DE1000963C2 - Verfahren zur Herstellung von biologisch aktiven, Vitamine der B-Gruppe enthaltenden Zubereitungen - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

PATENTSCHRIFT 1 000 AN MELDETAG:

BEKANNTMACHUNG
DER ANMELDUNG
UND AUSGABE DER
AUSLEGESCHRIFT:

AUSGABE DER
PATENTSCHRIFT:

kl. 30 h 2/20

INTERNAT. KL. A 61 K

21. AUGUST 19 5 4

17. JANUAR 1957 2 5. JULI 1957

'AUSLEGESCHRIFT

1000 963 (N 9368 IV a/3Oh)

Die Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von biologisch aktiven, Vitamin B₁₂ enthaltenden Zubereitungen, insbesondere von Cobalamiineiweiß, in dem ein. Vitamin der B₁₂-Gruppe chemisch an den Faktor gebunden ist, der für diese Vitamine das größte Bindung.svermögen hat von allen Faktoren, die in der Schleimhaut des tierischen· Verdauungssystems vorkommen.

Die täglich von den Patienten mit perniciöser Anämie zusammen mit der Nahrung aufgenommene Menge Vitamin B₁₂ könnte zur Ausheilung der Anämie ausreichen, wenn sie durch die Verdauungsorgane hinreichend resorbiert würde. Dieses ist jedoch nicht der Fall, da der Intrinsicfaktor nach Castle vollständig oder fast vollständig im Magensaft fehlt.

Darüber hinaus enthält die Darmflora von Patienten mit perniciöser Anämie eine große Anzahl von Bakterien, welche Vitamine der B₁₂-Gruppe im großen Ausmaß absorbieren, so daß dem Körper praktisch kein Vitamin B₁₂ resorbiert werden kann.

Die Erfindung führt zu Zubereitungen, die Vitamine der B₁₂-Gruppe in einer solchen Kombination mit einem Initestinalschleirnhautfaktor aufweisen, daß sie durch diese Bakterien nicht angegriffen werden können. Diese Zubereitungen können zur Behandlung von Sprue, Säuglingsanämie, Makroeytische Anämie der Kleinkinder und von anderen Krankheiten, die auf Vitamin B₁₂ ansprechen, dienen. Lösungen dieser die Vitamine der B₁₂-Gruppe enthaltenden; Kombinationen können, wie bekannt, in ungereinigtem Zustand hergestellt werden, z. B. durch Zugabe eines Vitamins der B₁₂-Gruppe zu einem Extrakt tierischer Organe, z.B. aus dem Pylorus, dem Duodenum oder anderen Teilen des Verdauungssystems, insbesondere aus deren Schleimhaut. Diese Organe enthalten, wie bekannt, eine biologisch wirksame Substanz, die mit diesen Vitaminen eine Verbindung zu bilden vermag, in der sie nicht mehr als Wachstumsfaktor für gewisse Bakterien, wie Lactobaziillus' lactis Dorner und Lactobazillus Leichmannii, dienen können.

. Im Hauptpatent 957 160 ist ein Verfahren zur Herstellung von Zubereitungen beschrieben worden, in denen eine Komponente aus der Schleimhaut des Verdauungssystems mit Vitamin B₁₂ kombiniert ist. Hiernach werden wäßrige Lösungen dieser Kombinationen mit einer organischen, auf unter 0° gekühlten Flüssigkeit vermischt, die mit Wasser mischbar, gegenüber der Kombination indifferent ist und diese wird bei 0° ausgefällt.

Es wurde ein neues, verbessertes Verfahren gefunden, das erlaubt, die noch unreinen Fällungen aus den gemäß dem obigen Verfahren gewonnenen Kombinationen aus den Vitaminen der B₁₂-Gruppe und dem Schleimhautfaktor unter Gewinnung von Cobalamin-Verfahren zur Herstellung von biologisch aktiven, Vitamine der B₁₂-Gruppe

enthaltenden Zubereitungen

Zusatz zum Patent 957 160
Das Hauptpatent hat angefangen am 17. Dezember 1962

Patentiert für:

N. V. Organon, Oss (Niederlande)

Beanspruchte Priorität:
V. St. v. Amerika vom 21. 8. 1953

Dr. Jan Lens, Groesbeek,

und Dr. Harry Gerard Wijmenga, Oss (Niederlande), 20

sind als Erfinder genannt worden

proteinen zu reinigen. Hierbei werden als Zwischenprodukte neue Vitamin-B₁₂-Zubereitungen erhalten, die bei oraler Verabreichung an Patienten mit perniciöser Anämie in Dosen von nur 2 mg oder sogar noch weniger überraschend wirksam sind.

