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Verfahren zur Herstellung von den anti-perniciosa-anämischen Faktor
enthaltenden Zubereitungen Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung
von den anti-perniciosa-anämischen Faktor enthaltenden Zubereitungen.
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Es ist bekannt, daß an anti-perniciosa-anämischem Faktor reiche Extrakte
aus Leber hergestellt werden können, und verschiedene Verfahren sind bekanntgeworden,
welche bei der Herstellung derartiger Extrakte verwendet werden können. Es wurde
auch angegeben, daß der anti-perniciosa-anämischt Faktor von bestimmten Mikroorganismen
erzeugt wird.
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Es wird angenommen, daß der anti-perniciosaanämische Faktor wenigstens
zwei und möglicherweise mehr getrennte und unterschiedliche aktive Verbindungen
enthält. Eine dieser Verbindungen, eine rote, kristalline Substanz, wurde kürzlich
als Vitamin B12 bekannt. Der hier verwendete Ausdruck aktives Material bezieht sich
auf jede einzelne oder auf eine Mischung von mehr als einer der obenerwähnten getrennten
und unterschiedlichen Verbindungen und umfaßt so jegliches Material mit anti-perniciosa-anämischer
Wirksamkeit, unabhän-gig von der Zahl an unterschiedlichen aktiven Verbindungen,
welche das Material enthalten kann.
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Es wurde bereits beschrieben, daß eine Anzahl von Mikroorganismen
den aktiven Bestandteil bei der Züchtung aufoder in einem geeigneten Nährmed,ium
erzeugt und daß der erzeugte aktive Bestandteil in solchen Kulturflüssigkeiten in
verschiedenen Formen vorkommen kann. So kann der aktive Bestandteil in Form eines
Komplexes (-der
selb,st keine anti#pernkläsa-ahämische Wirksamkeit
besitzt) in der Kulturflüssigkeit gelöst auftreten, während er in anderen Fällen
innerhalb. des Orga.-nismus verbleibt. Es wul#den-.tugh Fälle gefunden,-,-wo. der
aktive Bestandteil in beiden Formen auftritt. Die-vorliegende- Erfindung betrifft
die Behandlung einer mikrobiologischen Kulturflüssigkeit, in -welcher der -aktiie
Bestandteil ganz oder teilweise als ein Komplex vorkommt. Eine derartige Kulturflüssigkeit
soll im folgenden als eine geeignete Kulturflüssigkeit bezeichnet werden. Im folgenden
sollen Methoden beschrieben werden, durch die eine geeignete Kulturflüssigkeit erkannt:
werden kann. Es sei jedoch hier festgestellt, daß ein bevorzugtes Beispiel für eine
geeignete Kuliurflüssigkeit eine solche darstellt, auf oder in welcher Strepto-myces
griseus gezüchtet worden war. -Gegenstand de# vorliegenden Erfindung ist die Schaffung
eines Verfahrens zur Erzeugung von Zubereitungen aus einem. geeigneten Nährboden,
welche freies aktives Material enthalten. Die weitere Reinigung des freien aktiven
Materials aus den erfindungsgemäg erzeug' ten Zubereitungen bildet keinen Tdzil
der vorliegenden Erfindung. Es sei jedoch hier festgestellt, daß die Reinigung durch
