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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Vitamin Bit und dem Vitamin B verwandten Substanzen durch Fermentation wässeriger Nährmedien mit Vitamin B12 produzierenden Mikroorganismen, welches auffallend erhöhte Ausbeuten an Vitamin B und diesem nahe verwandte Stoffe liefert.
Gemäss der vorliegenden Erfindung wird die Fermentation in Gegenwart von Substanzen mit einer zur Abgabe von Cyangruppen an die Mikroorganismen geeigneten chemischen Konstitution ausgeführt, wobei deren Konzentration im Bereiche von ungefähr 0, 1 bis 100 Teilen je Million Teilen Nährmedium so gewählt wird, dass eine erhöhte Bildung von Vitamin B12 und diesem nahe verwandten Substanzen erfolgt, ohne dass eine Verzögerung des Fermentationsvorganges eintritt.
Vorzugsweise wird ein ionisierbares Cyanid bzw. eine ionisierbare Cyanidverbindung verwendet, wobei der Cyanionen liefernde Stoff vorteilhafterweise in einer Konzentration im Bereich von etwa l bis 10 Teilen pro Million angewendet wird. Es kann aber auch eine Cyankomplexverbindung, z. B. Alkalimetallferro- oder Alkalimetallferricyanid verwendet werden.
Vitamin B12 ist ein Produkt, das LLD- (Lactobacillus lactis Dorner) und TPF (Tierproteinfactor)-Akti- vität besitzt, und insbesondere zur Behandlung der perniciösen Anämie, aber auch zur Förderung des Wachstums von Küken und Schweinen dient. Vitamin Bu wurde bisher nach dem von Rickes u. a. beschriebenen Verfahren (Science, 107 S. 296-297) aus Leber gewonnen. In einer späteren Veröffentlichung von Rickes u. a. (Science 108, S. 634-635) wurde beschrieben, dass Vitamin B, auch aus Fermentationsflüssigkeiten verschiedener Mikroorganismen erhalten werden kann, und dass das daraus isolierte kristalline Pro- dukt mit kristallinem Vitamin B. y das früher aus Leber gewonnen wurde, identisch ist.
Obwohl die chemische Struktur von Vitamin B12 noch nicht vollständig bekannt ist, wurde auch festgestellt, dass Vitamin Bu dite charakteristische Cyangruppe im Molekül enthält.
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sowie einer Anzahl verschiedener anderer Mikroorganismen sind bekannt. Bei diesen verschiedenen Fermentationsprozessen wurde gefunden, dass ausser Vitamin B12 Stoffe entstehen, welche eine der LLD und TPF ähnliche Aktivität aufweisen, welche sich aber von Vitamin B 12 durch das Fehlen der Cyangruppe unterscheiden. Diese Stoffe können durch Reaktion mit einer Substanz, die Cyanionen abzugeben vermag, in Vitamin B12 übergeführt werden.
Die Überführbarkeit dieser Stoffe in Vitamin B12 zeigt deren sehr nahe Verwandtschaft zu Vitamin B12 Vieles deutet darauf hin, dass diese dem Vitamin Ba verwandten Stoffe überwiegend aus einem Derivat des Vitamin B12 ohne Cyangruppe bestehen. Ein solches Derivat wurde durch Hydrierung von Vitamin B12 in Gegenwart eines Platinkatalysators hergestellt, siehe die Veröffentlichung von Kaczka et al.2J.A. C. S. 71, 1514, in der über die katalytische Reduktion von Vitamin B'be- richtet und das Erzeugnis als Vitamin baya identifiziert wird.
Wird nun gemäss der Erfindung die Fermentation mit verschiedenen, Vitamin B erzeugenden Mikroorganismen in Gegenwart einer geringen Menge eines Stoffes ausgeführt, der an die Mirkoorganismen Cyangruppen abzugeben vermag, kann eine erhebliche Ausbeutesteigerung an Vitamin B12 und Vitamin B12 verwandten Stoffen, die als Vitamin B", zu bezeichnen sind, erzielt werden. Es wird später eingehender beschrieben, wie der Fermentationsprozess in Gegenwart einer solchen Substanz ausgeführt werden kann, die für den Mikroorganismus eine unmittelbare Quelle von Cyanidionen darstellt, u. zw. entweder in Form eines in Lösung ionisierten Cyanids oder in Form eines Komplexes, aus dem der Mikroorganismus die Cyanidgruppe in verwertbarer Form freisetzen kann.