Mittels des Verfahrens nach der Erfindung wird außerdem eine bisher unbekannte Gruppe von metallhaltigen Proteinen gewonnen, nämlich die Cobalaminproteine, die das Metall Kobalt enthalten

Nach dem Verfahren wird eine wäßrige Lösung einer gemäß Hauptpatent 957 160 gewonnenen Kombination aus einem Schleimhautfaktor und einem Vitamin der B₁₂-Gruppe zunächst einer fraktionierten Fällung mit einem Alkanol mit nicht mehr als 2 C-Atomen unterworfen, wobei die gebildete Fällung bei Alkoholkonzentrationen von zwischen 40 und 60 Volumprozent abgetrennt wird. Diese Fällung wird dann in wäßrige Lösung gebracht und mit Ammoniumsulfat fraktioniert ausgesalzen, wobei die gefällten Fraktionen bei einer Sättigung der Lösung von etwa 0,7 bis 1 abgeschieden werden. Danach wird die Fällung mit Hilfe einer Elektrophorese in wäßrigem Medium in mehr oder weniger stark gefärbte Fraktionen zerlegt, worauf aus der am stärksten rotgefärbten Fraktion dlas Cobalaminprotein mach; bekannten Verfahren isoliert wird. Das Cobalaminprotein kann auf üblichem Wege, z.B. durch Dialyse, gereinigt werden, worauf es vom Lösungsmittel befreit wird.

Auf Grund der Untersuchungsergebnisse (vgl. das

Beispiel) stellt das anfallende rote Protein eine wohl-

definierte chemische Verbindung dar, nämlich ein Cobalaminprotein. Auf Grund der zwecks Identifizierung durchgeführten Reaktionen kann als sicher angenommen werden, daß es sich hierbei um ein Mucoprotein handelt.

Dies.. Verbindungen werden von Bakterien, welche diese Vitamine in freiem Zustande als Wachstumsfaktor ausnutzen, nicht angegriffen.

Diese Verbindungen, d. h. sowohl die Zwischenprodukte wie das reine Cobalaminprotein — das letztgenannte jedoch zusammen mit dem Intrinsicfaktor —, erwiesen sich bei oraler Verabreichung an· Patienten mit perniciöser Anämie ebenso hochwirksam, wie Vitamin B₁₂ allein.

In einer Anzahl von Fällen war es möglich, daß nach Behandlung des Patienten mit Cobalaminprotein, in dem der Cobalaminteil ein so radioaktives Kobalt enthielt, daß das Cobalamin eine Radioaktivität unter anderem in der Leber aufzeigt, mindestens der radioaktive Teil des Cobalaminproteins resorbiert wurde.

Somit stellen diese Verbindungen eine neue Quelle von Vitamin B₁₂ für die orale Anwendung von Vitamin B₁₂ dar.

Aus der Bildung dieser Cobalaminproteine kann geschlossen werden, daß der Schleimhautfaktor nicht nur ein starkes Bindungsvermögen für das Vitamin B₁₂ selbst (dem Cyanocobalamin), sondern auch für andere Glieder der Vitamin-B₁₂-'Gruppe, z. B. für das Oxycobalamin, besitzt.

