DE1792524A1 - Verfahren zum Gewinnen eines Antibioticums - Google Patents

Description

Verfahren zum Gewinnen eines Antibiotioums

Pas Antibioticum 833A ist ein neues und wertvolles Antibioticum, das sich beim Wachstum eines früher unbekannten Stammes von Mikroorganismen unter gesteuerten Bedingungen bildet und durch aerobe Fermentation geeigneter wässriger Nährmedien hergestellt wird. TTn das Antibioticum in gereinigter ?orm zu erhalten, müssen die Fermentations*lüeeigkeit'und die rohen Lösungen des Antibioticum« behandelt werden. Das Antibioticum 833A ist ein hoohgradig polarer Stoff, was sich daraus ergibt, dass es von Aktivkohle aus wässrigen lösungen bei einem pH-Wert von 5 nahezu überhaupt nicht adsorbiert wird. Es wird auch nicht an sauren Tonen adsorbiert und lässt sich oelbst in Gegenwart organischer Amine nicht leicht mit polaren lösungsmitteln, wie Phenol, extrahieren. Die Er-

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findung bezieht sich auf Verfahren zum Gewinnen des gereinigten Antibioticuma 833A durch Chromatographieren der ferraentationsflüssigkeit oder der rohen Lösung des Antibioticum* an Ionenau8tau8chharsen.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Gewinnen des neuen Antibioticum 833A, dessen chemische Bezeichnung l-cis-i^-Epoxy-i-propylphosphonsäure ist, aus seinen wässrigen Lösungen durch Chromatographieren der Peraentationeflüesigkeit» in der das Antibioticum erzeugt worden ist» oder einer teilweise gereinigten Lösung des Antibioticuas an einem Anionen* oder- Kationenaustauschharz und anechlieseendes Eluieren des Harzadoorbats mit Wasser oder einer wässrigen oder wässrig-alkoholischen Salzlösung. Dan Antibioticum 833A hemat in äueseret wirksamer Weise das Wachotun verschiedener

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graa-negativer und gram-positiver Mikroorganismen.

Dae Antibioticum 833A ist ein wasserlöslicher, saurer Stoff» der mit anorganischen und organischen Basen Salze bildet, Bs wurde gefunden, dass das Antibioticum 833A durch Cbroaatographieren des unreinen Antibioticum in fora der rohen Fermentationsflüssigkeit oder in teilweise gereinigtem Zustande» wie in Form seines Natrium- oder Kaliumsalzes» an einem Ionenaustauschharz und ansohliessendes Eluieren des gereinigten Materials mit einem geeigneten Eluierungßmittel, wie

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wässrigen oder wässrig-alkoholischen Lösungen von Natriumchlorid, Kaliumchlorid, AnsEoniuffichlorid, Irio-ChydroxyraethylJ-aainoiBetliar.-hydrochloriö und dergleichen, unter Daständen auch durch Eluieron »it Vaesor, gereinigt werden kann, für diese Reinigung eignen sich sowohl Anionen- als auch Kationenauatauschharae. Wenn ein ^ionenaustauschharz verwendet wird, kann man zwar auch ein schwach basisches Harz verwenden; vorzugsweise verwendet man jedoch ein stark hasisches Hare. Wenn ein Kationenaustauschharz verwendet wird, verwendet man vorzugsweise «in stark saures Harz. Im allgemeinen verwendet man als basisches Anionenaustauschharz ein Harz mit q.usrtären AaiBoniuoaustauechgruppen, die an ein Polystyrol-divinylbenzol-Grerüst gebunden sind ("Dowex 1 χ 2") in der Chloridfοπή, es können jedoch auch Harze, bei denen PoIyalkylawinogruppen an ein Polyetyrol-divinylbenzol-Gerüst gebunden sind, sowie vernetzte Acrylharze verwendet werden· Als seurec Eationenaustauschhars wird in allgemeinen ein SuIfonathars fflit*einen Polystyrol-divinylbenzol-Gerüst ("Dowex 50 χ 2^M) in der Wasserstoffionenfora verwendet.

Das bevorzugte Verfahren zu» Gewinnen des reinen Antibioticuas besteht darin, dass man eine Löaiuig des Antibioticum, wie eine SerEJcrrtationsilttssigkeit, deren pH-Wert mit einer wöss- ' ricen 3aos, wie NEcriuiahydroxid oder AmmoniutDhydroxid, auf 7 oingesteilt »'orden iot, durch eine Kolonne leitet, die ein

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quartäres AimBonium-Anionenauetauschhars enthält* Obwohl der pH-Vfert der PertuentationsflUssigkeit i» allgeseinea auf 7 eingestellt wird, kann man die rohe Persrentationsfltisaigkeit auch unmittelbar verwenden, ohne ihren gH-Wert eimustellen. la allgemeinen wird die Kolonne ait Wasser gewaschen, ua restliche Fermentationsfltisßigkeit daraus au entfernen. Das so erhaltene Hera&deorbat wird dann mit einer alkoholischen

Salzlösung, wie 3 $iger Ammoniumchloridlösung in 90 #igem Methanol, eluiert. Die Eluate werden in Fraktionen aufgefangen» deren Grüese sich nach der ßröese der verwendeten Kolonne richtet. Die biologische Aktivität der Eluate wird durch Analyse nach einer genormten Methode unter Verwendung von Proteus vulgaris als Analysenorganismus bestimmst. Die Fraktionen, die die grössten Mengen an aktives Material enthalten, werden dann durch Abtreiben des gegebenenfalls' vorhandenen organischen Lösungsmittels, gewöhnlich im Vakuum, ein- W geengt, und das Konsentrat wird mit V/eseor verdünnt. Die Aktivität des Konzentrats wird dann nach der genormten Analysen« methode bestimmt.

Das so erhaltene Antibiotioua Θ33Α kann weiter gereinigt werden, indem man die vereinigten konzentrierte» aktiven Fraktionen durch ein gelförmiges Filtriorhere, wie Polyacrylasnidgel, leitet. Im allgemeinen verwandet »an hierfUr ein Gel nit Korngrössen von 0,15 bits 0,3 am, dao die fraktionierung, Bnt-

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ealsung und Konsentrierung von Stoffen nit Molekulargevrichten von 200 bis 2000 ermöglicht und unter der Beseiohnung "Bio-Gel £»2" von den Bio Rad laboratories, Richmond, California, Y₀St.Α.» erhältlich ist; jedoch könnon auch Gele mil; Korngröosen von 0.074 Me O₁3 mai verwendet werden. Die KorngrößBo ist kein begrenzender Paktor, und die jeweils au verwendende Korngrösse richtet sich nach der Grosse der | verwendeten Kolonne. Sie Eluate v/erden dann in Fraktionen aufgefangen, die Fraktionen werden analysiert) und die aktivsten Fraktionen werden vereinigt.