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Es ist bekannt, dass Cyanide als Inhibitoren von Enzymsystemen angewendet werden können und durch ihre Anwesenheit die Eigenschaften und Mengen der erhaltenen Fermentationsprodukte ändern. Bei dem Verfahren gemäss der Erfindung zur Gewinnung von Vitamin B12 und diesem verwandten Stoffen auf dem Wege der Fermentation hingegen sind die höheren Ausbeuten nicht auf irgendwelche Hemmwirkungen auf den Mikroorganismus oder die beteiligten Enzymsysteme zurückzuführen, sondern vielmehr auf eine spezifische Precursor-Wirkung, hervorgerufen durch die Gegenwart von Cyanidionen, die dem Mikroorganismus in der Nährlösung zur Verfugung stehen.
Ohne sich durch theoretische Erörterungen dieser Erscheinung festlegen zu wollen, soll doch auffolgende Beobachtung hingewiesen werden. Da die bei der Erzeugung von Vitamin B12 anfallenden Fermen- tationsbrühen häufig schwach reduzierend wirken, besteht die Möglichkeit, dass dem Vitamin B12 ver- wandte Stoffe, wenigstens teilweise, durch deren Reduktionswirkung auf das gerade von Mikroorganismen synthetisierte Vitamin B12 gebildet werden. BeiAnwesenheit von Cyanid in dem Medium wird dieses möglicherweise zum Teil direkt zur Einführung der Cyangruppe in die Vitamin B12 verwandten Stoffe und damit zur Umwandlung derselben in Vitamin B12 herangezogen.
Die Versuche zeigten jedoch, dass der erfindungsgemäss erzielbare Zuwachs an Vitamin B12 -Aktivität merklich grösser ist als der Zuwachs, der einer solchen Umwandlung allein zugerechnet werden kann. Die gemäss der Erfindung durch den Cyanidzusatz erreichte Erhöhung der Gesamtaktivität, d. h. der sowohl durch Vitamin 812 selbst wie durch die Vitamin B12 verwandten Stoffe bedingten Aktivität, ist jedenfalls ein deutlicher Hinweis auf die PrecursorWirkung des Cyanids, indem durch dessen Anwesenheit die Synthese des Vitamin B. durch die Mikroor- ganismen während der Fermentation angeregt wird.
Diese Wirkung des Cyanids beim erfindungsgemässen Verfahren ist im Hinblick auf das bisher über die Verwendung von Cyaniden in Fermentationsprozessen Bekannte überraschend. Es ergibt sich somit ein deutlicher Unterschied zwischen den bekannten Verfahren, bei denen durch Einwirkung von Cyanid auf ein Enzymsystem eine Ausbeuteerhöhung von Formentationsprodukten erzielt wurde, welche selbst keine Cyangruppen enthalten, und dem Verfahren der Erfindung, bei welchem die dem Medium zugesetzten Cyanionen bei der Biosynthese des Vitamin B mitverwendet werden können.
Gemäss der Erfindung können als ionisierbare Cyanide z. B. Blausäure, Ammoniumcyanid, Alkalioder Erdalkalicyanid angewendet werden, ausserdem wurde gefunden, dass gewisse Komplexverbindungen, wie z. B. Alkalimetallferrocyanide und-ferricyanidc eine ähnliche Precursor-Wirkung ausüben, offensichtlich zufolge der Freisetzung von Cyanidionen durch den Mikroorganismus.
Die zur Anregung der Bildung von Vitamin B oder diesem verwandten Stoffen dienende Cyanidionenmenge ist ausserordentlich klein ; eine so geringe Menge wie 0, 1 Teile pro Million an Cyanidionen zeigt einen deutlichen Zuwachs. Aber auch 50 - 100 Teile pro Million können verwendet werden. Eine höhere Zugabe sollte jedoch im allgemeinen vermieden werden, da freies Cyanidion Íf1 einer Menge von mehr als ungefähr 100 Teilen pro Million einen toxischen Effekt auf die verschiedenen Vita-
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Verzögerung des Wachstums beim Fermentationsvorgang und ein Abfallen der Vitamin -Bildung.