bekannte Methoden, wie z. B. Absorp>tion. an.Aktivkohle, Lösungsmittelextraktion
U. dgl., bewirkt. werden kann.
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Die Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß freies aktives Material
selbst aus dem erwähnten Komplex durch Wärmebehandlung in Gegenwart von Wasser abgelöst
werden kann. So wurde gefunden, daß Zubereitungen, -welche freies aktives Material
enthalten, erhalten werden können, indem man eine geeignete-mikrobiologische, wie
hier definierte K,_ulturflüssigkeit einer Wärmebehandlung unterwirft. Alternativ
kann der Komplex von der geeigneten mikrobiologischen Kulturflüssigkeit z. B
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durch Ausfällung abgetrennt und das so abgetrennte Material der Wärmebehandlung
in Gegenwart von Wasser unterworfen werden. Die vorliegende Erfindung betrifft daher
eine Methode -zur Erzeugung von Zubereitungen, welche das wie oben definierte aktive
Material enthalten, wobei eine geeignete, wie hier definierte Kulturflüssigkeit
der Einwirkung von Wärme in Gegenwart von Wasser unterworfen wird, so daß das freie
aktive Material aus dem Komplex in Freiheit gesetzt und aus der entstehenden Mischung
extrahiert wird.
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Gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung wird der Komplex- aus der
Kulturflüssigkeit z. B. durch Ausfällung isoliert und das isolierte Material der
Wärmebehandlung in Gegenwart von Wasser unterworfen.
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Die Wärmebehandlung- soll unter solchen Bedingungen -durchgeführt
-werden, daß das gesamte aktive Material in Freiheit gesetzt wird, ohne daß eine
wesentliche Zersetzung desselben stattfindet. In jedem -speziellen Fall sollten
Vorversuche durchgeführt -werden, -um die optimalen Temperatur- und Z eitbedingungen
der Behandlung zu bestimmen, wobei die Menge an vorhandenem aktivem Material z-.
--B. -durch -mikrobiologische Prüfung unter Verweridung-von Lactobacillus
lactis Dorner bestimmt werden kann [vgl. -- C - uthberts - on, Biochein
Bd. -46, Procedings Seite V (1949)1 -
So wird die gewünschte Reaktion um so
schneller stattfinden, je höher die Temperatur ist, his Temperaturenerreicht
werden, bei denen eine Zersetzung des aktiven Materials stattfindet und die Ausbeute
sinkt.
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Eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens besteht darin, daß
man die Kulturflüssigkeit Temperaturen oberhalb etwa 8o' und vorzugsweise in dem
Bereich von go' bis zu ihrem Siedepunkt bei atmosphärischem Druck unterwirft. So
kann da-s Verfahren beispielsweise zweckmäßig durchgeführt werden-, indem die Kulturflüssigkeit
bei Atmosphärendruck etwa io Minuten lang gekocht wird.
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Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Effin'dung wurde'gefu-nden,
daß der Komplex aus der Kulturflüssigkeit durch Behandlung mit Ammoniumsulfat ausgefällt
werden kann. Die so, erhaltene Ausfällung enthält einen verhältnismäßig hohen Anteil
an aktivem Material in Form des inaktiven Komplexes. Das -aktive Material selbst
kann dann erhalten werden, indem die erhaltene Ausfällung einer Wärmebehandlung
in Gegenwart von Wasser gemäß der Erfindung unterworfen wird.
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Das Arrimdnitimsulfat wird vorzugsweise als feste- Substanz -oder
in Form einer vorzugsweise in der Kälte gesättigten wäßrigen Lösung zugegeben. Im
allgemeinen ist es erwünscht, daß die Konzentrdtion des Ammoniumsulfats in der endgültigen
Mischung 1/3 bis 2/3 gesättigt ist. Falls erwünscht, kann die Kulturflüssigkeit
durch Verdampfung unter vermindertem Druck bei einer Temperatur, welche zur Spaltung
des Komplexes nicht ausreicht, konzentriert werden, z. B. his zu einem FeststoffgehaJt
von etwa 25%, Die Behandlung mit Ammoniumsulfat wird vorzugsweise in im wesentlichen
neutralen Lösungen durchgeführt, obwohl gefunden wurde, daß eine Ausfällung über
weite pli-Bereiche, z. B. von pli 2 bis io erhalten werden kann.
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Die Ausfällung kann von der Kulturflüssigkeit durch eine geeignete
Methode, z. B. durch Zentrifugieren, abgetrennt werden. Es ist jedoch vorzuziehen,
diese Abtrennung durch Filtration unter Verwendung einer Filterhilfe, wie z. B.