Eine weitere Reinigung des so erhaltenen Antibioticum kann erfolgen, indea man die mittels des Polyacrylamldgels erhaltenen Fraktionen konzentriert und die Konzentrate durch eine Kolonne leitet, die ein stark saures Kationenaustausohharz in der Wasserstoffionenfore enthält, bei dem SuIfonsäuregruppen an ein Polystyrol-divinylTDenzol-Gerüet gebunden sind. Das so erhaltene Harzadsorbat wird dann mit Wasser entwickelt und das Bluat in Fraktionen aufgefangen. Der pH-Wert der alctivßten Fraktionen wird dann ait einer Baee gesondert auf 7 cingeateJlt, Zur Titration können anorganische Basen» wie NatriuKhydT?o3i 1 und Kaliumhydroxid, oder organische Basen, wie Pyridin und Triäthylamin, vorwendet werden. Nach der Analyse ge.-kias den genormten Analysenverfahren werden die aktivsten Fiktionen vereinigt, so dass man eine wässrige Iö-

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sling dee Antibioticum a 833A erhält. Wenn das Antibioticum in fester Form hergestellt «erden eoll, kann san die wässrige Lösung einengen und gefriertrocknen. Das so erhaltene getrocknete Antibioticum kann dann verwendet werden» um ßie Verteilung der Empfindlicakeit ia bakteriellen Spektrum au bestimmen, um Gross-Resistensanalysen durchzuführen, eowie auch um die Wirksamkeit des Antibioticum in vivo au ermitteln.

Das nach äem obigen Verfahren erhaltene SaIs kann noch weiter durch Chromatographie in einer Kolonne gereinigt werden, die ein An ionenaustauschharz enthält, bei des quartär© Am-BonixiiB-Aiistausohgruppen an ein Polyetyrol-diTinylbenzol-öerüet gsOimae» Bind ("Dovex 1 χ 2^H), und das sich in der Ghloxinform befindet. Die öröase der Kolonne richtet sich nach d?r Menge des zu chrowatographierendan Materials. PUr oiäß Probe von 36 zog genügt ia allgemeinen eine Kolonne von 84 om Höhe imd 1,5 cm Burchmeoser. Ib allgeiaeinen verwendet loan ein Hara Bit. KornfriJeeen von;O»15, bifl'0,3 »tf? Jedoch können auöh Harze mit Kc>*ngräBsen τόη 0,038-He 0,3 a» Verwendet werden. Wem?, man nach die sein Reinigungsverfahren arbeitet, wird das Ears aunächst ait einer verdünnte» wässrigen Salsslöaung, wie !fatriuiaahlorid*·, Kaliumchlorid- oder AaoBoniuaoiu.orid3.3sung oder Lösungea von Saleen organischer-Basen, wie oder !Srio-ChydroxjnBethyD-ajBixioBeöjan, gewaschen, uia ■.■>

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das Harz ins Gleichgewicht zu bringen. Dann wird dae Salz dee Antibioticum 833A in der verdünnten wässrigen Salzlösung gelöst und die Lösung auf das Harz gegossen. Die Kolonne wird dann ait, der zur CHeicbgewichtseinstellung verwendetan lösung entwickelt und das Eluat in Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen werden auf den allgemeinen Bereich der biologischen Aktivität analysiert und die aktiven Fraktionen vereinigt und konzentriert. Das Konzentrat wird sodann durch •ein galfErmigso Filtrationeharz, wie Polyaerylazaidgel ("Bio-Gel P-2'^:), p-irkoliert. um das Antibioticum τοη dens SalE zu trennen. iJic Grosse der hierfür verwendeten Kolonne richtet sich nach der Msnge des zu chromatographierenden Materials. Die aufgefangenen Fraktionen werden mit Hilfe von Proteus nVisarü s IC3-838 analysiert, um ihre biologische Aktivität zu bectinrnsr». Die aktiven Fraktionen warden vereinigt, konzentriert und gefriergetrocknet.

Wonn Elan bei deic oben boeohriebenen Verfahren anstelle von beispielsweise, verdünnter Kochsalzlösung eine Lösung von Tris-(hyörozy3ie1.-hyl)-a!Binonethan-hydroohlorid verwendet, um dar? Ke.vs r.ueauw£\schon und ins Gleichgewicht eu bringen, kami als Eluicx-urigfiaiittel einen an Chlorionen 0,1-molaren {hjävQTyKGiiayl )_raainoEiethan-hydroohlorid-Pufter mit einem pH-Vcrt. von 8,0 v_erwenden. In dieses Fall· wird das Salt See Aatifeif-sicuma 333A, z.B. das Hatriunealz, in der Puf-

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ferlösung gelöst und diese Lösung dann (lurch die Harakolonna geleitet. Me Kolonne wird ait dem gleichen Puffer entwikkelt imd das Bluat in mehreren Fraktionen aufgefangen. Sie Fraktionen worden mit Hilfe von Proteus vulgaris KB-838 analysiert, um ihre "biologische Aktivität su bestimmen, und die aktiven Fraktionen werden vereinigt, konsentriert und getrocknet, Der getrocknete Rückstand wird dann in Wasser gelöst und die wässrige Lösung durch ein gelförraiges liltrationshars, wie Polyacrylamidgel ("Bio-Gel Ρ~2^Μ)? perkoliert, um das Antibioticum von dem Puffer zu trennen. Die zufolge der Analyse Kit Proteus vulgariß MB-838 aktiven Fraktionen werden vereinigt und konzentriert, und das Konzentrat wird gefriergetrocknet.

Das so erhaltene Tris~(hydro£ymethyl)"aminomethansals des Antibioticum 853A kann weiter durch Chromatographie in einer Kolonne mit ©!new stark sauren Kationenaustauschharz gereinigt werden, bei dea kernständige Smlfonsäure-Austauschgruppen an ein Polyßt2rrol-di\rinyl> >ensol»ßerüst gebunden sind ("33OWQX 50")» und das sich in der Hatriumforni befindet, um die 'üris-ChydroxFinethyD-aiQinoJEethangruppen durch Natriumionen su ersei'Ken. Als Lösungsmittel für das Tris~(hydroxymethyl)-aiBino!i3©thani3alz dient im allgemeinen Wasser, und der Ablauf aus der Kolonne, der das Natriumsalz des Antibioticum 833A enthält, wird analysiert und gefriergetrocknet, um das

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feste Natriurasals au gewinnen« Das obige Verfahren kann auch angewandt worden, um anders Seine des Antibioticuius 833A als das Hatriumsals au erhalten, in welchem falls man ein Kationenaustausehhars Kit dem entsprechenden Kation verwendet*

Die als Ausgangsmaterial für die hier beschriebenen Reinigungsverfahren verwendeten Fermentationsflüoeigkeiten des Antibioticums 833A haben Aktivitäten von etwa 1 Mo 10 Einhei- ™ ten j© ml, wenn oie nach der genormten Analyseninethode unter Verwendung von Proteus vulgaris als Analyacnorganismus untersucht werden.

