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Verfahren zur Herstellung von Vitamin B 1z Die Erfindung bezieht sich
auf die Herstellung von Vitamin B12 in Fermentationsverfahren und insbesondere auf
eine Verbesserung bei solchen Fermentationsverfahren, durch die auffallend erhöhte
Ausbeuten an Vitamin Bit und diesem nahe verwandten Stoffen gewonnen werden können.
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Gemäß der Erfindung werden Vitamin B12 und dem Vitamin B12 verwandte
Stoffe durch einen Fermentationsprozeß gewonnen, der dadurch gekennzeichnet ist,
daß die Fermentation in Gegenwart eines Stoffes ausgeführt wird, von dem der Organismus
die Cyangruppe übernehmen kann. Erforderlich ist, daß dieser Stoff in einer hinlänglichen
Menge zur Anregung erhöhter Produktion von Vitamin B12 und dem Vitamin B12 verwandten
Stoffen vorliegt, jedoch nicht in solcher Menge zugegen ist, daß die Fermentation
verzögert wird. Vitamin B12 ist ein Produkt, das LLD (Lacto-bacillus läctis Dorner)-
und APF (Tiereiweißfaktor)- Aktivität besitzt, die insbesondere bei der Behandlung
perniciöser Anämie von Nutzen ist, aber auch zur Förderung des Wachstums bei Küken
und Schweinen dient. Vitamin B12 wurde bisher gemäß einer Veröffentlichung von R
i c k e s und anderen in Science, Bd. 107 (1g48), S. 396/g7, gewonnen. In
einer späteren Veröffentlichung von Rickes und anderen in Science, Bd.1o8 (1948),
S.634/35 wurde herausgestellt, daß Vitamin B12 aus Fermentationsmedien erhalten
werden kann, die durch die Fortpflanzung einer Anzahl verschiedener Mikroorganismen
erzeugt werden, und daß das so erhaltene kristalline Produkt identisch- ist mit
kristallinem Vitamin B12, das früher aus Leber gewonnen wurde. Obwohl die chemische
Struktur von Vitamin B12 noch nicht vollständig
bekannt ist, wurde
doch festgestellt, daß Vitamin B12 die charakteristische Cyangruppe im Molekül enthält.
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Verfahren zur Gewinnung von Vitamin B12 aus Streptomyces griseus (Fermentationsflüssigkeiten)
sind bekannt, ebenso wie durch Fermentation mit einer Anzahl verschiedener Organismen
von subphylum Fungi. Bei diesen verschiedenen Fermentationsprozessen wurde gefunden,
daß außer Vitamin B12 weitere Stoffe entstehen, welche eine der LLD und APF ähnliche
Aktivität aufweisen, welche sich aber von Vitamin B12 durch das Fehlen der Cyangruppe
unterscheiden. Diese Stoffe können in Vitamin Bit durch Reaktion mit einem Stoff,
der zur Abgabe von Cyanionen in der Lage ist, übergeführt werden. Die Überführbarkeit
dieser Stoffe in Vitamin B12 zeigt weiterhin deren sehr nahe Verwandtschaft zum
Vitamin B12. Es werden daher im Rahmen dieser Beschreibung diese nahe verwandten
Stoffe als Vitamin-B.2-verwandte Stoffe bezeichnet. Es bestehen sehr starke Anzeichen
dafür, daß die so bezeichneten Vitamin-B12-verwandten Stoffe überwiegend aus einem
Abkömmling des Vitamins B1, bestehen, der durch das Fehlen der Cyangruppe im Molekül
gekennzeichnet ist: Ein solcher Abkömmling wurde durch Hydrierung von Vitamin B12
in Gegenwart eines Platinkatalysators hergestellt. In diesem Zusammenhang wird die
Aufmerksamkeit auf die Veröffentlichung von Kaczka und anderen Journ. Am. Chem.