Papierpülpe, zu bewirken.
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# -Ob eine Kulturflüssigkeit, in welcher ein Mikroorganismus
gewachsen war, aktives Material in Form eines inaktiven Komplexes enthält oder nicht,
muß durch Durchführung von Vorprüfungen bestimmt werden.
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So kann z. B. eine gegebene Kulturflüssigkeit, in welcher ein Mikroorganismus
gewachsen war, auf 25 % Feststoffgehalt konzentriert, zentrifugiert und die
entstandene klare Lösung mit halbgesättigter Ammoniumsulfatlösung behandelt und
die erhaltene Ausfällung in Wasser gekocht werden, Die entstehende- Lösung kann
dann auf aktives Material vorzugsweise durch klinischen Test oder alternativ durch
mikrobiologische Prüfung unter Verwendung vonLactobacillas lactis Dorner geprüft
werden. Es sei hiererwähnt, daß diemikrobiologischePrüfungkeine
völlig
sichere Methode zur Bestimmung, ob eine ge-gebene Substanz anti-perniciosa-anämische
Wirksamkeit besitzt, ist, da bestimmte Substanzen, z. B. das Desoxyribosid des Thymius,
welches keine autiperniciosa-anämischeWirksamkeit besitzt, auf diese Prüfung ansprechen
können. Die einzige sichere Methode zur Bestimmung, ob eine gegebene Substanz anti-perniciosa.-anämische
Wirksamkeit sitzt, ist die klinische Prüfung. Es sei jedoch erwähnt, daß der inikrobiologische
Test einen Hinweis ergibt, welcher in den meisten Fällen zuverlässig ist.
. Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie
zu beschränken.
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Beispiel i Es wurde gefunden, daß eine zellfreie Kulturflüssigkeit
eines Streptomyces-grisens-Stammes bei der Prüfung durch die Becher-Platten-Methode
unter Verwendung von Lactobacillus lactis Dorner als Testorganismus kein aktives
Material enthält. 1816 1
dieser Flüssigkeit wurden in einem Destillationsgefäß
unter vermindertem Druck bei einer 45' nicht übersteigenden Temperatur konzentriert,
bis das Volumen auf 2271 vermindert war. Diese konzentrierte Flüssigkeit
enthielt noch kein aktives Material gemäß dem obigen Test. Die Flüssigkeit wurde
schnell auf 95" erhitzt, bei dieser Temperatur io Minuten lang gehalten und
dann abgekühlt. Es erfolgte eine Ausfällung von Protein, und die fil-
trierte
Flüssigkeit enthielt 1,2 7/ccm aktives Material, wie durch den obigen Test geme-ssen
wurde. Beispiel 2 Ein zellfreies Filtrat einer Kultur von Streptomyces griseus wurde
auf 1/, seines ursprünglichen Volumens im Vakuum konzentriert. Zu 1
1 dieser konzentrierten Lösung wurden unter Rühren 370 9
festes Ammoniumsulfat
zugegeben, was hinreichend ist, um die Lösung bezüglich des Ammoniumsulfats annähernd
lialbgesättigt zu machen. Es wurde gefunden, daß der pli-Wert der Lösung dann 6,o
betrug. Die feinverteilte Ausfällung wurde durch eine Schicht von Papierpülpe abfiltriert.
Die ursprüngliche konzentrierte Lösung und auch das Filtrat zeigten bei mikrobiologischern
Test kein aktives Material. Nach io Minuten langem Kochenjedochzeigtedieursprünglichekonzentrierte
Lösung ein Alztivitätsäquivalent von 1,3 mg/1 an aktivem Material und das Filtrat
ein Aktivitätsäquivalent von o,25 mg/l. Die Ausfällung wurde in ioo cem Wasser suspendiert
und die: Mischung io Minuten lang gekocht. Sie wurde dann abgekühlt und filtriert.