Das Antibioticum 833A wird sweolcmäesig nach ainer ScheibenplattQnaiethode unter Ysrwondung von Proteus vulgaris MB-838 (AICC 21100 und NERI B-3361) als TestOrganismus analysiert, Die Testkultur wird als Schrägröhrchenkultur auf einem Nährmedium gehalten, das aus Agar (Bifco) und 0,2 9έ Hefeextrakt | (Difoo) besteht. Dia beimpften Schrägröhrchen werden 18 bis 24 Stunden bei 37° C babrütet und eine Woche bei Kühlschranktemperaturen gelagert. Jede Woche werden frische Schrägröhrchen hergestellt.

Das Impfgut für die Analysonplatten wird täglich frisch hergestellt, indem man einen 250 ml-Erleiimeyerkolben, der 50 ml NähraeäiuBi (Difco) ■>.· 0,2 96 Hefoextrakt (Difco) enthält, mit

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einer von dem Schrägröhrchem abgeschabten Probe beimpft „ 33er Kolben wird dann 18 bis 24 Stunden in einer Schüttelmascliiao bei 37° C bebrütet. Dann wird die Kultur durch Zusatz von 0,2 $> H©feexbraktlösung auf 40 #ige Idchtdurehlässigkeit für eine Wellenlänge von 660 πιμ unter Verwendung dee "Spectronie 20"-Gerätes von Bausch & "homb eingestellt. Als ieerprobe wird für dieae Bestimmung nicht-beispfte Feraientationoflüssigkeit verwendet. 30 al der so eingestellten Fermentationcflussigkeit werden verwendet, um 1 1 Medium bu beimpfen.

Als Analysenmedium dient Nähragar (Difco) + 0,2 $> Hefeextrakt (Difoo), Dieses Medium wird hergestellt, durch Autoklavbehandlung sterilisiert und auf 50° C erkalten gelassen· Nach dem Beimpfen des Mediums gibt man 10 ml in sterile Petrischalen ein und lässt das Medium darin erstarren.

Die Aktivität wird in Einheiten ausgedrückt, wobei eine Einheit als diejenige Konzentration des Antibiotiouas 833A je ml definiert ist, die auf einer 12,7 mm-Papiersclieibe ein© Zone von 28 mm Durchmesser erzeugt. Zur Cfowinnung der Standardkurve verwendet man vier Konzentrationen dee Antibioticums 833A, nämlich 0,3, 0,4, 0,6 und 0,8 Einheiten je ml. Jede dieser Konzentrationen wird durch Verdünnen mit auf einen pH-Wert von 8,0 eingestelltem Tris-(hydroaiyiiiethyl)-aminomethan-Puffer erhalten_o Zur Hörαteilung der Standardku^-

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ro werden auf fünf Platten 3s viel? Scheiben gelegt, so dass oiQh auf jeder Platte für jede der Tier Konsentrationen C.ee Asrsibiotieuiae eine Scheibe befindete Die Platten werden IS Stunden bei 37° C bebrütet, worauf die Durchmesser der Eeaansungssonen in mia gemessen werden. Für ;Jede Konzentration wird ein mittlorer Zonsndurchaesoer berechnet, und aus diesen Werten wird auf halblogarithmisohes Diagransmpapier sine S-bandardkuroe aufgetragen» Die Steigimg der so erhaltenen ΊΔτά.^ 7..±oq± zvfisehen 4 und 5 ο

Bi? 3ii analysierenden Proben des Axiti"biotie\v33- 833A werden mit O_s05~a3olareia Puffer vom pH-Wort 8,0 auf die entsprechende Konaentration verdünnt. Scheiben werden in die Testlösung eingetaucht und dann auf die AnalyxenpXatte gelegt. Für jede Probe legt man normalerweise swei Scheiben auf eine Platte derart, dass die beiden Scheiben einander gegenüberliegen, AkweehsQlnd mit der Probe werden zwei weitere Scheiben auf dis Platte gelegt, die in eine Losimg des Antibioticums 833A IEi""- einer Aktivität von 0,4 Einheiton je ml getaucht worden sind. Tie Platten werden 18 Stunden bei 37° C bebrütet und üio Zonendurohmeasar in mm bestimmt» Bis Stärke der Probe v/^'d durch ein Nomogramm oder τοη der Standardkurve bectiramt.

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Wenn die abgeänderte Analysenmethode unter Verwendung von Proteus vulgaris als Analysenorganismue angewandt wird, vorwendet man 5 ml beimpftes Modium in dor Patrischaie, und aas zu analysierende Antibioticum wird auf eine Papierscheibe mit 12,7 mm Durchmesser aufgebracht· Die Schale mit den Probescheiben wird dann 18 Stunden bei 37° 0 bebrütet, worauf die Hemmungszonen gemessen werden. Die Stärke wird als diejenige Menge Feststoff je ml ausgedrückt, die unter diesen Umständen eine Heramungszone von 25 mm erzeugt.

Das Antibioticum 833A wird durch aerobe Fermentation von geeigneten wässrigen Nährmedien unter gesteuerten Bedingungen durch Stämme von Streptomyces fradiae hergestellt, die Antibioticum 833A erzeugen. Zur Herstellung des Antibiotikums 833A sind die gleichen wässrigen Medien geeignet, dio auch zur Herstellung anderer Antibiotica verwendet werden. Solche Hedien enthalten durch den Mikroorganismus assimilierbare Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff sowie anorganicche Salze. Ausserdem enthalten die Fermentationemedien Spurenmetalle, die für das Wachstum des Organismus notwendig sind und gewöhnlich als Verunreinigungen in anderen Bestandteilen enthalten sind, die dem Medium zugesetzt werden. Die genaue Menge der Kohlehydratquelle bsw. -quollen hängt zum Teil von den anderen Bestandteilen des Mediums ab, beträgt aber im allgemeinen etwa 1 bis 6 Gewichtsprozent des Mediums. Diese

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Konlenstoffquellen können einzeln oder in Kombination miteinander verwendet werden. Geeignete Stiekstoffquellen sind proteinhaltige 3toffe, wie verschiedene Formen von Caseinhydrolysaten, Sojabohnenmehl, Maiequellwasser, lösliche Schlerapebestandteile, Eefehydrolysate, Tomatenbrei und dergleichen. Die verschiedenen Quellen für Stickstoff werden, entweder für sich allein oder in Kombination miteinander, in Mengen von ©twa 0,2 bis 6 Gewichtsprozent des wässrigen Mediums angewandt.

