwasser usw. Ferner können zur Überführung der Sulfito- in die Cyanoformen an Stelle von Cyanidionen auch komplexe Cyanverbindungen, wie Ferro- oder Ferricyanide, oder auch Nitrile od. dgl. verwendet werden, doch bieten diese Verbindungen in der Regel keine Vorteile, da man sie in größerer Menge einsetzen muß, um den gewünschten Zweck zu erreichen.

Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird an Hand .der nachfolgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

4 cbm Faulschlamm mit einem Trockensubstanzgehalt von 7% und einer Vitamin-B₁₂-Aktivität von 0,5 mg/1, also insgesamt 2 g (ermittelt mit der E.coli-Mutante 113-3) werden mit 8 kg (o,2°/o) Natriumhydrogensulfit versetzt, bei p_H 6,5 auf 8o° erwärmt und 30 Minuten auf dieser Temperatur gehalten, dann gekühlt und zentrifugiert. Es werden 3 cbm Zentrifugat mit einer Vitamin-B₁₂-Aktivität von insgesamt 1,7 g erhalten. Man arbeitet dabei im Prinzip nach dem in der deutschen Patentschrift 922 126 näher beschriebenen Verfahren.

Das Zentrifugat wird mit Salzsäure auf p_H 2,5 eingestellt und zur Abtrennung der ausgeflockten eiweißartigen Substanzen unter Verwendung einer Schnellzentrifuge nochmals geklärt. In dem so erhaltenen Zentrifugat werden die Vitamine der B₁₂-Gruppe an 0,5 % Bentonit (z. B. »Frankinol KL«) adsorbiert. Nach Abtrennung des Bentonitadsorbates mittels einer Siebschleuder wird es mit einer wäßrigen Lösung von 2% Natriumhydrogencarbonat und 0,1% Natriumhydrogensulfit bei 50⁰ unter Rühren eluiert (p_H 8,5). Das Eluatvolumen trägt bei dreimaliger Elution 300 1 mit einer Vitamin-B₁₂-Aktivität von 5 mg/1, also insgesamt 1,5 g. Dieses Eluat wird durch Zusatz von Säure auf p_H 7 eingestellt und zur Adsorption der Vitamine der B₁₂-Gruppe mit 1 % Aktivkohle unter Rühren versetzt. Nach Abtrennung des Kohleadsorbates mittels einer Zentrifuge wird es mit einem Alkohol-Wasser-Gemisch in üblicher Weise eluiert. Es werden 50 1 Eluat mit einer Vitamin-B₁₂-Aktivität von 27 mg je 1, also insgesamt 1,35 g erhalten. Man arbeitet dabei im Prinzip nach dem in der deutschen Patentschrift 92g 987 näher beschriebenen Verfahren.

Das Eluat wird nun durch Vakuumverdampfung konzentriert. Man erhält dabei 10 1 Eluatkonzentrat mit einer Vitamin-B₁₂-Aktivität'von 135 mg/1, also insgesamt 1,35 g. Bis zu diesem Stadium der Verarbeitung ist demnach eine Konzentrierung der B₁₂-Aktivität auf das etwa 27ofache erreicht worden (von 40001 auf 101 unter Berücksichtigung der Verluste). In diesem Konzentrat liegen die Vitamine der B₁₂-Gruppe als Sulfitokomplexe vor. Zur Überführung der Sulfito-cobalamine in die Cyano-cobalatnkie wird das Konzentrat mit 10 g (0,1 */o) Kaliumcyanid versetzt und auf p_H 6,5 eingestellt. Die weitere Aufarbeitung des Konzen-

trates Ins zu den krist. Vitamin-B₁₂-Faktoren erfolgt in üblicher Weise.

Beispiel 2

4 cbm Faulschlamm werden in der gleichen Weise, wie im Beispiel 1 beschrieben, aufgearbeitet. Dabei erhält man 10 1 Konzentrat mit einer Vitamin-B₁₂-Aktivität von 140 mg/1, also insgesamt i,4 g. Die Vitamine der B₁₂-Gruppe liegen dabei als Sulfitokomplexe vor.