Komplexe wie Alkalimetallferro-und-ferricyanid liefern < eine freien Cyanidionen in der Lösung und können in grösseren Mengen ohne Gefahr einer Wachstumsverzögerung beim Verlauf des Fermentationsvorganges angewendet werden. Es scheint, dass die besten Ergebnisse dann erzielt werden, wenn die Cyanidionen liefernde Substanz im Fermentationsmedium in einer solchen Menge vorliegt, dass dem Organismus etwa 1-10 Teile pro Million anCyanidion zur Verfügung stehen. Vorzugsweise wird die Cyanidionen liefernde Substanz der Nährlösung zu Beginn der Fermentation zugegeben, indem entweder die Gesamtmenge vor Beginn der Fermentation zugefügt wird, oder Teile der Gesamtmenge zu Beginn und die restlichen Teile in Zeitabständen entsprechend dem Fortschreiten der Fermentation zugefügt werden.
Obwohl eine erhöhte Ausbeute an Vitamin B12 und diesem verwandten Stoffen auch dann erhalten wird, wenn die Cyanidionen liefernden Stoffe erst während der Fermentation zugegeben werden, so wurde doch gefunden, dass im allgemeinen in solchen Fällen die Ausbeuteerhöhung nicht so gross ist wie dann, wenn Cyanidionen schon bei Beginn der Fermentation vorhanden sind.
Die folgenden Beispiele zeigen, wie Fermentationsvorgänge gemäss der Erfindung ausgeführt werden können. Die Beispiele dienen jedoch lediglich dazu, die Erfindung zu erläutern und bedeuten keine Einschränkung dieser.
Beispiel l : In 250 cm3 Erlenmeyerkolben wurden je 40 cm3 eines Nährmediums, bcstehend aus 1% eines enzymatischen Casein-Verdauungsproduktes, 0, 3% Fleischextrakt, 0, 'f, Natriumchlorid, l0 Teile pro Million Kobaltnitrathexahydrat und destilliertem Wasser (PH = 7, 0) eingefüllt. Dann wurden 0, 0, 1, 1, 10,100, 1000 bzw. 5000 Teile pro Million Cyanidion in Form von Kaiziumcyanid zugegeben.
Die Medien wurden darauf im Autoklaven während 15 Minuten bei 1210 sterilisiert.
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In jedem Kolben wird dann 1 cm3 einer vegetativen 40 Stunden Kultur eines grisein-bildenden Stammes von Streptomyces-griseus, der in einem Nährmedium, das dieselben Bestandteile wie vorstehend beschrieben enthielt, gezüchtet worden war, zugegeben. Die Kolben wurden dann mit einem Wattebausch verschlossen, und auf einem Schüttler mit einer Amplitude von 3,6 cm bei 280 während 65 Stunden geschüttelt. Die dem Kolben entnommenen Proben wurden auf Wachstum untersucht, ihr PH wurde bestimmt, und sie wurden auf ihre Aktivität gegen L. lactis Dorner geprüft.
Hiebei wurden folgende Resultate festgestellt :
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<tb>
<tb> Teile <SEP> pro <SEP> Million <SEP> Wachstum <SEP> PH <SEP> Mittlere <SEP> Aktivität
<tb> CN <SEP> LLD/cm3
<tb> 5000-7, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 1000-7, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 100 <SEP> + <SEP> 7,9 <SEP> 1500
<tb> 10 <SEP> + <SEP> 8,6 <SEP> 6000
<tb> 1 <SEP> + <SEP> 8,6 <SEP> 5750
<tb> 0,1 <SEP> + <SEP> 8,6 <SEP> 6000
<tb> 0 <SEP> (Kontrolle) <SEP> + <SEP> 8,5 <SEP> 4950
<tb>
Die quantitative Bestimmung von Vitamin B12 und diesem verwandten Stoffen, ausgedrückt als Vitamin B12a, wurde papierchromatographisch vorgenommen. Eine Kontrollkultur und eine Kultur mit einem Teil CN- pro Million wurde wie folgt ausgewertet.