Die Fermentation unter Verwendung von Antibioticum 833A erzeugenden Mikroorganismen kann bei Temperaturen von etwa 25 bis 31° C durchgeführt werden. Die besten Ergebnisse erzielt man bei Fermentationstemperaturen von 26 bis 30° C. Der für die Züchtung von Streptomyces fradiae und die Erzeugung des Antibioticums 833A geeignete pH-Wert des Nähraadiums kann

im Bereich von etwa 5,5 bis 7,5 schwanken. |

Bas Antibioticum 833A und seine Salze sind wertvolle Antimikrobenaittel, die due Wachstum sowohl graia-positlvsr als auch gram-negativer pathogener Bakterien hemmen, "Daß Antibioticum kann ale anwieeptisch©β Mittel verwendet werden, um H von phaxmazeut !schau, aahnär ζ fliehen und o*s-

flcräten zii anttevxifin. Ferner e^gr^i -».a alrb τχ: y^! '*««»r Ni.!rro'-:-rg^f-r.J nxvi; au,·.· A-...' '■·;/■ .·»··■

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KikroOrganismen. Das Antibioticum kann auch verwendet werdsn, um zu Sestzwecken im Laboratorium dienende Mäuoe au behandeln, die mit- verschiedenen grasi-negaiivea Crgealssen infiziert wordon sind, und auf dieso Weise Infektionsftttellen su beseitigen, die die Tiere andernfalls ungeeignet für laboret or ims sunter Buchungen machen wtträen. Ba dao Antibioticum und seine Salse das Wachstum vercchieelener Arten von Salaonclla äusserst wirksam heiainen, können diese Verbindungen als Dssinf iaiermittel zvaa Waochen von Siern und von flächen verwendet werden, die. durch Salaonella infiziert sind·

Dx- folgenden Beispiele erläutern Verfahren bot Herstellung und Gewinnung des Antibioticuae

Beispiel 1

378,5 1 filtrierte Permentationsflüeeiglceit werden eof einen pH-Wert von 7 eingestellt und duroh eine Säule geleitet, die ein stark basisches Anionenaustauschhars enthält, bei dem quartär^ Asnoonlumgruppen an ein Polyetyrol-divinylbensol-öerust bunden sind ("Dovez 1 χ 2"). Dae erhaltene Barsadsorbat wird mit 3 £iger Annsoniuirichloridlösung in 90 ^igea Meihanol eluiart und dar. Bluat in fraktiosen cu je 7,57 1 aufgsfansen. Mn Fraktionen 4, 5 und o, die das noiate Antibioticum 832A onthalton, lisforn die folgende Analyse:

4	21	5	6
■1" " "" 15,1	14	,7	36,2
14	0		4-
0,93	,65	0,11

Fraktion Kr·

Gesamtfeetstoffe, mg/ml

Aktiv!täteanalyee,
Einheiten/ml

Stärke, Sinheiton/iog

Die Fraktionen 4 und 5 werden gesondert durch Abtreiben des Methanols unter vermindertem Druck auf eine Konzentration ä von 200 ag Gesamtfeststoffe je ml eingeengt. 275 al des Konzentrats der Fraktion 5, die insgesamt 51 g Feststoffe enthalten, warden durch 8,9 1 kugolförmiges Polyacrylamidgel mit Korngrössen von 0*15 bis 0,3 mn geleitet, das sich smr Fraktionierung, Entsalzung und Konzentrierung von Stoffen mit Molekulargewichten von 200 bis 2000 eignet und unter der Bezeichnung "Bio-Gel P-2" von den Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, V.St.A., erhältlich ist. Das Geladsorbet wird mit Waeeer mit einer Geschwindigkeit von 50 ml/Min, entwickelt und das Bluat mit' dea Refraktometer überwacht. Dan Eluat wird in Fraktionen aufgefangen, analysiert, und die eni oprocnenden aktiven*Fraktionen werden vereinigt. Die βνΦ-scivm 5600 ml und 6230 ml ablaufenden €30 »1 Eluat enthalten 19*1 Mg Geaaatfestctoffe js inl und haben bei der oben beee'tir!ebenen Analyao unter Verwendung von Proteus vulgarie Aktivität Ton 68 Einheiten ^e al. Dies bedeutet, dass AntiMoticum 833A eino Stärke von 3,6 Einheiten Je mg

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In der gleichen Weise werden vier weitere Chromatogramme mit 275 ml TiZW. 287 Bl des Konzentrats der Fraktion 5 und mit zwei Anteilen zu je 285 ml des Konsentrate der Fraktion 4 durchgeführt. Die an dem Antibioticum reichen Fraktionen aus allen fünf Chromatogrammen werden vereinigt und unter vermindertem Druck auf 100 mg/ml eingeengt. Die 660 al des so erhaltenen Konzentrats haben eine Stärke von 4t 1 Einheiten je mg.

100 ml dieses Konzentrats werden duroh eine Kolonne geleitet, die 2 480 ml stark saures Sulfonsäure-Kationenaustausehharz mit einem Polystyrol-divinylbenzol-Gerüst in der Waseerstoffform enthält ("Dowex 50 χ 2^M der Dow Chemical Company). Das Harzadsorbat wird mit Wasser mit einer Geschwindigkeit von 19 ml/Min, entwickelt, wobei Eluatfraktionen zu je 20,5 ml aufgefangen werden. Dao Eluat wird mit einem Registrierrefraktometer überwacht. Die Fraktionen Nr. 45 bis 65 werden gesondert durch Titrieren mit 0,1η Natronlauge auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. Die Fraktionen Nr. 52 bis 62 werden dann analysiert und zu einer wässrigen Lösung des Antibioticums 833A vereinigt.

Xn der gleichen Weise werden fünf weitere Anteile dee Konzentrats zu je 100 ml an dem stark sauren Kationenaustauschhars chromatographiert und die aktivsten Fraktionen der Harz-

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eluate mit 4«n !Fraktionen Nr. 52 bis 62 su oiner Gesamtmenge von 1870 Ol vereinigt. Diese wässrig© Lösung des Antibioticuas 833A hat einen pH-Wert von 6,8, einen Gesamtfeststoffgehalt von 2,9 mg/ml und eine Aktivität von 70 Einheiten je ml» Die Stärke äes Natriumsalzes des Antibioticums 833A in dieser wässrigen lösung beträgt daher 24 Einheiten je mg, Die wässrige lösung wird dann unter vermindertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet, wobei man 4,7 g Produkt erhält.

Die als Ausgangsmaterial bei dem obigen Verfahren verwendete Fermentationsflüssigkeit wird folgendermassen hergestellt:

Eine lyophilisierte Kultur von Streptoioyces fradiae MA-2898 (ATOO 21096) (NREL B-3357) wird verwendet, um 50 ml eines sterilisierten Mediums der folgenden Zusammensetzung su beimpfen:

g/i

Hefeextrakt 10

Glucose 10

MgSO₄.7 H₂O 0,05

Fhoephatpuffer* 2 ml .

Destilliertes Wasser Heat

* 91 g KH₂PO₄ und 95,0 g Na₂HPO₄ wit destilliertem Wasser auf 1 1 aufgefüllt.

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Der beimpfte Kolben wird dann in eine rotierende Seaütteloaschine (220 U/Min.; Hub 5 cm) eingesetzt «ad 48 Stunden bei 28° C bebrütet.