Soc. 71, 1514, gelenkt, die über die katalytische Reduktion von Vitamin B12 berichtet
und das Erzeugnis als Vitamin B12, identifiziert. Es wurde gefunden, daß eine erhebliche
Ausbeutesteigerung an Vitamin B12 und Vitamin-BR verwandten Stoffen, die als Vitamin
B12, anzusprechen sind, dadurch erhalten werden kann, daß die Fermentation mit verschiedenen
Vitamin B12 erzeugenden Organismen in Gegenwart einer geringen Menge eines Stoffes
ausgeführt wird, von dem der Organismus die Cyangruppe übernehmen kann. Es wird
später eingehender beschrieben, wie der Fermentationsprozeß in Gegenwart einer solchen
Substanz ausgeführt werden kann, die für den Organismus eine unmittelbare Quelle
von Cyanionen darstellt, sei es, indem ein einfaches Cyanid vorliegt, das iri Lösung
ionisiert ist, sei es, daß in Gegenwart eines Komplexes gearbeitet wird, aus dem
der Organismus die Cyangruppe in verwertbarer Form freisetzen kann.
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Es bestehen mehrere Veröffentlichungen über bekannte Verfahren, betreffend
die Anwendung von Cyaniden als Inhibitoren von Enzymsystemen, die durch ihre Anwesenheit
die Eigenschaften und Mengen der erhaltenen Fermentationsprodukte ändern. Bei dem
Verfahren gemäß der Erfindung zur Erzeugung von Vitamin B12 und diesem verwandten
Stoffen auf dem Wege der Fermentation hingegen ergibt sich auf Grund der Experimentalergebnisse,
daß die höheren Ausbeuten nicht auf irgendwelche Hinderung des Organismus oder seiner
verwandten Enzymsysteme zurückzuführen sind, sondern vielmehr auf eine spezifische
Wegbereiterwirkung, die durch die Gegenwart von Cyanionen, die dem Organismus in
dem Medium zur Verfügung stehen, verursacht wird.
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Obwohl jedoch im Rahmen dieser Beschreibung keine Festlegung durch
theoretische Erörterungen dieser Erscheinung erfolgen sollen, werden die folgenden
Beobachtungen für bezeichnend gehalten. Die Vitamin-B1.-verwandten- Stoffe, die
neben Vitamin Bla im Laufe der Fermentation entstehen, gleichen weitgehend dem Vitamin
1312, enthalten jedoch nicht die Cyanidgruppe. Da Fermentationsflüssigkeiten bei
der Erzeugung von Vitamin B1, häufig schwach reduzierend sind, scheint es, daß Vitamin-B12
verwandte Stoffe, wenigstens teilweise, in dem Medium durch Reduktionswirkung auf
-das Vitamin B12, das gerade vom Organismus synthetisiert wurde, gebildet werden.
Es ist nicht ausgeschlossen, daß das Cyanion, möglicherweise teilweise, dahingehend
wirksam ist, Stoffe in Vitamin Bit durch Einführung des Cyanidions in das Molekül
umzuwandeln. Der experimentelle Augenschein belegt jedenfalls in klarer Weise, daß
der Zuwachs an Vitamin-B12-Aktivität, die gemäß dem Verfahren der Erfindung entsteht,
deutlich größer ist als der Zuwachs, der einer solchen Konversion von Vitamin-B"-verwandten
Stoffen in Vitamin B1, zugerechnet werden kann. Mit anderen Worten, es ist die gesamte
Vitamin-B12-Aktivität, d. h. die von Vitamin Bit und der diesem verwandten Stoffen,
durch das erfindungsgemäße Verfahren erheblich vergrößert, was anscheinend darauf
zurückzuführen ist, daß das Cyanion eine bestimmte Wegbereiterwirkung entwickelt,
indem die Synthese von Vitamin B" durch den Organismus während der Fermentation
angeregt wird.
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Die augenscheinliche Wirkung des Cyanions als Wegbereiter im vorliegenden
Verfahren ist ein Umstand, der überraschend und unerwartet ist im $inblick auf die
bekannte Verwendung von Cyanionen bei Fermentationsprozessen. In diesem Zusammenhang
sei gesagt, daß ein deutlicher Unterschied zwischen dem bekannten Verfahren der
Einwirkung von Cyaniden auf ein Enzymsystem im Sinne einer Ausbeuteerhöhung von
Fermentationsprodukten, die keine Cyanidgruppe enthalten, und dem Verfahren gemäß
der Erfindung besteht, wo das dem Medium zugesetzte Cyanion in der Tat von dem Organismus
zur Synthese von Vitamin B12 gebraucht wird.
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Nach dem Fermentationsverfahren gemäß der Erfindung werden Fermentationsmedien,
die zur Erzeugung von Vitamin B12 und diesem verwandten Stoffen verwendet werden,
Substanzen zugefügt, die in der Lage sind, dem Organismus Cyanionen zuzuführen.