Jede Kultur wurde auf ein pi. von 2, 5 angesäuert, filtriert und neutralisiert. 10 cm3 des Filtrats wurden mit Kresol gesättigt und mit 2,5 cm3 Kohlenstofftetrachlorid-Kresol im Verhältnis 3 : 1 extrahiert. Auf die mit Kaliummonophosphat imprägnierten Papierstreifen wurde je 0, 1 cm3 des Extraktes in Tropfenform gebracht und drei Tage lang mit wassergesättigtem n-Butanol entwickelt. (Es wurde gefunden, dass sich bei dieser Arbeitsweise reines Vitamin à und Vitamin B12 in Flecken, 5 cm-17 cm von den Ausgangspunkten entfernt, ansammelte). Die Vitamin B12 enthaltenden Bereiche wurden dadurch ermittelt, dass einer der entwickelten Streifen auf eine Kulturplatte von L. lactis Dorner gelegt wurde.
Nach der Lokalisierung der Vitamin B12 - und Vitamin B12 Zonen auf denVersuchsstreifen wurden die aktiven Flächen mitWasser ausgelaugt und die Lösungen quantitativ auf ihren Vitamingehalt durch ein titrimetrisches Verfahren mit Hilfe von L. lactis Dorner untersucht. Dieses Verfahren ist in J. Biol. Chem., 180, 125 (1949) beschrieben. Die folgenden Ergebnisse wurden ermittelt :
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<tb>
<tb> Kultur <SEP> Millimikrcgramm <SEP> Vitamin <SEP> pro <SEP> cm3 <SEP> der <SEP> Kultur
<tb> B12 <SEP> Zone <SEP> (1) <SEP> B12a <SEP> Zone(2)
<tb> Kontrolle <SEP> 8,5 <SEP> 90
<tb> Zugabe <SEP> von <SEP> 1 <SEP> Teil <SEP> CN- <SEP> pro <SEP> Million <SEP> 36 <SEP> 178
<tb>
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Der Zuwachs an Vitamin B17 gegenüber dem Kontrollversuch war ungefähr vierfach, und der Zuwachs an Vitamin B-ähnlichen war ungefähr zweifach.
Beispiel 2 : In 5 1 fassende Cärgetässe aus Glas wurden je 3, 2 l eines Nährmediums, wie in Beispiel 1 beschrieben, eingebracht und während 45 Minuten bei 1200 im Autoklaven sterilisiert. Dann wurde mit einer vegetativen Kultur eines streptomycinbildenden Stammes von S. griseus, in einen Nährmedium, das dieselben Bestandteile wie in Beispiel 1 beschrieben, enthielt, beimpft. Drei Versuchsgrup- pen wurden mit Kaliumcyanid wie folgt behandelt :
1. 1 Teil Cyanidionen pro Million wurde nach dem Sterilisieren zugegeben,
2.5 Teile Cyanidionen pro Million wurden nach 48 Stunden Fermentation zugegeben und
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Der Inhalt dei Gärgefässe wurde belüftet und bei 270 während 110 Stunden in Bewegung gehalten.
Am Ende der Fermentationsperiode wurde der Inhalt der Gärbehälter einer chemischen Untersuchung auf Vitamin B12 und diesem verwandte Stoffe unterzogen, die folgende Schritte umfasste : Adsorption an Aktivkohle, Auswaschen mit Butanolwasser, Extraktion mit Benzylalkohol, Adsorption an Tonerde und Auswaschen mit Methanol. In der Methanollösung wurden Vitamin B12 und diesem. ähnliche Stoffe durch Vergleich der optischen Dichte bei 5500 Ä (einem charakteristischen Absorptionsmaximum des Vita- min B12) mit der von reinem Vitamin B12 quantitativ bestimmt.
Die Untersuchungsergebnisse waren unter Berücksichtigung der Annahme, dass jegliche Färbung auf Vitamin B12 zurückzuführen ist, die folgenden :
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<tb>
<tb> Kultur <SEP> Gesamtfärbung <SEP> berechnet <SEP> als
<tb> Vitamin <SEP> B <SEP> mg/1000 <SEP> 1 <SEP>
<tb> Kontrolle <SEP> 33,8
<tb> 1 <SEP> Teil <SEP> pro <SEP> Million <SEP> CN
<tb> (zugegeben <SEP> bei <SEP> Beginn) <SEP> 54, <SEP> 16
<tb> 5 <SEP> Teile <SEP> pro <SEP> Million <SEP> CN
<tb> zugegeben <SEP> nach <SEP> 48 <SEP> Stunden <SEP> 50, <SEP> 2 <SEP>
<tb> 1 <SEP> Teil <SEP> pro <SEP> Million <SEP> CN
<tb> zugegeben <SEP> bei <SEP> Beginn, <SEP> nach
<tb> 24,48, <SEP> 72 <SEP> und <SEP> 96 <SEP> Stunden <SEP> 54, <SEP> 7 <SEP>
<tb>
Eine beachtliche Ausbeutesteigerung wurde also bei allen Ausführungsweisen der Zugabe von Kaliumcyanid gefunden.