Yon dieser vegetativen Kultur wird ein Iepfgut von 10 ml verwendet, um einen 2-Liter-ErlenmeyerIi:olbea bu beiepfen, der 500 ml dee gleichen aterilieierten Mediuas enthält. Der beimpfte Kolben wird in eine rotierende Schütteloaschine (220 U/Mino) eingesetzt und 48 Stunden bei 28° C bebrütet.

Die so erhaltene Fermentationsflüssigkeit wird verwendet, um ein 189 1 fassendes Fermentationsgefäss aus rostfreiem Stahl zu beimpfen, das 160 1 steriles Medium der gleichen Zusammensetzung enthält. Das beimpfte Medium wird unter ständiger Bewegung und Einleiten von Luft mit einer Geschwindigkeit von 85 l/Min„ bei 28° C bebrütet. Hierbei werden geringe Mengen "Polyglycol 2000" zugesetzt, um die Schaumbildung zu unterdrücken.

Ton der so erhaltenen Fermentationsflüssigkeit werden 25 1 alπ Impfgut zum Beimpfen eines 757 1 fassenden Permentationegefässes aus rostfreiem Stahl verwendet, das 510 1 eines sterilen Mediums der folgenden Zusammensetzung enthält:

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g/l

Haferflocken	20
Lösliche Schlompobestandteile	10
So jabohnenmehl	20
Natriumeitrat	2
Natriumascorbat	0,5
Destilliertes Wasser	Rest

Vor dem Sterilisieren wird der pH-Wert dieses Mediums auf 6,5 eingestellt. Die beimpfte Fermentationsflüasigkeit wird dann 3 Sage unter Bewegung und Einleiten von 283 1 luft je Minute bei 28° C bebrütet. Hierbei wird "Polyglykol 2000" in geringen Mengen zugesetzt, um das übermässige Schäumen der Fermentationsflüasigkeit zu verhüten. Dann wird die Fcrinentationsflüssigkeit mit Hilfe von DiatoEiocnerd© filtriert. Das Filtrat hat einen pH-Wert von 7,9 und enthält 13i4 mg Gesamtfeststoffe je ml· Die Analyee der filtriorton Ferinen·» ä t?.tionefltisoiglceit nach der oben beschriebenen Seheibenplattcnmethode unter Vorwendung von Proteus vulgario ergibt einen Gehalt an dem Antibioticum 833A von 0,8 Einheiten je al, was einer Aktivität der Feststoffe von 0,06 Einheiten je mg entspricht.

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4ο

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Bei sp iel

5,6 1 filtrierte Fermentationsflüsßigkeit, die bei der Analyeo mit Proteus vulgaris unter ferwendung von 14 mm-Scheiben eine Hemmungszone von 26 aaa erzeugt, werden auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und rait einer öeschwin* digkeit von 10 ml/Min, durch eine Kolonne geleitet, die 100 ml stark basisches Anionenaustausohharz enthält, bei dem quartäre Ammoniura-Austauschgruppea. an ein Polystyroldivinylbenzol-Gerüst gebunden sind ("Bowex 1.x 2"), und das sich in der Chloridfora befindet« Die verbrauchte Pormentationsflüssigkeit weist bei der oben beschriebenen Analyse ait Proteus vulgaris keine antibiotisohe Aktivität mehr auf.

Bas Harzadeorbat wird mit 100 al Wasser gewaschen und dann mit 5 #iger AaooniuoQhloriälösung ^n 9Q J^igeii Ifethanol eluiert. Bas Eluat wird in fraktionen im ^e 50 ml aufgefangen, die bei de* Analyse »it Proteua vttXgayis die XqI-

■■'■■■■■ '^f,- ■

genden Aktivitäten aufweisen:

1* Keine Aktivität

.2. 26 Βα-Ζοηβ

3. 2Θ Bin-Zone bei Verdünnung 1:25

4* 26 ism-Zone bei Verdünnung 1«100

5* 55

- 20 1(J9886/0löfi

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6. 22 mm-Zone

7. 18 nun-Zone
8o-10. Keine Aktivität.

Die Fraktion Kr. 4, die die grösste Menge an Antibioticum enthält, wird durch Abtreiben des Methanols im Vakuum eingeengt und dann mit Wasser auf 50 ml verdünnt. Die so erhaltene wässrige lösung des Antibioticums 833A hat oinen pH-Wert " von 5,6, einen Peststoffgehalt von 37 mg/ml und ergibt in der Verdünnung 1 s 100 bei der oben beschriebenen Analyse mit Proteus vulgaris eine Hemmungszone von 25,5 mm.

Die als Ausgangsgut für das obige Verfahren verwendete Fermentationsflüssigkeit wird folgendermassen hergestellt:

Zu 10 ml sterilem AO-Ifedium der folgenden Zusammensetzung: |

eA

Rinderextrakt 3

Caseinhydrolysat 10,6

Dextrose 10 Natriumchlorid 5

destilliertes Wasser Rest,

das vor dem Sterilisieren einen pH-Wert von 7,2 aufweist, wird eine Agar-Schrägröhrchen-Kultur von Streptomyces fradiae

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HB-2898 (NRRL B-3351) (ATCC 21096) auf fA-Agaraedium äer folgenden Zusammensetzung zugesetzt:

gA

Agar 20

Hefeextrakt 10

Glucose 10

HgS0₄->7 H₂O 0,05

' Phoephatpuffer* 2 nl destilliertes Wasser

* 91 g XR₂BO* und 95 g Na₃HPO₄ mit Wässer auf 1 1 verdünnt.

Ein 250-ml-Erlenmeyerkolben, der 50 ml steriles AO-Medium enthält, wird alt 3 ml dieser Zellensuspension beimpft. Die Kolben werden dann 72 Stunden bei 28° C in einer rotierenden Schüttelmaschine (220 U/Min.; Hub 5 cn) geschüttelt. Das so erhaltene Impf gut wird verwendet, um eine Anzahl von 2-^Liter-

^w Erlenneyerkolben zu beimpfen, die je 350 ml steriles TD-Kbdiun enthalten, wobei für jeden Kolben iO_t5 al der vegetativ veh Kultur verwendet verdea· Die beiopften Kolben werden 96 Stunden in einer rotierenden Schüttelmaschine (145 U/Min0} Hub 5 cn») bebrütet. Dann werden die Inhalte von zehn Kolben miteinander vereinigt, ; >

Die so erhaltene Peraentationaflüsoiglceit mit einea pH-Wert von 6,6 wird reit Hilf3 von Diatonseonerde filtriert. Das Pil-

109886?!?

trat ergibt "bei der oben beschriebenen Analyse mit Proteus vulgarie eine Aktivitätorone von 26 no.

Eine lyophilisierte Kultur von Streptooyces MB-2898 (2JHRL B-3357) (AICO 21096) vird zum Eeiapfen von 50 nl eines starilen FA-Mediuns der folgenden Zusammensetzung verwendet:

Hefeextrakt 10

Glucose 10

MgSO₄.7 H₂O 0,05 Ifcosphatpuffer* 2 ml

destilliertes Wasser Rest

* 91 g KH₂PO₄ und 95i0 g Na₂HPO₊ ait Wasser auf 1 1 verdünnt.