Damit sei nicht nur an Verbindungen gedacht, die im Medium unter Bildung von freien
Cyanionen ionisieren, sondern auch an bestimmte Komplexverbindungen, die die Cyanidgruppe
in einer Form enthalten, die geeignet ist, eine Einwirkung auszuüben, indem Cyanionen
durch den Organismus freigesetzt werden. So können z. B. ionisierbare Cyanide, wie
Blausäure, Ammoniumcyanid, Alkali- oder Erdalkalicyanid, leicht bei vorliegendem
Verfahren angewendet werden; außerdem wurde gefunden, daß gewisse Komplexverbindungen,
wie z. B. Alkalimetallferrocyanideund-ferricyanide, eine ähnlicheWegbereiterwirkung
ausüben, offensichtlich zufolge der Freisetzung von Cyanionen durch den Mikroorganismus.
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Die zur Anregung der Bildung von Vitamin B12 oder diesem verwandten
Stoffen dienende Cyanionenmenge
ist außerordentlich klein; eine
solch geringe Menge, wie o,i Teil auf i Million an Cyanion, bewirkt einen deutlichen
.Zuwachs. Größere Mengen an Cyanionen liefernde Substanzen können auch angewendet
werden. Es sind dabei eingeschlossen Mengen, die zur Lieferung von ungefähr 5o bis
ioo Teilen pro Million an Cyanion dienen. Eine höhere Zugabe sollte jedoch im allgemeinen
vermieden werden, da freies Cyanion, hinausgehend über ungefähr ioo Teile pro Million,
einen toxischen Effekt auf die verschiedenen Vitamin 1312 erzeugenden Organismen
zu haben scheint. Bei Anwendung größerer Mengen zeigt sich eine Verzögerung im Wachstum
bei dem Fermentationsvorgang und ein Abfallen der Vitariin-B12-Bildung. Komplexe,
wie Alkalimetallferro- und -ferricyanid, liefern keine freien Cyanionen in der Lösung
und können in größeren Mengen ohne Gefahr einer Wachstumsverzögerung beim Verlauf
des Fermentationsvorganges angewendet werden. Es scheint, daß die besten Ergebnisse
dann erzielt werden, wenn die Substanz, die Cyanionen liefert, im Fermentationsmedium
in einer solchen Menge vorliegt, daß dem Organismus etwa i bis io Teile auf i Million
an Cyanion zur Verfügung stehen. Vorzugsweise wird die Cyanionen liefernde Substanz
dem Medium zu Beginn der Fermentation zugegeben, indem entweder die Gesamtmenge
vor Beginn der Fermentation zugefügt wird oder Teile der Gesamtmenge bei Beginn
vorliegen und die restlichen Teile in Zeitabständen entsprechend dem Fortschritt
der Fermentation zugefügt werden. Obwohl eine erhöhte Ausbeute an Vitamin B12 und
diesem verwandten Stoffen auch dann erhalten wird, wenn Cyanionen bildende Stoffe
zugegeben werden, nachdem die Fermentation schon eine Weile fortgeschritten ist,
so wurde doch gefunden, daß im allgemeinen in solchen Fällen die Ausbeuteerhöhung
nicht so groß ist wie dann, wenn Cyanionen schon bei Beginn der Fermentation vorliegen.
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Die folgenden Beispiele zeigen, wie Fermentationsvorgänge gemäß der
Erfindung ausgeführt werden können.
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Beispiele i. In 250 ccm Erlenmeyerflaschen wurden je 40 ml
eines Mediums aus einem i°/oigen enzymatischen Caseinhydrolysat, 0,3 °/o Fleischextrakt,
0,5 °/o Natriumchlorid, io Teile pro Million Kobaltnitrathexahydrat und destilliertes
Wasser von einem PH von 7,0 eingefüllt. Dann wurden o, o,i, i, io, ioo, iooo bzw.
5ooo Teile auf i Million Cyanion in Gestalt von Kaliumcyanid zu den Flaschen zugegeben.
Die Medien wurden darauf durch Behandlung im Autoklav während 15 Minuten bei 121°
sterilisiert.