Beispiel 3 : In zwei 567,75 1 fassenden Behältern aus rostfreiem Stahl wurden je 478, 7 1 eines Nährmediums eingebracht, das 1% enzymatisches Casein-Verdauungsprodukt, 0,9% Fleischextrakt, 0, 5% Natriumchlorid und 0,3go Sojabohnenöl, 10 Teile pro Million Kobaltnitrathexahydrat und Leitungswasser enthielt. Die Medien wurden dann durch Erhitzen auf 1200 während 30 Minuten sterilisiert. Zu dem einen Gärbehälter wurde Kaliumcyanid in einer 1 Teil Cyanidionen pro Million entsprechenden Menge zugegeben. Die Gärbehälter wurden dann mit einer vegetativen Kultur eines griseinbildenden Stammes von S. griseus beimpft, die in einem Medium gezüchtet wurde, das dieselben Bestandteile wie oben beschrieben, mit Ausnahme von Sojabohnenöl enthielt.
Die Inhalte der Gärbehälter wurden belüftet und während 132 Stunden unter Rühren auf 270 in Bewegung gehalten.
Am Ende des Fermentationsvorganges wurde der Inhalt der Gärbehälter, wie in Beispiel 2 beschrieben, auf Vitamin B12 und diesem verwandte Stoffe untersucht, wobei folgende Ergebnisse erhalten wurden :
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<tb>
<tb> Kultur <SEP> Gesamtfärbung <SEP> berechnet <SEP> als
<tb> Vitamin <SEP> B <SEP> mg/1000 <SEP> ! <SEP>
<tb> Kontrolle <SEP> 109, <SEP> 6
<tb> Zusatz <SEP> von <SEP> 1 <SEP> Teil <SEP> CM <SEP> pro <SEP> Million <SEP> 182, <SEP> 8
<tb>
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4 : Ein Medium, das 1extrakt, 0, fP/o Natriumchlorid und 10 Teile pro Million Kobalt (II) nitrat-hexahydrat enthielt, wurde in Mengen von je 50 cm3 in 2-50 cm3 Kolben abgefüllt und nach Zugabe von 0,5% Sojabohnenöl im Autoklaven während 15 Minuten bei 1210 sterilisiert.
Wässerlge Kaliumcyanid- und Calciumcyanidlösungen wurden durch Filtration über ein ultrafeines Glassinterfilter sterilisiert, Kaliumferricyanid- und Kaliumferrocyanidlösungen wurden im Autoklaven sterilisiert. Die sterilen Lösungen wurden aseptisch den Kolben mit dem sterilen Kulturmedium in solchen Mengen zugegeben, dass 1 y Cyanidionen pro cm3 des Mediums im Falle der Anwendung der Kalium- und Calciumsalze und 1 y Gesamtcyan pro cm3 im Falle der Anwendung der Komplexsalze vorlagen. In eine weitere Flasche wurde Kaliumferricyanid in einer Menge zugegeben, die 10 y Gesamtcyan pro cm3 entsprach.
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Alle Nährmedien einschliesslich eines Kontrollmediums, dem kein Cyanidsalz zugefügt war, wurden mit 1 cm3 einer vegetativen Kultur eines streptomycinbildenden Stammes von S. griseus beimpft.
Eine zweite Reihe von Nährmedien mit 10 y pro cm3 in Form von Kaliumferricyanid und eine Kontrolle ohne Zusatz vonCyanid wurde mit einer vegetativen Kultur eines neomycinbildenden Stammes von S. griseus fradias beimpft.