Der beimpfte Kolben wird 48 Stunden bei 28° 0 in einer ro- _g tierenden Sohüttelaaschine (220 U/Hin.5 Hub 5 ca) bebrütet, und die «o erhaltene Feraentationeflüesigktit wird verwendet,

um ein zweites Inpfgefäes xu beiapfen, das 50 al des gleichen Mediums in eines! 250-ial~ErlenBeyerkolben enthält, wobei 2 £ Inpfgut verwendet vrcrden. Diese Inpfkolben der sweiten Stufe werden 2 Tage bei 28° C in der rotierenden Schüttelaaochine geschüttelt.

- 23 - ßAD ORlQlNAU

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Ton dieser vegetativen Kultur wird ein topfgut von 10,5 ml verwendet, um einen 2-Liter-Erlensjeyerkolben au beimpfen, der 350 öl eines sterilen Mediuras der folgenden Zusaianensot eiing enthält:

g/l

!Trockenes Hafermehl 20

Tomatonbrei ^s _t 20

destilliertes Waasor Rest.

Diese 2-Liter-Koiben werden 72 Stunden bei 28° 0 in einer rotierenden Schütteliaaschine (145 tf/fäia·? Hub 5 eia) bebrütet» Dann wird der Inhalt von sehn derartigen Kolben vereinigt und mit Hilfe VQn Diatomeenerde filtriert, um das Mycel zu entfernen. Dae Piltrat ergibt bei der oben beschriebenen Analyse mit ProteuB vulgarie· MB-858 eine Eemwungaeone von 29

2,6 1 filtrierte FenaentationeflUssigJceit der Stufe (a) 3 1 filtrierte Penuentationsflüeeigkeit der Stufe (b) vferden vereinigt und als Auegangöaaterial für das oben Tt»«eoliri«b«ne Verfahren verwendet.

B Qiopi β 1 1

Dio Fraktionen Nr. 3 und 5 deo nach E^lepiel 2 horgeβtollten Haraoluatßs worden voroinigt and ic VakttutB aui 50 el eingeengi;. Bau 'KonsoTiSrat. bat einon ρίΙ-Wert van 5,4» einan fast-

- 24 - ■
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etoffgehalt von 72 mg/ml und ergibt in einer Verdünnung mit Wasser von 1:40 bei der Analyse nit Proteus vulgaris eine Hemming θ zone von 27 am«

5 nl dieser wässrigen Lösung des Antibiotioune 833A werden an 35 g kugelförmigem Polyacrylamidgel mit Komgröesen von 0,074 bis 0,15 en ohronatographiert, das einen Arbeitsbereich von 200 bis 2000 aufweist (Bio-Gel P-2). Das Geladsorbat wird { dann Bit destillierten Wasser nlt einer Geschwindigkeit von 25 nl/Std. entwickelt» und es werden Eluatfraktionen zu je 4,6 nl aufgefangen. Die Fraktionen Nr. 17 bis 21 zeigen bei der Analyse nach der Soheibenplattennethode nit Hilfe Ton

Proteus vulgaria Aktivität des Antibioticum 833A und haben

eine 3~ bis 5-mal so hohe Reinheit wie das Ausganganaterial·

Beim Bluieren mit destillierten Wasser wird die Kolonne mittels eines Differentialregistrierrefraktoneters überwacht, und es wird gefunden, dass das Salz in den Traktionen Nr. 21 bis 24 ein K__, ron 1,88 aufweist. Der K_ -Wert der antibiotisch aktiven Fraktionen beträgt 1,56«

B ei spiel 4

500 nl einer vegetativen Kultur von Streptonyoes fradiae MA-2898 (AICC 21096) (RBRIi B-3357), hergestellt duroh Züohten dee Mikroorganisnus in einen 2-Liter-Erlenneyerkolben nach

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dem in Beispiel 1 boaehriebenen Verfahren, werden verwendet, um ein 757 1 fassendes Feraentationsgefäas aus rostfreiem Stahl zu beimpfen, das 4-67 1 steriles Medium der folgenden Zusammensetzung enthält:

Hefeextrakt 10

Glucose 10 MgSO₄-? H₂O 0,05

Phosphatpuffer* 2 «al

destilliertes Wasser Rest

* 91 g KHgPO. und 95»0 g Ia₂HPO^ ait Wasser auf 1 1 verdünnt.

Das beimpfte Medium wird 24 Stunden bei 28° 0 unter aeohaniecher Bewegung und Einleiten von 283 1 Luft je Minute bebrütet, wobei eine geringe Menge "Polyglykol 2QO0'¹ zugesetzt wird, um Schaumbildung su unterdrücken» 215 1 der eo erhaltenen Peraentationaflüesigkeit werden verwendet, uto ein 5680 1 fassendes Peraentationsgefase aus roetfrtie» Stahl zu beinpfen, das 4542 1 einte sterilen Hährniediums "der folgenden Zusamwensetiung enthält!

Haferflocken 20

lösliche Suhlerapabestaadteile 10

SojabohnonEiehl 20

- 26 ~ 109tt6/Öeö$

11 579 .

g/1

Natriumcitrst 2

RatriuEascorbat 0,5

destilliertes Wasser Rest.

Dieses Medium wird vor den Sterilisieren auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt.

Dia beimpfte Fermentationafltissigkeit wird "bei 28° C 2 Tage unter Bewegung und Einleiten von 1560 1 luft* je Minute "bebrütet, wobei 'geringe Mengen von '■ Polyglycol 2000" ala Sehauffiverhütungsaiittel zugesetzt werden.

Dieses FenaentationseecUum wird asit Hilfe von Diatomeenerde filtriert. 2082 1 des Piltrats mit einer Aktivität von 0,34 Einleiten je nl worden durch eine Säule geleitet, die ait dem oben beschriebenen ^ionenaustauschharz gefüllt ist, das qiuartäre A.nm<oniuaigruppea an ein Polystyrol-divinylbenzol-So- ^ rust gebunden enthält ("Dowox 1 ι 2") und eich in der Ghloridform bsfindot. Das fiarssadaorbat wird »it 3 ^igor- vaeariger Kochselalöoune oluiort und das Eluat in Fraktionen von je 18,9 1 gesÄffiiaalt. Die verbrauchts» FormöntationBilttafligkelt srwsiet sich nack doa rurehg&ng durch die Kolonne zufolge oiner Axial?/ce Kit *P?ot«u3 vulgaris als inaktiv. Die Fraktionen Bz. 5 bic '2, dio dio etörkoto antibiotische Aktivität

_ 17

109886/0606 bad

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Beispiel 5

Eine lyophilisierte Kultur von Streptoayees fradiae MA.-2915 (ATOO 21099) (NRRL B-3360) wird verwendet, um 50 ml steriles Medium in einem 250~ml~Erlenmeyerkolben au beimpfen. Das Medium hat die folgende Zusammensetzungt

β/1

Gemahlenes Hafermehl 10

Hefehydrolysat 10

Phosphatpuffer* 2 al

WgSQ₄.7 H₂O 0_f05

destilliertes Wasser Rest

* 91 β KH₂SOj. ¹^ 95fO g Ka^SPO₄ mit Wasser auf 1 1 verdünnt.