Das Konzentrat wird zur Stabilisierung der B₁₂-Vitamine mit 10 g (0,1 %>) Natriumhydrogensulfit versetzt. Zur weiteren Reinigung werden nun die Sulfito-cobalamine in ein organisches Medium, z. B. o-Dichlorbenzol + Phenol, übergeführt. Die organische Phase wird mit einer Pufferlösung gewaschen, worauf die Vitamine der B₁₂-Gruppe durch Zusatz von etwas Butanol aus der organischen Phase wieder in die wäßrige Phase über-

ao geführt werden. Die wäßrige Lösung wird sodann mit o-Dichlorbenzol nachgereinigt. Alle vier Stufen des Extraktionsprozesses werden in Extraktionszentrifugen durchgeführt. Man arbeitet im Prinzip nach den in der deutschen Patentschrift 932 982 und in der deutschen Patentanmeldung A 17151 IVa/3oh (Patent 940423) näher beschriebenen Verfahren, wobei aber die Vitamin-B₁₂-Faktoren in ihrer Sulfitoform vorliegen.
Das Volumen des wäßrigen Extraktes beträgt 101 mit einer Vitamin-B₁₂-Aktivität von 137 nag je 1, also insgesamt 1,37 g. Dieser Extrakt wird mit 100 g Kieselgur versetzt und auf p_H 2,5 eingestellt. Durch Einrühren von 220 g p-Chlorphenol werden die Vitamine der B₁₂-Gruppe an Kieselgur ausgefällt. Das mit dem Sulfito-cobalaminen beladene Kieselgurprodukt wird abgesaugt, zur Beseitigung von p-Chlorphenol mit Aceton gewaschen und schließlich getrocknet. Es werden etwa 100 g Kieselgurpräparat mit einer Vitamin-B₁₂-Aktivität von 13,5 mg je g, also insgesamt 1,35 g erhalten. Man arbeitet dabei im Prinzip nach dem in der Veröffentlichung von W. Friedrich und K. Bernhauer (Z. Naturforschg., 9b, S. 755 [1954]) beschriebenen Verfahren. Das Volumen ist nun von 4 cbm auf 100 g (rund 100 ecm) gesunken. Wenn man berücksichtigt, daß in 4 cbm Rohstoff 2 g B₁₂-Aktivität vorlagen und in 100 g Kieselgurprodukt eine B₁₂-Aktivität von 1,35 g vorhanden ist, so hat bis zu diesem Stadium der Verarbeitung unter Berücksichtigung der Verluste eine Konzentrierung der B₁₂-Aktivität auf das etwa 27 ooofache stattgefunden.

In dem in der geschilderten Weise gewonnenen Kieselgurprodukt liegen die Vitamine der B₁₂-

Gruppe als Sulfitokomplexe vor. Die Überführung der Sulfito-cobalamine in die Cyano-cobalamine erfolgt während der Chromatographie. Zur Füllung der Chromatographiersäule verwendet man Zellulosebrei, der mit Cyanidionen adsorptiv gesättigt ist. Als Entwickler dient wassergesättigtes n-Butanol mit 0,05 %> Blausäure. Man arbeitet dabei im Prinzip nach dem in der deutschen Patentschrift 930651 beschriebenen Verfahren. Bei der erwähnten Konzentration an Cyanidionen gehen während der Chromatographie die Sulfito-cobalamine in Cyano-cobalamine über. Die weitere Verarbeitung bis zu den kristallisierten Vitamin-B₁₂-Faktoren erfolgt in üblicher Weise.

Beispiel 3 Beispiel 4

Durch Züchtung von Streptomyces griseus gewinnt man in üblicher Weise 1 cbm einer Fermentationsbrühe, die eine Vitamin-B₁₂-Aktivität von 1,5 mg je 1 enthält. Diese Fermentationsbrühe wird mit 2 kg (0,2%) Natriumhydrogensulfit bei p_H 6,5 auf 8o° erwärmt und 30 Minuten auf dieser Temperatur gehalten. Dann wird gekühlt und zentrifugiert. Die abzentrifugierte Lösung, die unter Mitverwendung des Waschwassers 1000 1 beträgt, wird, wie im Beispiel 1 beschrieben, weiterbehandelt. Dadurch wird das Volumen beträchtlich vermindert und die relative B₁₂-Aktivität stark erhöht. Man erhält schließlich in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 3,5 1 Eluatkonzentrat mit einer Vitamin-B₁₂-Aktivität von 340 mg je 1, also insgesamt mit 1,2 g. Bis zu diesem Stadium der Verarbeitung ist demnach eine Verminderung des Volumens -auf den 270. Teil des ursprünglichen (von 1000 1 auf 3,5 1) und zugleich eine Konzentrierung der Vitamin-B₁₂-Aktivität unter Berücksichtigung der Verluste auf das etwa 225fache (von 1,5 mg je 1 auf 340 mg je 1) erfolgt. In diesem Konzentrat liegt das Vitamin B₁₂ als Sulfitokomplex vor. Zur Überführung des Sulfito-cobalamins in das Cyanocobalamin versetzt man das Konzentrat mit 3,5 g (0,1%) Kaliumcyanid und stellt den p_H-Wert auf 6,5 ein. Die weitere Verarbeitung der Lösung bis zu krist. Vitamin B₁₂ erfolgt in üblicher Weise.