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Jeder Flasche wurde dann i ml einer während 40 Stunden gewachsenen
Kultur eines griseinbildenden Stammes von S. griseus, der in einem Medium, das dieselben
Bestandteile, wie vorstehend beschrieben, enthielt, gewachsen war, zugegeben. Die
Flaschen wurden dann mit Baumwollstopfen verschlossen, auf einen Schüttler mit einer
Amplitude von 3,6 cm gebracht und bei 28° während 65 Stunden geschüttelt. Den Flaschen
entnommene Proben wurden auf das Wachstum untersucht, ihr px wurde bestimmt und
einer Probe gegen L.lactis Dorner unterworfen. Hierbei wurden folgende Resultate
festgestellt:
| Mittlere |
| Teile pro Million CN Wachs- PR Aktivität |
| tum LLD/ |
| Milliliter |
| 5000................. - 7,0 - |
| iooo................. - 7,0 - |
| 100 ................. 7,9 1500 |
| 1o................. 8,6 6ooo |
| i................. -E- 8,6 5750 |
| 0,i .............. 8,6 6ooo |
| o (Kontrolle) ..... -I- 8,5 4950 |
Zahlenmäßige Bestimmungen von Vitamin B12 und diesem verwandten Stoffen gemessen
als Vitamin B". wurden mittels Papierstreifenchromatographie vorgenommen. Eine Kontrollstreifenkultur
und eine Kultur mit einem Teil pro Million Cyanion wurde wie folgt ausgewertet:
Die Kulturen wurden auf ein p$ von 2,5 angesäuert, filtriert und neutralisiert.
io ccm des Filtrats wurden mit Kresol gesättigt und mit -2,5 ccm Kohlenstofftetrachlorid-Kresol
im Verhältnis 3: 1 extrahiert. Mit Kaliummonophosphat imprägnierte Papierstreifen
wurden mit o,i ccm des Extraktes besprüht und 3 Tage lang mit wassergesättigtem
n-Butanol entwickelt. Es wurde gefunden, daß bei dieser Arbeitsweise reines Vitamin
B12a und Vitamin B12 in Flecken, 5 bis 17 cm von den Ursprungsorten entfernt, vorlag.
Die Vitamin B12 enthaltenden Bereiche wurden dadurch ermittelt, daß einer der entwickelten
Streifen auf eine breite L. lactis-Dorner-Probierplatte gelegt wurde. Nach der Feststellung
des Ortes der Vitamin B12 und Vitamin B12 ä Zonen auf dem Versuchsstreifen wurden
die aktiven Flächen durch Duplikatstreifen mit Wasser ausgelaugt und die Laugen
quantitativ auf ihren Vitamingehalt durch titrimetrisches Verfahren gegen L.lactis
Dorner untersucht. Dieses Verfahren ist beschrieben in J. Biol. Chemie, 18o, 125
(1949). Die folgenden Ergebnisse wurden ermittelt
| Minimikrogramm Vitamin |
| Kultur pro Milliliter der Kultur |
| # B12-Zonel) I B12.-Z one2) |
| Kontrolle ............... 8,5 9o |
| Zugabe von i Teil Cyanionen |
| auf i Million .......... 36 178 |
| 1) Verglichen mit Vitamin-B,2-Standard. |
| 2) Verglichen mit Vitamin-B,2,-Standard. Der Zuwachs |
| an Vitamin B12 gegenüber dem Kontrollversuch war ungefähr |
| vierfach, und der Zuwachs an Vitamin-1312,-ähnlichen war |
| ungefähr zweifach. |
2. In ein 5-1-Gärgefäß aus Glas wurden je 3,21 eines Mediums, wie in Beispiel i
beschrieben, eingebracht. Die Gärbehälter und das Medium wurden
während
45 Minuten bei i2o° im Autoklav sterilisiert. Dann wurden die Gärbehälter mit einer
vegetativen Kultur eines streptomycinbildenden Stammes von S. griseus, der in einem
Medium, das dieselben Bestandteile wie im Beispiel i beschrieben enthielt, beimpft.
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Drei Gruppen der Gärbehälter wurden mit Kaliumcyanid wie folgt behandelt:
r. i Teil auf i Million Cyanion wurde nach der Autoklavbehandlung zugegeben, 2.
5 Teile auf i Million Cyanion wurden nach 48 Stunden Fermentation zugegeben und
3. je i Teil pro Million Cyanion wurde nach o, 24, 48, 72 und 96 Stunden zugegeben.