Der beimpft· Kolben wird 24 Stunden bei 28° G in einer rotierenden Schüttelmaschine bebrütet. 10 ml der so erhaltenen FermentationsflÜssigkeit werden verwendet, um einen »weiten 250-ml-Erlenmeyerkolben zu beimpfen, der 50 ml des gleichen sterilen Mediuae enthült. Die beiapfta Feraeat^tionafllisoigkeit wird 24 Stunden bei 28° C in einer rotiereÄdtn Schüttelaaachine bebrütet. Die eo erhaltene y&rBentationeflÜssigkeit wird verwendet, um ein 5 1 fassendes ?eraentaticmegefäs8 zu beimpfen, das 2600 al eines sterilen Hähncodiume äer folgenden Zusammensetzung enthält:

- 28 - ^O ⁰*tGlNAL

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g/l

Haforgrütse (Steel cut oate) 30 Maisquellw£33er 10

Sojabohnenmelil 10

Wasser " Rest.

Tor dem Sterilisieren wird der pH-Wert auf 6,6 eingestellt.

Das beinipftc NährmadiuE wird dann 4 Tage bei 28 C unter 3ewögung bebrütet, und die Feraentationsflüasigkäit wird axt 3 J- Luft je Miidute belüftet.

Die so erhaltene Feraentationsflüasigkelt wird filtriert; man erhält 2350 ml Piltrat ait einem pH-Wert von 9»0 und einer nach der Scheibenplattenmethode mit Proteus vulgaris bestiiüBten Aktivität.von 3|8 Einheiten je ml, 750 ml dieser Permsntationaflüssißkeit werden durch eine Kolonne geleitet, die 50 ml eines stark basischen AnionenaustatiBchharzes mit' ' quartären Amnoniumgruppen {"Dowex 1 χ 2") enthält, das sich in der Chloridforn befindet. Die verbrauchte Fernentationsilüsaigkeit, dio aus der Kolonne abläuft, enthält nur geringe Ziongon Antibioticum 833A. Das Harzadsorbat wird mit 1 ^iger wäfjorigar Kochsalzlösung eluiort und das Eluat in Fraktionen au 50 ml aufgefangen. Die eretan sechs Fraktionen onthalter» dio folgenden 2?en£on an entibiotioohor Aktivität:

- 29 .
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11 579

1.	5 *
2.	35 #
3ο	28 #
4.	ίο i>
5.
6.	2 56.
B e	i s ρ i e 1 6

Eine 84,5 cm lange und 1,4 cm weite Kolonne mit stark bacisohea Aniononaustauechhars, bei dem quartäre Anüsoniumgruppen an ein Gerüst aus Polystyrol-divinylbenzol gebunden sind ("Dowex 1 χ 2")f wad das sich in der Chloridform befindet (Korngrössen 0,15 bis 0,3 am), wird mit 725 ml 0,1-molarer Kochsalzlösung gewaschen, um das Harz ins Gleichgewicht zu bringen. 36 ng rohes Natriurasalz dos Antibioticum 833A, dessen Analyse 27 μ/jng ergibt, und das nach dem Verfahren des Beispiels 1 hergestellt worden ist, -werden in 1 ml 0,1-njoIarer Kochsalzlösung gelöst, und die Lösung wird auf dao Harz~ bett gegossen. Dann wird die Kolonne mit 0,1-molarer Kochsalslösung mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/Hin, entwickelt, wobei man Fraktionen zu je 5 ml auffängt. Bor Ablauf wird mittels eines Refraktometerο der Bauart "Mecco-Matio Modell 2" tiberwacht. Jede fünfte Fraktion wird mit Hilfe von Proteus Tulgario MB-838 analysiert, um den allgemeinen Bereich der

- 30 109886/0606

biologischen AktiTität festzustellen. Dabei werden £wei biologisch aktive Gipfel beobachtet, näalich die Fraktionen 180 bis 268, die als Fraktion A-1 beseichnet werden, unö die Fraktionen 420 bis 560, die als Fraktion A-2 beseichnet werden. Die Fraktionen für jeden Aktivitategipfel werden vereinigt und auf 10 ml eingeengt.

Jedes Konzentrat wird durch Polyaorylamidgel ("Bio-Gel P~2^M) in einer 150 cm hohen und 1,5 cn weiten Kolonne perkoliert, um das Antibioticum von dem Hatriuachlorid zu trennen. Der Ablauf wird mit dem oben angegebenen Refraktometer überwacht. Die Fraktionen werden mit Hilfe von Proteus vulgaris MB-838 analysiert, um den Bereich der biologischen Aktivität festzustellen. Die biologische Aktivität Bv/ischen 114 ml und 250 ml wird vereinigt, konzentriert und gefriergetrocknet« Die Fraktion A-1 besteht auo 1,4 eg und ergibt boi der Analyse 277 μ/ng. Die Fraktion A-2 besteht aus 3,5 »g und ergibt bei der Analyse * 170 μ/mg.

BeiBPial 7

Sine 84,5 cm hohe und 1,4 cm vtite Kolonne mit eine» stark basischen Anionene.usta\\3öhhara, bei deia quartär« Aanaonium-Austauschgruppen an ein Geriet aus Polystyrol-divinylbenzol gebunden sind p'Dowex 1 >: 2^M), und daa sich in der Chloridform befindet (Korngröeeor. 0,038 bis 0,074 mm) wird Bit 800 ml

**D OB«»*¹· 109886/0606

Trie- (hydr oxyme thyl) -aminome than-hydrochlor id-Puff er 10 sung
mit einem pH-Wert von 8,0 (0,1 molar an Chlorionen) ausgewaschen, um das Hars ins Gleichgewicht zu bringen. 305,5 mg rohes Natriumsais des Antibioticums 833A, dessen Analyse
19 μ/fflg ergibt, werden in 3 ml der gleichen Pufferlösung gelöst und in die Harzkolonne eingebracht. Di© Kolonne wird mit der gleichen Pufferlösung mit einer Geschwindigkeit τοη 1 ml/ Min. entwickelt, wobei Fraktionen zu'5.ml aufgefangen werden. Dabei wird der Ablauf mittels eines Registriorrefraktoraeters überwacht. Jede fünfte Fraktion wird mit Hilfe von Proteus
vulgaris MB-838 analysiert, um den allgemeinen Bereich dor
biologischen Aktivität festzustellen. Ein aktiver Gipfel erscheint in den Fraktionen Nr. 115 bis 185· Die Fraktionen
Nr. 164 bis 184 werden vereinigt und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird zu einem Volumen von 12,0 ml in Wasser gelöst und in einer 143 cm hohen und 4,7 cm weiten Kolonne
durch Polyacrylamidgel ("Bio-Gel P-2") porkoliert, um das
Antibioticum von dem Puffer su trennen. Der Ablauf wird ciit dom Registrierrefraktometer überwacht. Di© Fraktionen werden mit
Hilfe von Proteus vulgaris MB-838 analysiert, um die biologische Aktivität festzuQteilen. Die Aktivität in den Fraktionen zwischen 1420 ml und 1680 ml wird vereinigt, konsontriort und gefriergetrocknet. Dar Rückstand besteht aus 89,6 mg und ergibt bei fier Analyse 46 μ/rag.