Durch Gärung mittels Propionibacterium freudenreichii gewinnt man in üblicher Weise eine Fermentationsbrühe, die eine Vitamin-B₁₂-Aktivität von 1,9 mg je 1 enthält. Diese Gärbrühe wird zentrifugiert, wobei man 25 kg feuchte Bakterienmasse erhält, die praktisch die gesamte \^itamin-B₁₂-Aktivität, nämlich insgesamt 1,8 g, besitzt. Diese Bakterienmasse wird in 25 1 einer Mischung von Isopropanol — Wasser (im Verhältnis 1:1) suspendiert, mit 100 g Natriumsulfit versetzt und auf p_H 6,5 eingestellt. Die Suspension wird unter Rühren auf 60 bis 70⁰ etwa Va Stunde erhitzt und abgesaugt. Dieser Prozeß wird mit kleineren Mengen der gleichen Extraktionsflüssigkeit (Isopropanol— Wasser + Natriumsulfit) so oft wiederholt, bis die Extraktion der Vitamin-B₁₂-aktiven Substanz vollständig ist. Man erhält in dieser Weise 10 1 eines Extraktes, der durch Vakuumdestillation von Isopropanol befreit und dabei zugleich eingeengt wird. Man erhält so 4 1 eines wäßrigen Konzentrates mit einer Vitamin-B₁₂-Aktivität von 425 mg je 1, also insgesamt 1,7 g. Bis zu diesem Stadium der Verarbeitung ist eine Verminderung des Volumens auf 1/250 (von 1000 1 auf 4 1) bzw. unter Berücksichtigung der Verluste eine Konzentrierung der B₁₂-Aktivität auf das etwa 225fache

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(von i,9 mg je 1 auf 425 mg je 1) erfolgt. Die B₁₂-Vitamine liegen in diesem Konzentrat als SuI-fitokomplexe vor. Zur Überführung der Sulfitocobalamine in die Cyano-cobalamine wird das Konzentrat mit 4 g (0,1 °/o) Kaliumcyanid versetzt und auf Ph 6,5 eingestellt. Die weitere Verarbeitung des Konzentrates bis zu krist. Vitamin B₁₂ erfolgt in üblicher Weise.

Claims (3)

1. Patentansprüche:

   i. Verfahren zur Herstellung von Cyanocobalamin aus flüssigen Rohstoffen, wie Suspensionen oder Lösungen, die Stoffe der Cobalamingruppe enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß diese Rohstoffe in einem kombinierten Prozeß in der ersten Stufe mit Sulfitionen und in der zweiten Stufe — sobald durch die Reinigungsprozesse in Gegenwart von Sulfitionen der Gehalt an Vitaminen der B₁₂-Gruppe auf das ao mindestens 20ofache des ursprünglichen, bezogen auf das Volumen, angestiegen ist — mit Cyanidionen behandelt werden und daß schließlich das entstandene Cyano-cobalamin als solches in kristallisierter Form isoliert wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß die Umwandlung der SuI-fito-cobalamine in Cyano-cobalamine in einem Stadium der Verarbeitung vorgenommen wird, in dem der Gehalt an Sulfito-cobalaminen, bezogen auf Trockensubstanz, nicht weniger als ι g je kg beträgt.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die extraktive Reinigung der Cobalamine in ihrer Sulfitoform erfolgt und ihre Umwandlung in die Cyanoform während der Chromatographie in der Zellulosesäule vorgenommen wird.

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