DE884856C - Verfahren zur Herstellung von den anti-perniciosa-anaemischen Faktor enthaltenden Zubereitungen - Google Patents

Description

• Verfahren zur Herstellung von den anti-perniciosa-anämischen Faktor enthaltenden Zubereitungen Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von den anti-perniciosa-anämischen Faktor enthaltenden Zubereitungen.
• Es ist bekannt, daß an anti-perniciosa-anämischem Faktor reiche Extrakte aus Leber hergestellt werden können, und verschiedene Verfahren sind bekanntgeworden, welche bei der Herstellung derartiger Extrakte verwendet werden können. Es wurde auch angegeben, daß der anti-perniciosa-anämischt Faktor von bestimmten Mikroorganismen erzeugt wird.
• Es wird angenommen, daß der anti-perniciosaanämische Faktor wenigstens zwei und möglicherweise mehr getrennte und unterschiedliche aktive Verbindungen enthält. Eine dieser Verbindungen, eine rote, kristalline Substanz, wurde kürzlich als Vitamin B12 bekannt. Der hier verwendete Ausdruck aktives Material bezieht sich auf jede einzelne oder auf eine Mischung von mehr als einer der obenerwähnten getrennten und unterschiedlichen Verbindungen und umfaßt so jegliches Material mit anti-perniciosa-anämischer Wirksamkeit, unabhän-gig von der Zahl an unterschiedlichen aktiven Verbindungen, welche das Material enthalten kann.
• Es wurde bereits beschrieben, daß eine Anzahl von Mikroorganismen den aktiven Bestandteil bei der Züchtung aufoder in einem geeigneten Nährmed,ium erzeugt und daß der erzeugte aktive Bestandteil in solchen Kulturflüssigkeiten in verschiedenen Formen vorkommen kann. So kann der aktive Bestandteil in Form eines Komplexes (-der selb,st keine anti#pernkläsa-ahämische Wirksamkeit besitzt) in der Kulturflüssigkeit gelöst auftreten, während er in anderen Fällen innerhalb. des Orga.-nismus verbleibt. Es wul#den-.tugh Fälle gefunden,-,-wo. der aktive Bestandteil in beiden Formen auftritt. Die-vorliegende- Erfindung betrifft die Behandlung einer mikrobiologischen Kulturflüssigkeit, in -welcher der -aktiie Bestandteil ganz oder teilweise als ein Komplex vorkommt. Eine derartige Kulturflüssigkeit soll im folgenden als eine geeignete Kulturflüssigkeit bezeichnet werden. Im folgenden sollen Methoden beschrieben werden, durch die eine geeignete Kulturflüssigkeit erkannt: werden kann. Es sei jedoch hier festgestellt, daß ein bevorzugtes Beispiel für eine geeignete Kuliurflüssigkeit eine solche darstellt, auf oder in welcher Strepto-myces griseus gezüchtet worden war. -Gegenstand de# vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur Erzeugung von Zubereitungen aus einem. geeigneten Nährboden, welche freies aktives Material enthalten. Die weitere Reinigung des freien aktiven Materials aus den erfindungsgemäg erzeug' ten Zubereitungen bildet keinen Tdzil der vorliegenden Erfindung. Es sei jedoch hier festgestellt, daß die Reinigung durch bekannte Methoden, wie z. B. Absorp>tion. an.Aktivkohle, Lösungsmittelextraktion U. dgl., bewirkt. werden kann.
• Die Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß freies aktives Material selbst aus dem erwähnten Komplex durch Wärmebehandlung in Gegenwart von Wasser abgelöst werden kann. So wurde gefunden, daß Zubereitungen, -welche freies aktives Material enthalten, erhalten werden können, indem man eine geeignete-mikrobiologische, wie hier definierte K,_ulturflüssigkeit einer Wärmebehandlung unterwirft. Alternativ kann der Komplex von der geeigneten mikrobiologischen Kulturflüssigkeit z. B -. durch Ausfällung abgetrennt und das so abgetrennte Material der Wärmebehandlung in Gegenwart von Wasser unterworfen werden. Die vorliegende Erfindung betrifft daher eine Methode -zur Erzeugung von Zubereitungen, welche das wie oben definierte aktive Material enthalten, wobei eine geeignete, wie hier definierte Kulturflüssigkeit der Einwirkung von Wärme in Gegenwart von Wasser unterworfen wird, so daß das freie aktive Material aus dem Komplex in Freiheit gesetzt und aus der entstehenden Mischung extrahiert wird.
• Gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung wird der Komplex- aus der Kulturflüssigkeit z. B. durch Ausfällung isoliert und das isolierte Material der Wärmebehandlung in Gegenwart von Wasser unterworfen.
• Die Wärmebehandlung- soll unter solchen Bedingungen -durchgeführt -werden, daß das gesamte aktive Material in Freiheit gesetzt wird, ohne daß eine wesentliche Zersetzung desselben stattfindet. In jedem -speziellen Fall sollten Vorversuche durchgeführt -werden, -um die optimalen Temperatur- und Z eitbedingungen der Behandlung zu bestimmen, wobei die Menge an vorhandenem aktivem Material z-. --B. -durch -mikrobiologische Prüfung unter Verweridung-von Lactobacillus lactis Dorner bestimmt werden kann [vgl. -- C - uthberts - on, Biochein Bd. -46, Procedings Seite V (1949)1 - So wird die gewünschte Reaktion um so schneller stattfinden, je höher die Temperatur ist, his Temperaturenerreicht werden, bei denen eine Zersetzung des aktiven Materials stattfindet und die Ausbeute sinkt.
• Eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens besteht darin, daß man die Kulturflüssigkeit Temperaturen oberhalb etwa 8o' und vorzugsweise in dem Bereich von go' bis zu ihrem Siedepunkt bei atmosphärischem Druck unterwirft. So kann da-s Verfahren beispielsweise zweckmäßig durchgeführt werden-, indem die Kulturflüssigkeit bei Atmosphärendruck etwa io Minuten lang gekocht wird.
• Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Effin'dung wurde'gefu-nden, daß der Komplex aus der Kulturflüssigkeit durch Behandlung mit Ammoniumsulfat ausgefällt werden kann. Die so, erhaltene Ausfällung enthält einen verhältnismäßig hohen Anteil an aktivem Material in Form des inaktiven Komplexes. Das -aktive Material selbst kann dann erhalten werden, indem die erhaltene Ausfällung einer Wärmebehandlung in Gegenwart von Wasser gemäß der Erfindung unterworfen wird.
• Das Arrimdnitimsulfat wird vorzugsweise als feste- Substanz -oder in Form einer vorzugsweise in der Kälte gesättigten wäßrigen Lösung zugegeben. Im allgemeinen ist es erwünscht, daß die Konzentrdtion des Ammoniumsulfats in der endgültigen Mischung 1/3 bis 2/3 gesättigt ist. Falls erwünscht, kann die Kulturflüssigkeit durch Verdampfung unter vermindertem Druck bei einer Temperatur, welche zur Spaltung des Komplexes nicht ausreicht, konzentriert werden, z. B. his zu einem FeststoffgehaJt von etwa 25%, Die Behandlung mit Ammoniumsulfat wird vorzugsweise in im wesentlichen neutralen Lösungen durchgeführt, obwohl gefunden wurde, daß eine Ausfällung über weite pli-Bereiche, z. B. von pli 2 bis io erhalten werden kann.
• Die Ausfällung kann von der Kulturflüssigkeit durch eine geeignete Methode, z. B. durch Zentrifugieren, abgetrennt werden. Es ist jedoch vorzuziehen, diese Abtrennung durch Filtration unter Verwendung einer Filterhilfe, wie z. B. Papierpülpe, zu bewirken.
• # -Ob eine Kulturflüssigkeit, in welcher ein Mikroorganismus gewachsen war, aktives Material in Form eines inaktiven Komplexes enthält oder nicht, muß durch Durchführung von Vorprüfungen bestimmt werden.