Alle Kolben wurden bei 280 auf einem Drehschüttler bebrütet. Nach viertägiger Brutdauer wurden die Kulturen zur Freisetzung der LLD-aktiven Stoffe vom Unlöslichen während 15 Minuten bei 121 im Autoklaven behandelt. Auf die mit Monokaliumphosphat imprägnierten Papierstreifen wurden abgemessene Mengen der überstehenden Kulturflüssigkeit in Tropfenform gebracht. Dann wurden die Chromatogramme mit wassergesättigtem n-Butanol in einer Atmosphäre, die mit diesem Lösungsmittel bei Raumtemperatur gesättigt war, im Laufe von drei Tagen entwickelt. Die für Vitamin B charakteristische aktive Zone, die sich auf den Chromatogrammen bildete, wurde mikrobiologisch lokalisiert und mit Wasser ausgelaugt.
Zur Bestimmung der Menge des in den Kulturbrühen enthaltenen Vitamin B. wurde eine quantitative mikrobiologische Untersuchung vorgenommen. Die Ergebnisse waren die folgenden :
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<tb>
<tb> Kultur <SEP> Zusatz <SEP> zum <SEP> Nährmedium <SEP> Vitamin <SEP> B-Gehalt <SEP> der <SEP> Kultur
<tb> (Millimikrogramm <SEP> pro <SEP> cm3)
<tb> S. <SEP> griseus <SEP> kein <SEP> Zusatz <SEP> 12
<tb> u <SEP> 1 <SEP> y/cm3 <SEP> CN- <SEP> als <SEP> KCN <SEP> 110
<tb> 1γ/cm3 <SEP> CN- <SEP> als <SEP> Ca(CN)2 <SEP> 17
<tb> l <SEP> Y/cm3 <SEP> CN-als <SEP> K <SEP> e <SEP> (CN) <SEP> g <SEP> 23
<tb> 1γ/cm3CN- <SEP> als <SEP> K3Fe(CN)6 <SEP> 51
<tb> 10 <SEP> γ/cm3CN- <SEP> als <SEP> K3Fe(CN)6 <SEP> 96
<tb> S. <SEP> fradiae <SEP> kein <SEP> Zusatz <SEP> 43
<tb> 10 <SEP> γ
/cm3CN- <SEP> als <SEP> K3Fe(CN)6 <SEP> 64
<tb>
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10 Teile pro Million Kobaltnitrathexahydrat enthielt. Die Kolben wurden im Autoklaven während 20 Minuten bei 1200 sterilisiert. Eine wässerige Kaliumcyanidlösung wurde durch Filtration durch ein ultrafeines Glassinterfilter aseptisch zu jeder Flasche zugegeben. Alle Kolben wurden mit je 1 cm3 einer 24-stündigen Submonkultur von aus Kuhmageninhalt isoliertem Alkaligenes faecalis in einem Medium, das dieselben Bestandteil2 wie oben beschrieben, enthielt, beimpft. Die Kulturen wurden bei 280 auf einer Schüttelmaschine mit 3,6 crr. Amplitude während drei Tagen bei 280 bebrütet und dann im Autoklaven bei 1200 während 15 Minuten behandelt, um die Gesamtmenge an LLD-akdvcn Substanzen freizusetzen.
Dann wurde mit L. lactis Dorner als Testorganismus und Vitamin B12 als Standard auf LLD-Aktivität untersucht. Proben wurden zur Entfernung von Zellteilen zentrifugiert und 10 cm3 der überstehenden Flüssigkeit mit 2,5 cm3 Kresol-Kohlenstofftetrachlorid, wie in Beispiel 1 beschrieben, extrahiert, wonach 0, 04 cms des Extraktes auf einen mit Monokaliumphosphat imprägnierten Papierstreifen gebracht und während drei Tagen mit wassergesättigtem n-Butanol entwickelt wurden. Die für Vitamin B12 charakteristische LLD-aktive Zone wurde lokalisiert und zur quantitativen Untersuchung mit Wasser ausgelaugt, Alkaligenes faecalis zeichnet sich aus durch die Bildung grosser Mengen LLD-aktiver Substanzen, die chemisch dem Vitamin B. nicht gleich zu sein scheinen.
In Gegenwart von Kaliumcyanid wurde Vitamin B12 gebildet, wie sich im Papierstreifenchromatogramm zeigte.