Obgleich in diesen Verbindungen der Faktor vorhanden ist, der für die Vitamine der B₁₂-Gruppe das stärkste Bindungsvermögen von allen Verbindungen ausweist, die in der Schleimhaut des Verdauungssystems vorkommen, hat es den Anschein, daß. dieser Faktor nicht der von Castle angegebene Intrinsicfaktor ist, da das reine Cobalaminprotein, das gemäß dem vorliegenden Verfahren erhalten wird, keinerlei klinische Wirksamkeit aufweist, im Gegensatz zu den weniger reinen Zwischenprodukten des vorliegenden Verfahrens. Es besteht die naheliegende Vermutung, daß der Intrinsicfaktor nach Castle nicht eine einzelne Verbindung darstellt, sondern aus mehreren Faktoren zusammengesetzt ist, von denen die Proteinkomponente des Cobalaminproteins, dem Faktor mit dem stärksten Bindungsvermögen für das Vitamin der B₁₂-Gruppe, nur einen Teil bildet.

Bei der Herstellung von Cobalaminprotein gemäß der Erfindung werden die verschiedenen Stufen vorzugsweise in der im Beispiel angegebenen Reihenfolge durchgeführt. Die Elektrophorese wird vorzugsweise als die letzte Stufe angewendet, da die Elektrophorese von großen Materialmengen auf technische Schwierigkeiten stößt. Im Prinzip ist es jedoch möglich, die Elektrophorese vor der Fraktionierung in 40 bis 60 volumprozentiger alkoholischer Lösung oder vor der fraktionierten Fällung mit Ammoniumsulfat durchzuführen.

Das Ausgangsmaterial des Beispiels kann auch in Wasser gelöst und dann einer fraktionierten Alkohol· fällung unterworfen werden. Die Produkte aus einer solchen Fraktionierung haben fast die gleichen Eigenschaften, wie die aus Lösungen, in physiologischer Kochsalzlösung erhaltenen¹. Im . allgemeinen sind Alkoholkonzentrationen zwischen etwa 40 und etwa 60 Volumprozent zur Fällung einer an rotem Cobalaminprotein stark angereicherten Fraktion geeignet.

Um die geeignetste Alkoholkonzentration zu bestimmen, kann der Alkohol allmählich zur Lösung des Ausgangsmaterials zugegeben werden und so die Konzentration, ibei der eine Rotfärbung der Fällung auf-. tritt, bestimmt werden. Hierzu entnimmt man nach Zugabe einer neuen Alkobolmenge Proben und bestimmt deren Färbung. In der Regel ist die Farbe der Fällung A, die mit 40%igem Alkohl erhalten wird, 5 Orange, während die gewünschte aktive Alkoholfraktion B rot ist. Eine Erhöhung der Alikoholkonzentration auf oberhalb etwa 60 Volumprozent führt zu einer weißen Fällung C, die manchmal in Abhängigkeit von dem verwendeten Ausgangsmaterial rosa gefärbt sein kann. Auf diese Weise kann die gewünschte Fraktion mit dem höchsten Vitamin-B₁₂-Gehalt isoliert werden.

Ein besonders günstiges Fraktionierergebnis wird mit Äthanol erhalten. Die Fraktion, die bei einer.

Alkoholkonzentration von 43,7 bis 56 Volumprozent, gefällt wird, enthält das gewünschte Endprodukt in der höchsten Konzentration. Alle Manipulationen werden vorzugsweise bei einer Temperatur unter 3° durchgeführt. Die geeignetste Temperatur ist ■— 5°.

Es wurde festgestellt, daß bei Verwendung einer langsam laufenden Zentrifuge während der Fraktionierung mit Ammoniumsulfat große Mengen aktiVe Produkte in der Mutterlauge neben der »Sulfatfällung B« zurückbleiben. Wenn jedoch eine schnell laufende Zentrifuge verwendet wird, enthält die Mutterlauge nur eine geringfügige Menge Cobalaminprotein. Für die Elektrophorese ist eine Vorrichtung geeignet, die eine Zerlegung in eine hinreichende Anzahl von Fraktionen ermöglicht oder mindestens diejenigen Fraktionen, welche das neue Cobalaminprotein enthalten, gemeinsam aufgefangen werden können. Zum. Beispiel wird eine Elektrophoresevorrichtung verwendet, die ein Celhilosepulver als Träger enthält. Aber auch. Stärke, Glaspulver oder andere inerte Träger können verwendet werden. Als Puffer können z. B. Lösungen von Acetaten, Phosphaten oder Barbituraten verwendet werden in Abhängigkeit zum PH-Wert, bei dem man die Elektrophorese durchführen will. Die p_H-Wert-Grenzen sind hier nicht kritisch und können von 3 bis 9, vorzugsweise zwischen 6 und 8,5, liegen.