• So kann z. B. eine gegebene Kulturflüssigkeit, in welcher ein Mikroorganismus gewachsen war, auf 25 % Feststoffgehalt konzentriert, zentrifugiert und die entstandene klare Lösung mit halbgesättigter Ammoniumsulfatlösung behandelt und die erhaltene Ausfällung in Wasser gekocht werden, Die entstehende- Lösung kann dann auf aktives Material vorzugsweise durch klinischen Test oder alternativ durch mikrobiologische Prüfung unter Verwendung vonLactobacillas lactis Dorner geprüft werden. Es sei hiererwähnt, daß diemikrobiologischePrüfungkeine völlig sichere Methode zur Bestimmung, ob eine ge-gebene Substanz anti-perniciosa-anämische Wirksamkeit besitzt, ist, da bestimmte Substanzen, z. B. das Desoxyribosid des Thymius, welches keine autiperniciosa-anämischeWirksamkeit besitzt, auf diese Prüfung ansprechen können. Die einzige sichere Methode zur Bestimmung, ob eine gegebene Substanz anti-perniciosa.-anämische Wirksamkeit sitzt, ist die klinische Prüfung. Es sei jedoch erwähnt, daß der inikrobiologische Test einen Hinweis ergibt, welcher in den meisten Fällen zuverlässig ist. . Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie zu beschränken.
• Beispiel i Es wurde gefunden, daß eine zellfreie Kulturflüssigkeit eines Streptomyces-grisens-Stammes bei der Prüfung durch die Becher-Platten-Methode unter Verwendung von Lactobacillus lactis Dorner als Testorganismus kein aktives Material enthält. 1816 1 dieser Flüssigkeit wurden in einem Destillationsgefäß unter vermindertem Druck bei einer 45' nicht übersteigenden Temperatur konzentriert, bis das Volumen auf 2271 vermindert war. Diese konzentrierte Flüssigkeit enthielt noch kein aktives Material gemäß dem obigen Test. Die Flüssigkeit wurde schnell auf 95" erhitzt, bei dieser Temperatur io Minuten lang gehalten und dann abgekühlt. Es erfolgte eine Ausfällung von Protein, und die fil- trierte Flüssigkeit enthielt 1,2 7/ccm aktives Material, wie durch den obigen Test geme-ssen wurde. Beispiel 2 Ein zellfreies Filtrat einer Kultur von Streptomyces griseus wurde auf 1/, seines ursprünglichen Volumens im Vakuum konzentriert. Zu 1 1 dieser konzentrierten Lösung wurden unter Rühren 370 9 festes Ammoniumsulfat zugegeben, was hinreichend ist, um die Lösung bezüglich des Ammoniumsulfats annähernd lialbgesättigt zu machen. Es wurde gefunden, daß der pli-Wert der Lösung dann 6,o betrug. Die feinverteilte Ausfällung wurde durch eine Schicht von Papierpülpe abfiltriert. Die ursprüngliche konzentrierte Lösung und auch das Filtrat zeigten bei mikrobiologischern Test kein aktives Material. Nach io Minuten langem Kochenjedochzeigtedieursprünglichekonzentrierte Lösung ein Alztivitätsäquivalent von 1,3 mg/1 an aktivem Material und das Filtrat ein Aktivitätsäquivalent von o,25 mg/l. Die Ausfällung wurde in ioo cem Wasser suspendiert und die: Mischung io Minuten lang gekocht. Sie wurde dann abgekühlt und filtriert. Dieses Filtrat enthielt IJ3 mg aktives Material mikrobiologisch geschätzt. Dies bedeutet eine Ausbeute von 87 0/0 in bezug auf den ursprünglich vorhandenen. Wirkstoff. Dieses Filtrat enthielt etwas Ammoniumsulfat, das durch Konzentrieren und Zugabe von 4 Volumina Alkohol entfernt wurde. Die gesamten festen Substanzen in diesem endgültigen Filtrat waren nur etwa 11" der in der ursprünglichen Flüssigkeit vorhandenen.
• Dieser Versuch wurde mit einem anderen Teil derselben konzentrierten Flüssigkeit wiederholt, jedoch wurde der pli-Wert nach der Zugabe des Amnioniumsulfats auf pl, = 4,o eingestellt. Die Ausbeute an aktivem Material aus der Ausfällung betrug nach dem Suspendieren in Wasser und Ko,chen 8 1 %.