Der Inhalt der Gärgefäße wurde belüftet und bei 27° während iio Stunden bewegt.
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Chemische Untersuchungen auf Vitamin B12 und diesem verwandte Stoffe
wurden auf den gesamten Inhalt der Gärbehälter am Ende 'der Fermentationsperiode
erstreckt. Die Untersuchungsschritte waren die folgenden: Adsorption an aktiver
Holzkohle, Auswaschen mit Butanolwasser, Extraktion mit B.enzylalkohol, Adsorption
an Tonerde und Auswaschen mit Methanol. Die -Vitamin B12 und diesem ähnliche Stoffe
wurden quantitativ in der Methanoläuswaschung durch Vergleich der Lichtabsorption
bei 550o A (einem charakteristischen Maximum des Vitamins B12) mit der von reinem
Vitamin B12 verglichen. Die Untersuchungsergebnisse waren unter Berücksichtigung
der Annahme, .-daß -jegliche Färbung auf Vitamin B12 zurückzuführen ist, die folgenden:
| Gesamtfärbung |
| Kultur berechnet als |
| Vitamin B12. |
| -g/3790 1 |
| Kontrolle ................. . ... 128 |
| i Teil pro Million C N-, zugegeben |
| bei o Stunden ............... 205 |
| 5 Teile pro Million CN-, zugegeben |
| bei 48 Stunden .....:........ igo |
| i Teil pro Million CN-, zugegeben |
| _ bei o, 24, 4$, 72 und 90 Stunden - 207 |
Eine beachtliche Ausbeutesteigerung wurde also bei allen Ausführungsweisen der Zugabe
von Kaliumcyanid gefunden.
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3. In einen jeden von zwei 568 1 fassenden Gärungsbehälter aus rostfreiem
Stahl wurden 4811 eines Mediums eingebracht, das 10/, enzymatisches
Casein hydrolysat, 0,3 °/a Fleischextrakt, o,5 °/a Natriumchlorid und
0,3 °/o Sojabohnenöl, io Teile pro Million Köbaltnitrathexahydrat und Leitungswasser
enthielt. Die Medien wurden dann durch Erhitzen auf i2o° während 30 Minuten sterilisiert.
Zu dem einen Gärungsbehälter wurde Kaliumcyanid in einer ausreichenden Menge, um
i Teil pro Million Cyanion vorliegen zu haben, zugegeben. Die Gärungsbehälter wurden
dann mit einer vegetativen Kultur eines griseinbildenden Stammes von S. griseus
beimpft, die in einem Medium gewachsen waren, das dieselben Bestandteile, wie oben
beschrieben, enthielt, mit Ausnahme davon, daß kein Sojabohnenöl zugegen war. Die
Inhalte der Gärungsbehälter wurden belüftet und während 132 Stunden auf 27° unter
Bewegung des Inhalts gehalten.
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Chemische Untersuchungen auf Vitamin B12 und diesem verwandte Stoffe
wurden auf den Inhalt der Gärungsbehälter am Ende des Fermentationsvorganges, wie
im Beispiel 2 beschrieben, erstreckt. Die Untersuchungsergebnisse waren die folgenden
| Gesamtfärbung |
| Kultur berechnet als |
| Vitamin Bla |
| mg/3785 1 |
| Kontrolle ..................... 415 |
| i Teil pro Million C N- zugegeben 730 |
Eine beträchtliche Ausbeuteerhöhung wurde also durch die Zufuhr von Kaliumcyanid
erzielt.
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4. Ein Medium, das 1 °/o enzymatisches Caseinhydrolysat,. 0,3 % Fleischextrakt,
0,5 % Natriumchlorid und io Teile pro Million Kobalt-(II)-nitrat Hexahydrat enthielt,
wurde hergestellt und in Mengen von 50 ccm in 25o-ccm-Flaschen abgefüllt,
0,5 °/o Sojabohnenöl zugegeben und dann durch Behandlung im Autoklav während 15
Minuten bei 121° sterilisiert.