Dieses Filtrat enthielt IJ3 mg aktives Material mikrobiologisch geschätzt. Dies
bedeutet eine Ausbeute von 87 0/0 in bezug auf den ursprünglich vorhandenen.
Wirkstoff. Dieses Filtrat enthielt etwas Ammoniumsulfat, das durch Konzentrieren
und Zugabe von 4 Volumina Alkohol entfernt wurde. Die gesamten festen Substanzen
in diesem endgültigen Filtrat waren nur etwa 11" der in der ursprünglichen Flüssigkeit
vorhandenen.
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Dieser Versuch wurde mit einem anderen Teil derselben konzentrierten
Flüssigkeit wiederholt, jedoch wurde der pli-Wert nach der Zugabe des Amnioniumsulfats
auf pl, = 4,o eingestellt. Die Ausbeute an aktivem Material aus der Ausfällung betrug
nach dem Suspendieren in Wasser und Ko,chen 8 1 %.
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Ein dritter Teil wurde bei pli = 8,o in ähnlicher Weise behandelt
und ergab eine Ausbeute von 65 %. Ein weiterer Teil derselben konzentrierten
Flüssigkeit wurde mit einem gleichen Volumen hall)-gesättigter Ammoniumsulfatlösung
vermischt, d. h. die Mischung war annähernd 1/4-geSättigt bezüglich des Ammoniumsulfats.
Der pli-Wert wurde auf 6,o eingestellt. 35 % des ursprünglich vorhandenen
aktiven Materials wurden in der Ausfällung nach dem Suspendieren in Wasser und Kochen
gefunden. Beispiel 3
Streptomyces grisetis wurde in einem großen Fermentierungsbe#hälter,
wie er für die industrielle Erzeugung von Streptomycin verwendet wird, gezüchtet.
Ein Teil der Kulturflüssigkeit einschließlich des suspendierten Mycels wurde auf
pH = 4,2 eingestellt und 1/2 Stunde lang gekocht. Durch mikrobiologischen
Versuch zeigte sich, daß das Filtrat das Äquivalent von o,9 Vitamin B pro 12 Kubikzentimeter
enthielt.
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Ein anderer Teil wurde nach der Entfernung des suspendierten Mycels
durch Filtration ähnlich behandelt. Dieser Teil enthielt das Äquivalent von o,8
y Vitamin B12 pro. Kubikzentimeter.
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Es wurde gefunden, daß ein dritter Te#il des Mediums einschließlich
des Mycels bei der direkten Prüfung und ohne das Kochen das Äquivalent von insgesamt
mir 10,3 Y freiem aktivem Material enthielt.
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Beispiel 4 Der Organismus Aero#bacter aerogenes wurde in einer Kulturflüssigkeit
vom pli-Wert 2,7, bestehend aus i % Fleischextrakt »Lab. Lemco«,
i (l/o Pepton, 0,5% Natriumchlorid, 2 Millionstelteile Kobalt als Kohaltsulfat,
Rest destilliertes Wasser, 48 Stunden gezüchtet, wonach durch mik-robiologische
Prüfung gefunden wurde, daß die Kulturflüssigkeit inaktiv war. Teile der den suspendierten
Organismus enthaltenden Kulturflüssigkeit wurden auf p,1 = 4,0 eingestellt
und io bZW. 20 bzw. 30 Minuten lang mit Dampf behandelt. Andere Teile wurden
auf pl, = 6,8 eingestellt und i o bzw. 2o bzw. 30 M imiten lang mit
Dampf behandelt, während ein anderer Teil einer 15 Minuten langen Autoklavbehandlung
bei 0,7 kg/cm2 Druck unterworfen wurde. Es wurde gefunden, daß alle diese
Behandlungen dazu gedient hatten, #die gesamten anti-perniciosa-anämischen Faktoren
in Freiheit zu setzen, welche in freier mikrob,iologisch aktiver Form vorhanden
waren.