• Ein dritter Teil wurde bei pli = 8,o in ähnlicher Weise behandelt und ergab eine Ausbeute von 65 %. Ein weiterer Teil derselben konzentrierten Flüssigkeit wurde mit einem gleichen Volumen hall)-gesättigter Ammoniumsulfatlösung vermischt, d. h. die Mischung war annähernd 1/4-geSättigt bezüglich des Ammoniumsulfats. Der pli-Wert wurde auf 6,o eingestellt. 35 % des ursprünglich vorhandenen aktiven Materials wurden in der Ausfällung nach dem Suspendieren in Wasser und Kochen gefunden. Beispiel 3 Streptomyces grisetis wurde in einem großen Fermentierungsbe#hälter, wie er für die industrielle Erzeugung von Streptomycin verwendet wird, gezüchtet. Ein Teil der Kulturflüssigkeit einschließlich des suspendierten Mycels wurde auf pH = 4,2 eingestellt und 1/2 Stunde lang gekocht. Durch mikrobiologischen Versuch zeigte sich, daß das Filtrat das Äquivalent von o,9 Vitamin B pro 12 Kubikzentimeter enthielt.
• Ein anderer Teil wurde nach der Entfernung des suspendierten Mycels durch Filtration ähnlich behandelt. Dieser Teil enthielt das Äquivalent von o,8 y Vitamin B12 pro. Kubikzentimeter.
• Es wurde gefunden, daß ein dritter Te#il des Mediums einschließlich des Mycels bei der direkten Prüfung und ohne das Kochen das Äquivalent von insgesamt mir 10,3 Y freiem aktivem Material enthielt.
• Beispiel 4 Der Organismus Aero#bacter aerogenes wurde in einer Kulturflüssigkeit vom pli-Wert 2,7, bestehend aus i % Fleischextrakt »Lab. Lemco«, i (l/o Pepton, 0,5% Natriumchlorid, 2 Millionstelteile Kobalt als Kohaltsulfat, Rest destilliertes Wasser, 48 Stunden gezüchtet, wonach durch mik-robiologische Prüfung gefunden wurde, daß die Kulturflüssigkeit inaktiv war. Teile der den suspendierten Organismus enthaltenden Kulturflüssigkeit wurden auf p,1 = 4,0 eingestellt und io bZW. 20 bzw. 30 Minuten lang mit Dampf behandelt. Andere Teile wurden auf pl, = 6,8 eingestellt und i o bzw. 2o bzw. 30 M imiten lang mit Dampf behandelt, während ein anderer Teil einer 15 Minuten langen Autoklavbehandlung bei 0,7 kg/cm2 Druck unterworfen wurde. Es wurde gefunden, daß alle diese Behandlungen dazu gedient hatten, #die gesamten anti-perniciosa-anämischen Faktoren in Freiheit zu setzen, welche in freier mikrob,iologisch aktiver Form vorhanden waren.

Claims (1)

1. PATENTANSPRÜCHE: i. Verfahren zur Herstellung von, Zubereitun-.gen, die den anti-perniciosa-anämischen Faktor in leicht isolierbarer Form enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß eine Kulturflüssigkeit von z. B. Streptomyces griseus oder Aerobacter aerogenes einer Wärmehehandlung unterworfen und der anti-perniciosa-anämische Wirkstoff in bekannter Weise abgetrennt wird. 2.AbänderungdesVerfahrensnachAnspruchi, dadurch gekennzeichnet, daß der inaktive Komplex aus der Kulturflüssigkeit durch Zugabe von Ammoniumsulfat ausgefällt und dann der Wärmebehandlung in Gegenwart von Wasser unterworfen wird. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Ammoniumsulfat zu der Lösung in fester Form oder als gesättigte wäßrige Lösung zugegeben wird. 4. Verfahren nach Anspruch:2 Oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Kulturflüssigkeit mit ,dem Ammoniumsulfat zu 1/s bis 2/s in der Kälte gesättigt wird. 5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Wärm,ebehandlung bei einer Temperatur oberhalb 8o' und vorzugsweise oberhalb go' durchgeführt wird. 6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet I daß die Wärmebehandlung durch Kochen bei atmosphärischem Druck bewirkt wird.