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Wäßrige Kaliumcyanid- und Calciumcyanidlösungen wurden durch Filtration
über ein ultrafein gesintertes Glasfilter sterilisiert. Kaliumferricyanid- und Kaliumferrocyanidlösungen
wurden durch Behandlung im Autoklav sterilisiert. Die sterilen Lösungen wurden aseptisch
den Flaschen mit dem sterilen Kulturmedium in genügender Menge zugegeben, so daß
i y Cyanion pro Milliliter des Mediums im Falle der Anwendung der Kalium- und Calciumsalze
und i y pro Milliliter der Gesamtcyanmenge im Falle der Anwendung der Komplexsalze
vorlagen. In eine andere Flasche wurde Kaliumferricyanid in einer Menge zugegeben,
so daß io y pro Milliliter der Gesamtcyanmenge vorlagen.
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Alle Medien einschließlich eines Kontrollmediums, dem kein Cyanidsalz
zugefügt war, wurden mit i ccm einer vegetativen Kultur eines streptomycinbildenden
Stammes von S. griseus beimpft.
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Eine zweite Reihe von Medien mit io y pro Milliliter Cyan, das als
Kaliumferricyanid vorlag, wurde angesetzt. Zur Kontrolle wurde ein Ansatz ohne Zusatz
von Cyan gemacht. Diese Versuchsreihe wurde mit einer vegetativen Kultur eines neomycinbildenden
Stammes von S. griseus fradiae beimpft.
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Alle Flaschen wurden bei 28° auf einem Drehschüttler bebrütet. Nach
viertägiger Brutdauer wurden die Kulturen während 15 Minuten bei 121° im Autoklav
behandelt zur Freisetzung der LLD-aktiven Stoffe vom Unlöslichen. Mit Monokaliumphosphat
imprägnierte Papierstreifen wurden mit abgemessenen Mengen der oben schwimmenden
Kulturflüssigkeit besprüht. Dann wurden Chromatographien mit wassergesättigtem n-Butanol
in -einer Atmosphäre, die mit diesen Lösungsmitteln bei Raumtemperatur gesättigt
war, im Laufe von 3 Tagen entwickelt. Die für
Vitamin B12 charakteristische
aktive ,Zone, die sich auf den Chromatographien abschied, wurde mikrobiologisch
lokalisiert und mit Wasser ausgelaugt. Eine quantitative mikrobiologische Untersuchung
wurde zur Bestimmung der Menge des in den Kulturbrühen enthaltenen Vitamin B12 unternommen.
Die Ergebnisse waren die folgenden
| Vitamin B12 |
| Kultur Medium Gehalt der Kultur |
| Zusatz (Mikro-Y |
| pro Milliliter) |
| S. griseus keine . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 |
| - - 1/m1 CN- als KCN.... iio |
| - - i/ml CN- als Ca(CN)2 . 17 |
| - - i/ml CN- als K,Fe(CN)s 23 |
| - - i,'ml CN- alsK,Fe(CN)s 51 |
| - - io/ml C N- als K3 Fe (C N), 96 |
| S.fradiae keine ................. 43 |
| - - io,`ml CN- alsK, Fe(CN)s 64 |
5. In 25o ml Erlenmeyerflaschen wurden je
50 ml eines Mediums eingebracht,
das 2 °/a enzymatisches Caseinhydrolysat, o,5 °/o Fleischextrakt, o,25 °/o Dikaliumphosphat
und io Teile auf i Million Kobaltnitrathexahydrat enthielt. Alle Flaschen wurden
im Autoklav während 2o Minuten bei i20° sterilisiert. Eine wäßrige Kaliumcyanidlösung
wurde durch Filtration durch ein ultrafein gesintertes Glasfilter entkeimt und,
wie angegeben, zu jeder Flasche aseptisch zugegeben. Alle Flaschen wurden mit i
ml einer 24stündigen Tauchkultur eines der Sonnenbestrahlung ausgesetzten Substrats
aus Kuhmageninhalt, als Alkaligenes faecalis identifiziert, beimpft, wobei die Kultur
in einem Medium aufgewachsen war, das dieselben Bestandteile, wie oben beschrieben,
enthielt. Die Kulturen wurden bei 28° auf einem 3,6-em-Amplitudenschüttler während
3 Tage bei 28° gebrütet. Die gewonnenen Kulturen wurden im Autoklav bei i20° während
15 Minuten behandelt, um die Gesamtmenge an LLD-aktiven Substanzen freizusetzen.
Dann wurde auf LLD-Aktivität untersucht mittels des Sehalenuntersuchungsverfahrens,
mit L. lactis Dorner als Testorganismus und Vitamin B12 als Standard. Proben wurden
zur Entfernung von Zellteilen zentrifugiert und io ml der oben schwimmenden Flüssigkeit
mit 2,5 ml Kresol-Kohlenstofftetrachlorid, wie im Beispiel i beschrieben, extrahiert.