109886/0606 öad ori_G,_NAl

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Dieses unreine Antibiotikum 833A wird in 5 ml Waeeer gelöet und dia Iib'sung durch, eine Kolonne geleitet, die 2 ml stark saures Katioseii&uatausiihhara in der Natriumfonn enthält (kernständigs Sulfoaatgruppon, die an ein Gerüst aus PoIyatyrcl-divinyllseiisol gesunden aind; ^i:Dowex 50"), um die Tris-(hydro23Tj;3thyl}-siiijinoa!öth.angruppe durch Natrium zu ersetsen.

Das Natriusssalz des JLntiMoticums 833A in den 10 sl-Ablauf ergibt bei dar Analyse eine Aktivität von 480 Einheiten je si. ™ Durch Gefriertrocknung der lösung erhält aian 71,6 mg Feststoff mit einer Stärke von 67 Einheiten je asg_a

Beispiel 8

?500 id filtrierte Fenaentationeflüesigkelt (Ansätze Nr. 15753 und 13734) ait oiner Aktivität von 0,1 Einheiten ^e ml, die bei dor Sttheibenpl&ttienanalyse mit Protoue vuigaria MB-838 unter TorwendvjrAg von 14 sa>-3choiben eino Hemraungozone von 21,5 ura ergibt und oiaen pH-Wert von 6,1 aufweint, werden mit einer Geschwindigkeit von 7 nil/Min. durch 100 ml eine© schwach basischen, vernotztim Polyacryl-Ionenauetauschharaes ("IRA-öe") in der :?rc.*cn .'Jaoc ^^loitet» Haoh dem Durohlauf hat die ?er-C-icnra-flt^BiÄkeit keine biologischa Aktivität gegen Proteus \Ti.igarls:, Die Kolonne wird mit Wasrxr gevrao^hen und mit 1 #igor v/}^;3£r.^Tge^ BcchsallzlÖBung aluierfc, Nach oinem 7orlauf /on ;}0 ah'., 6.^r Torwor-Ccn wird, worden Ί0 wl-Fraktionen auf ge-

I 0 9 Ü tMJ / 0 6 0 5 BAD ORIGINAL

11 579

fangen. Sie Fraktionen werden analysiert» wobei sich zeigt, dass die Fraktionen Nr« 11 bis 30 93 £ der in die Kolonne eingegebenen Aktivität enthalten. Die aktiven Fraktionen STr. 11 bis 30 werden zu 192 ml vereinigt; die lösung hat einen pH-Wert von 9,5. Nach Einstellung des pH-Wertes auf 7 wird die Lösung mit Hilfe von Proteus vulgaris MB-838 analysiert. Sie Ergebnisse sind die folgenden:

Verdünnung Heamongagone 1o unverdünnt 32,5 nna

2o 1:2 29 n

3. 1:4 24,5 aas

4. 1:8 20,5

Sie in dem vorstehenden Beispiel verwendete Fermentationsfltissigkeit wird nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt.

" 34 109886/0606

Claims (1)

13. Sep. 1968 Herek & Co·, Ine.

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Patentansprüche

1, Terfahren sum Gewinnen dea Antibiotieums 833A aus unreinen M wässrigen Lösungen, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Fermentationeflüssigkeit oder oine Lösung, die das Antibioticum enthält, durch eine iait einem Anionenaußtauschharz oder GiaioE stark sauren Kationenaustauaohharz beschickte Kolonne leitet, dao Harsadsorbat sait einem Eluierungsiaittel cluiert, die Eluate auffängt und die aktiven Fraktionen vereinigt.

c Yerfahren nach Anspruch 1. dadurch gekennseichnet, dass als Anionenauötauschhars ein Hars verwendet v/ird, bsi dem quartäro Amiaoniuai-Austauschgruppen an ©in Gerüst aus Polystyrolüivinylbensol gebunden sind.

3. Terfahren nach An?3pruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass «in Eßtionenauet&usehhaAis verv;enöot wird, bei dem kernotändig© SuIfonsäure-Austaueohgruppen an ein (Jerüst aus Polyatyrol-

a ßind.

- 33 -

BAD

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4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet» dass el β Eluierunges&ttsl eine v/ässrig-alkoholische Lösung einee wariserlbslichen Alkali-, AsnioniuiE- odor 2riß~(hydroxyEi©thyl)~ τ. asinomethanaalsee vsrwendat wird. ·

5. Vorfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daos als Eluisrungsxaittol eine 5 #ig© Asaaoniusschloridlösuag in ^ ^ ·^r 90 tigern Methanol Yerwenäet wird.

6. Verfahren naoh Ansprxicli 1, dadurch gekennzeichnet, dass ale BluierungöDiittel eine 1- bis 3 ^ige wässrige Kochsalalöoung verwendet v/ird.

Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die aktiven Fraktionen vereinigt, dio vereinigten Fraktionen konzentriert, den Rückstand in Wasser 130t, die wässrige Lösung an einest Polyacrylamidgel mit einem Arbeitsbereich von. 200 bis 2000 chroBatographiert und das G-oladsorbat mit Wasser entwickelt.. ■ -.. .

8„ Verfahren eu^a Reinigen des Antibioticuma 853A, daduroh geke»nseichnet, dass »an ©in AnionenauGtauschhars in einer Kclonn© durch Auswaticben mit der lösung eines Alkali-, Erd-

oder des Balze* einer organischen Base ina ßleichgewioiit bringt, das wirsine SaIa des Antibioticuiie in der eut bleich«

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gevriciitoöiüs teilung vor wende ten Lösung loot, die Lösung durch das Hars leitet, die Kolonne mit einer Lösung von der Zuaam-· Benaetzung der zur Glüichgewichtncinetellung vorwendeten Lösung entwickelt, die aktiven Fraktionen vereinigt und die vereinigten Fraktionen

9« Verfahren nach Aaapruch .9. dadurch gekennaoichnat, daaa κε.η

das Konzentrat zwecks Entfernung dee Seisas duroh ein golfor- ™

Piltrationahars riürkoliort, die aktiven Praktionen vereinigt, die vereinigten Proktionen koasontricrt und dao Lb'-eungeaiitel aus dom Konsantrat abtreibt.

- 37 - -

tO 9 8 8 6 / 0 S 0 6 ß^AD o^RIGlNAU