Das Folgende ist eine Beschreibung der Herstellung der aktiven Zwischenprodukte, und des Endproduktes.

· .

Beispiel
A. Herstellung des Ausgangsmaterials

Für den Vergleich der Konzentration der'Ausgangslösungen und der Endprodukte wird eine provisorische Einheit des aktiven Bestandteiles eingeführt. Diese Einheit U ist die Gewichtsmenge (Milligramm), die gerade fähig ist, ein y-Vitamin B₁₂ zu binden oder in Gegenwart von überschüssigem Vitamin B₁₂ ein y-Vitamin B₁₂ gebunden hat.

230 ecm wäßriges Konzentrat, das aus Schweinemagenschleimhaut und Vitamin B₁₂ hergestellt war und 2,240 U und 2,24 mg Vitamin B₁₂ enthielt, wurden langsam¹ in das Dreifache seines Volumens an 96°/oigem Alkohol, der auf — 5° gekühlt war, unter kräftigem Rühren eingegossen, wobei die Temperatur unter 0° gehalten wurde. Nach 3stündigem Rühren wird die erhaltene Fällung zentrifugiert, gewaschen und anschließend in 20 1 wasserfreiem Äther verrührt.

Nach 24stündigem Stehen wurde das Gemisch erneut zentrifugiert, und die Fällung wurde getrocknet. Die Ausbeute beträgt 959 mg. Die Zubereitung enthält insgesamt 2,035 mg gebundenes Vitamin B₁₂, was bedeutet, daß 0,472 mg der Zubereitung einer provisorisehen Einheit entsprechen.

B. Herstellung des Cobalaminproteins und der
Zwischenprodukte

101 g der obigen Zubereitung, die insgesamt etwa 127 mg Vitamin B₁₂ und etwa 123 mg gebundenes Vitamin: B₁₂ enthielt, werden in 2 1 physiologische Salzlösung mit ungefähr 0,9% NaCl bei etwa 0° eingebracht. Das Gemisch wird bei etwa 3° 16 Stunden gerührt. Die erhaltene Suspension wird mit einer Sharplesszentrifuge zentrifugiert, wobei das ungelöste Material von der Lösung abgetrennt wurde. Die ungelöste Substanz wird wieder in 500 ecm. physiologische Salzlösung bei 3° ,suspendiert und dann zentrifugiert. Die kombinierten Salzlösungen werden dann durch Zugabe von 96%igem Äthanol auf 43,7 Volumprozent Alkohol verdünnt. Während der Zugabe des Äthanols darf die Temperatur des Gemisches etwa 3° nicht übersteigen. Vorzugsweise wird die Temperatur bei etwa —5° gehalten. Die erhaltene Fällung A wird durch Zentrifugieren in einer gekühlten Zentrifuge, vorzugsweise bei einer Temperatur von. etwa —5°, abgetrennt. Sie wird mehrmals mit — 5° kaltem 43,7 volumprozentigem Alkohol gewaschen. Es wird dann weiter etwa —5° kalter Alkohol bis auf etwa 56 Volumprozent zugegeben. Die resultierende Fällung wird bei etwa —5° durch Zentrifugieren abgetrennt. Diese Fällung B wird· mehrmals mit auf etwa —5° abgekühltem 56 volumprozentigem Äthanol gewaschen. Sie wird in; Eiswasser gelöst, bei niedriger Temperatur zentrifugiert und lyophiliei t. Die Gesamtausbeute dieser Fällung B beträgt 20,5 g. Von dem ursprünglich insgesamt vorhandenen Vitamin B₁₂ werden etwa 77 mg in der Fällung B gewonnen und von dem gebundenen Vitamin B₁₂ etwa 74,2 mg. Diese Fällung hat eine rote Farbe und ist bei der Behandlung von perniciöser Anämie sehr wirksam. Eine Tagesdosis von etwa 7,24 γ gebundenem Vitamin B₁₂, entsprechend etwa 2 mg Fällung B, ergibt ein ausgezeichnetes Resultat bei Patienten mit perniciöser Anämie. Infolge der Alkoholfraktionierung stieg der Vitamin-B₁₂-Gehalt dieser Älkoholfraktion B auf etwa das Zweifache.