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<tb>
<tb>
Menge <SEP> des <SEP> zugefügten <SEP> KCN <SEP> L. <SEP> lactis <SEP> Test <SEP> Einheiten <SEP> pro <SEP> cm3 <SEP> Kultur
<tb> Vor <SEP> der <SEP> Inokulation <SEP> Nach <SEP> der <SEP> Inokulation <SEP> LLD-Aktivität <SEP> LLD-Einheiten <SEP> aus <SEP> der <SEP>
<tb> der <SEP> Kultur <SEP> B <SEP> Papierstreifenzone <SEP>
<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> 4, <SEP> 800 <SEP> < <SEP> 630
<tb> 8 <SEP> Teile <SEP> pro <SEP> Million <SEP> 0 <SEP> 12, <SEP> 400 <SEP> 875
<tb> 8 <SEP> Teile <SEP> pro <SEP> Million <SEP> 8 <SEP> Teile <SEP> pro <SEP> Million <SEP> 32, <SEP> 400 <SEP> 1800
<tb>
Reines Vitamin B.
entspricht 11000 LLD-Einheiten pro y. Bei dem vorstehenden Versuch wurden also aus Kulturen in einem Medium, das mit 8 Teilen KCN pro Million vor derBeeimpfung versehen worden war, 0, 079 y Vitamin Be pro cm3 der Kultur abgetrennt ; und aus Kulturen, die einen weiteren Zusatz von 8 Teilen KCN pro Million 24 Stunden nach Beginn der Bebrütung erhalten hatten, wurden 0, 064 γVitamin Bu pro cm3 Kultur abgetrennt.
Beispiel 6 : Ein Nährmedium, das 4% lösliche Trockensubstanz der bei der Branntweincrzeugung anfallenden Schlempe und 10 Teile Kobaltnitrathexahydrat pro Million in Wasser enthielt, wurde in Mengen von je 0 cm3 in 250 cm3-Kolben abgefüllt. Hierauf wurde Kaliumcyanid in Mengen zugegeben, die 0, 1 bzw. 1, 0 und 10 Teilen CN- pro Million entsprachen. Die Kolben wurden mit Wattebauschen verschlossen und im Autoklaven während 15 Minuten bei 1210 sterilisiert.
Eine vegetative Kultur eines Vitamin Bs2 produzierenden Mikroorganismus wurde hergestellt, indem man in einem Nährmedium aus Fleischextrakt und enzymatischem Caseinhydrolysat einen nicht identifizierten Streptomycetenstamm, der aus einer Probe zersetzter Scheunenstreu isoliert wurde, kultivierte.
Die sterilen Nährmedien wurden mit 1 cm3 der oben beschriebenen Kultur beimpft und auf einem Schüttler während vier Tagen bei 280 bebrütet. Am Ende der Fermentation wurde die gesamte LLD-Ak-
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B12belle festgehalten :
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<tb>
<tb> Zusatz <SEP> zum <SEP> Medium <SEP> L. <SEP> lactis <SEP> Test <SEP> Einheiten <SEP> pro <SEP> cm3 <SEP> Kultur
<tb> LLD-Aktivität <SEP> der <SEP> Kultur <SEP> Einheiten <SEP> von <SEP> B12 <SEP> und <SEP> B <SEP>
<tb> 12 <SEP> 12
<tb> ähnlichen <SEP> Stoffen
<tb> kein <SEP> Zusatz <SEP> 23,800 <SEP> 14,800
<tb> 0, <SEP> Teile <SEP> CNY- <SEP> pro <SEP>
<tb> Million <SEP> 27,600 <SEP> 17, <SEP> 000
<tb> 1, <SEP> 0 <SEP> Teile <SEP> CN- <SEP> pro
<tb> Million <SEP> 37, <SEP> 200 <SEP> 21, <SEP> 300
<tb> 10 <SEP> Teile <SEP> CN- <SEP> pro <SEP>
<tb> Million <SEP> 30, <SEP> 500 <SEP> 27,
<SEP> 000 <SEP>
<tb>
Es lassen sich natürlich mannigfache Änderungen und Abwandlungen der vorstehend beschriebenen Massnahmen vornehmen, ohne dass dadurch der Schutzbereich der vorliegenden Erfindung überschritten wird.
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