Die Lösungsschicht wurde entfernt und 0,4 ml auf einen mit Monokaliumphosphat imprägnierten
Papierstreifen gesprüht und während 3 Tage mit wassergesättigtem n-Butanol entwickelt.
Die für Vitamin B12 charakteristische LLD-aktive Zone wurde lokalisiert und mit
Wasser zur quantitativen Untersuchung ausgelaugt. Alkaligenes faecalis zeichnet
sich durch die Bildung großer Mengen LLD-aktiver Substanzen aus, die chemisch nicht
Vitamin B12 gleich zu sein scheinen. In Gegenwart von Kaliumcyanid wurde Vitamin
B12 gebildet, wie sich durch die Papierstreifen chromatographisch zeigte.
| Einheiten pro |
| Menge des zugefügten L. lactis Milliliter Kultur |
| KCN Untersuchung LLD-Einheiten |
| Vor der Nach der LLD-Aktivität aus der |
| B12-I'apier- |
| Beimpfung Beimpfung der Kultur streifenzone |
| o 0 4,80o < 630 |
| 8 Teile |
| pro Million o 12,400 875 |
| 8 Teile 1 8 Teile |
| pro Millionl pro Million 32,400 180o |
Vitamin B12 enthält i1 ooo LLD-Einheiten pro y. Bei dem vorstehenden Versuch wurde
also aus Kulturen, die in einem Medium, das mit 8 Teilen KCN auf i Million vor der
Beimpfung versehen war, o, o79 y Vitamin B12 pro Milliliter der Kultur abgetrennt;
und aus den Kulturen, denen ein weiterer Zusatz von 8 Teilen pro Million KCN 24
Stunden nach Beginn der Brütung zugegeben war, wurde o,064 Vitamin B12 pro Milliliter
der Kultur abgetrennt.
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6. Ein Medium, das 4 °/o lösliche, bei der Herstellung von Trinkalkohol
anfallende Schlempe in Trockenform und 1o Teile pro Million Kobaltnitrathexahydrat
in Wasser enthielt, wurde hergestellt und in Mengen von 40 ccm in 25o-ccm-Flaschen
abgefüllt. Zu den Flaschen wurde eine genügende Menge Kaliumcyanid zugegeben, um
das Medium mit o,i, i,o bzw. =o Teilen pro Million Cyanion zu versehen. Die Flaschen
wurden mit Baumwollstopfen verschlossen und im Autoklav während 15 Minuten bei izi°
sterilisiert.
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Eine vegetative Kultur wurde hergestellt, indem man in einem Medium
aus Fleischextrakt und enzymatischem Caseinhydrolysat einen nicht identifizierten
Mikroorganismus, der zum Stamme der Streptomyces gehört und aus einer Probe zersetzter
Scheunenstreu isoliert wurde, kultiviert.
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Es wurde gefunden, daß diese Kultur einen außerordentlich guten Nährboden
für die Erzeugung von Vitamin B12 bildet.
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Die Medien wurden mit einem Milliliter der oben beschriebenen Kultur
beimpft und auf einem Schüttler während 4 Tage bei 28° gebrütet. Am Ende dei Fermentation
wurde die gesamte LLD-Aktivität der Kultur durch eine titrimetrische L.lactis-Dorner-Untersuchung
bestimmt. Das Vitamin B12 und die diesem verwandten Stoffe wurden extrahiert und
quantitativ wie im Beispiel i mittels der chromatographischen Papierstreifenmethode
bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle festgehalten
| L. lactis Einheiten pro |
| Untersuchung Milliliter Kultur |
| Zusatz zum Medium Einheitenvon |
| LLD- B12 und B12 |
| Aktivität ähnlichen |
| der Kultur Stoffen |
| Keine ................. 23,800 14,800 |
| o,i Teile auf i Million CN- 27,60o 17,000 |
| i,o Teile auf i Million CN- 37,200 21,300 |
| io Teile auf i Million CN- 30,500 27,000 |