Der Vitamin-B₁₂-Gehalt der Älkoholfraktion B kann durch Fraktionierung der Fällung mit Ammoniumsulfat weiter erhöht werden. Hierzu werden 20 g Alkoholfraktion B mit 1900 ecm Wasser bei etwa 3° 16 Stunden gerührt. Der pn-Wert des Gemisches liegt zwischen 6,5 und 7. Das Gemisch wird zentrifugiert, und die kleine Menge Rückstand wird entfernt. Das Filtrat wird auf 0° abgekühlt, und es werden 868 g Ammoniumsulfa't zugefügt. Die Lösung wird etwas trübe. Eine weitere Zugabe von 124 g Ammoniumsulfat erhöht die Ammoniumsulfatkonzentratdon der Lösung auf einen Sättigungsgrad von 0,8. Diese Fällung, welche als Sulfatfällung A bezeichnet wird, wird durch Zentrifugieren gesammelt und mit einer wäßrigen Ammoniumsul'fatlöeung mit einem Sättigungsgrad von 0,8 gewaschen.

Das Filtrat und die Waschwässer werden vereinigt, und es wird weiter Ammoniumsulfat bis zur vollständigen Sättigung zugegeben. Während dieser fraktionierten Fällung wird die Temperatur bei etwa 0° gehalten. In keinem Falle soll sie während der Fällung und dem Zentrifugieren 3° übersteigen.

Die erhaltene rotgefärbte »Sulfatfällung B« wird in Wasser gelöst und gegen destilliertes Wasser dialysiert, bis das Dialysat keine Reaktion auf Sulfationen mehr ergibt.

Die dialysierte Lösung wird dann lyophiliert. Eswerden 3,10 g Sulfatfällung B erhalten mit insgesamt 7,88 mg Vitamin/B₁₂ je Gramm, von denen 7,75 mg

in gebundener Form vorliegen. Da das Ausgangsmaterial, die Alkoholfällung B, 3,76 mg Vitamin B₁₂ je Gramm enthält, ist der Vitamin-B₁₂-Gehalt der Sulfatfällung B durch die Fällung mit Ammoniumsulfat etwa, zweimal so groß geworden.

Es kann bemerkt werden, daß eine Sättigung mit Ammoniumsulfat auf 0,7 bis 1 am geeignetsten! ist.

Die nach Entfernung der Sulfatfällung B erhaltene rote Mutterlauge ergab bei der Dialyse und Lyophilierung 3,9 g Pulver, hernach als Mutterlaugensulfat bezeichnet. Dieses enthält etwa 6,6 mg Vitamin B₁₂ je Gramm. Ein Teil des Vitamins B₁₂ verbleibt also komplex in der Mutterlauge, wahrscheinlich auf Grund der Verwendung einer langsam laufenden Zentrifuge.

Beide, »Sulfatfällung« und »Mutterlaugensulfat«, stellen hochaktive Vitamin-B₁₂-Zubereitungen, dar, die bei der Behandlung von perniciöser Anämie sehr wirksam sind.

Aus diesen aktiven Substanzen können neue und bisher unbekannte kobalthaltige Eiweißverbindungen gewonnen werden, wenn man die Sulfatfällung B und das Mutterlaugensulfat der Elektrophorese aussetzt. Hierzu werden 2 g Gemisch aus der erhaltenen Sulfatfällung B und Mutterlaugensulfat mit 2 ecm 0,05 m,o-

^a5 larer Acetatpufferlösung mit einem p_H-Wert 6 und mit der erforderlichen Menge Whatman-Standard-Cellulosepulver zu einer Paste vermischt. Diese Paste wird z. B. in die Zone 20 einer ZonenelektrophoTeseeinirichtung mit insgesamt dreißig Abschnitten von je 0,5 cm Dicke eingeführt. Die benutzte Apparatur ist in Fig. 1 und 2 schematisch dargestellt. In Fig. 1 wird der aus ■einem, indifferenten glasartigen Kunststoff hergestellte Zonenbehälter für das Überführungsmittel (Abmessungen 15X5X5 cm) gezeigt, der an seinen beiden Enden Platten α in Form von Seitzfilter Sorte K aufweist. Als Überführungsmittel wird mit einer Pufferlösung gesättigtes Cellulosepulver b benutzt, Die einzelnen Zonen sind durch Filtrierpapierblätter c von denselben Abmessungen wie der Querschnitt des Zonenbehälters voneinander getrennt. Die Zone m, die sich zwischen zwei Aluminiumfolien d befindet, an deren Außenseite ebenfalls Papierblätter vorgesehen sind, wird zum Einfüllen der zu trennenden Mischung ebenso wie die Alumin'iumstreifen d herausgenommen, worauf die obenerwähnte Paste in die Zone, die auf jeder Seite noch von einem Filierpapier begrenzt ist, .eingefüllt wird. Diese Zone 20 der Vorrichtung soll ganz mit der Paste aufgefüllt werden. Sodann wird der Zonenbehälter in den Elektrophoreseapparat aingebracht.

In Fig. 2 ist die Anordnung schematisch gezeigt. Der Zonenbehälter 1 befindet sich zwischen den mit Pufferlösung vollgesaugten Schwammstreifen 2 und 3, die in die Pufferlösungen 4 und 5 eintauchen. Die Platinelektroden 6 und 7 sind mit einer Gleiehstromquelile verbunden. Zur Durchführung der Trennung wird eine Spannung von 150 Volt, die einen Strom von etwa 100 Milliampere ergibt, 21 Stunden lang angelegt. Dann werden die Abschnitte ihrer Farbe nach zerlegt.

Gruppe A, enthaltend die Abschnitte an der Anodenseite, die am wenigsten gefärbt sind;

Gruppe B, enthaltend die Abschnitte an der Anodenseite mit den drei am stärksten gefärbten Abschnitten; . Gruppe C, enthaltend die drei am stärksten gefärbten Abschnitte;

Gruppe D, enthaltend die gefärbten Abschnitte, die , sich auf der Kathodenseite der G^ruPP^!e C befinden;

Gruppe E stellt den Abschnitt 20 dar, d. h. den Abschnitt, der ursprünglich das der Elektrophorese unter-

worfene Material enthielt; ' '

Gruppe F, enthaltend die elektroendosmotischen Abschnitte auf der Kathodenseite von dem Abschnitt 20.

Diese verschiedenen Gruppen werden in einer Ch.romatographierröhre mit Wasser eluiert. Für jeden Abschnitt der Vorrichtung werden ungefähr 40 ecm Wasser für die Eluierung verwendet. Die Elektrophorese sowie die Eluierung werden bei etwa 15° durchgeführt. Nach der Eluierung werden die Eluate gegen destilliertes Wasser, das ein Adsorptionsmittel für Vitamine der B₁₂-Gruppe, wie z. B. Kieselgur, enthält, 94 bis 144 Stunden dialysiert. Die Temperatur während der Dialyse wird vorzugsweise bei etwa + 3° gehalten. Nach der Dialyse werden die Gruppen lyophiliert, wobei die Gruppe C in einer Menge von etwa 0,796 g· erhalten wurde. Eine Untersuchung durch Papierelektrophorese bewies, daß das Produkt homogen ist. Dieses Produkt enthält jedoch etwas unlösliches Material.. Es werden daher 680 mg davon wiederum in Wasser gelöst, durch ein G5-Sinterglaisftlter filtriert und lyophiliert. Es werden 666 mg erhalten. Wenn man diese Verbindung einer weiteren Dialyse seiner wäßrigen Lösung bei einem p_H-Wert von 5,6 des destillierten Wassers, gegen das die Dialyse durchgeführt wird, unterwirft und schließlich lyophiliert, erhält man 607 mg einer Verbindung miit •den folgenden Eigenschaf tem:

Die neue Verbindung, das Cyanocobalaminprotein, besitzt eine rote Farbe. Der Vitam,in-B₁₂-Gehalt entspricht einem Verhältnis von 1 Mol Vitamin B₁₂ zu 1 Mol dieser Verbindung. Es enthält 1 Atom Kobalt je Molekül. Der Vitamin-B₁₂-Gehait beträgt etwa 13 //mg entsprechend dem obenerwähnten Verhältnis von 1 Mol Vitamin B₁₂ zu 1 Mol bindendes Protein.

Das Vitamin B₁₂ liegt in der neuen Verbindung in gebundener Form vor, so> daß es von Lactobazillus Leichmannii nicht als Wachstumsfaktor verwendet werden kann. Das Produkt ist nicht dialysierbar. Sein Absorptionsspektrum zeigt die meisten Spitzen des Vitamins B₁₂, Cyanocobalamin, mit geringen Veränderungen. Die Spitzen von Cyanocobalamin bei 410 und 361 ηιμ werden bei 413 bzw. 363 ιημ gefunden. Die Cyanocobalaminspitze bei 307 πιμ ist kaum sichtbar. Die sehr hohe Spitze bei 278 ηιμ ist durch den Proteinteil des Moleküls bedingt. Die Spitzen des Cyanocobalamin bei 518 und 550 πιμ sind ebenfalls vorhanden. Das Verhältnis zwischen der optischen Dichte bei 413 und 550 πιμ, d. h. D_il3/D_55Q beträgt etwa 0,5 während D_ses/D_5S0 etwa 3,6 und -D₂₇₈AD₅₅₀ etwa 8 beträgt. Die Verbindung ist eine hochmolekulare komplexe Verbindung mit einem Molekulargewicht von der Größenordnung von 100 000. Die Verbindung ist in Wasser und physiologischer Salzlösung löslich. Sie wird aus'den wäßrigen Lösungen bei einer Alkoholkonzentration von etwa 40% nicht gefällt, während sie bei einer Alkoholkonzentratiori zwischen etwa 40 und 60 Volumprozent bei einer Temperatur von —5° und einem p_H-Wert von etwa 7 gefällt wird. Diese Verbindung ist ein Mucoprotein, wie auis seiner Färbung mit Amidoschwarz 1OB (Verfahren von H a η η i g und Graßmann, Hoppe-Seylers Zeitschrift für physiologische Chemie, 290, S. 1 [1952]), entsprechend seinem Eiweißcharakter, und mit Perjodat und Fuchsin-Sulfitlösung (Verfahren von Koiw und Groenwall, J. Clin. Lab. Invest., 4, S. 244 [1952]) entsprechend seinem Polysaccharidcharakter folgt. Seine Beweglichkeit, gemessen in der Elektrophoreseeinrichtung nach Ti seIi us (Bewegungsgrenzverfahren), betrug in Phosphatpufferlösung bei p_H-Wert 7,7 und Ionenstärke 0,1 : absteigender Ast — 3 · 10~⁵ Cm²¹SeC^-14VoIt"¹. Die neue Verbindung als solche ist therapeutisch wirksam als Quelle für Vitamin B₁₂ bei oraler Verabreichung und ist bei Verabreichung mit Intrinsiicfaktorzubereitungen, die aus SchweinemagenpyloTUS, Duodenum und den Schleimhautteilen dieser Organe gewonnen wurden, von hoher

ίο Wirksamkeit bei Patienten mit perniciöeer Anämie. Diese Verbindung besitzt gegenüber Vitamin B₁₂ den Vorteil, daß sie nicht durch Mikroorganismen verzehrt wird. Der neue Komplex zeigt in seinem Absorptionsspektrum bei Zugabe von Kaliumcyanid bei einem alkalischen p_H-Wert keinerlei Veränderung. Vitamin B₁₂ allein, ohne die Mueoproteinkomponente, verändert sein Absorptionsspektrum durch Zugabe von Kaliumcyanid vollständig. Gleichfalls beeinträchtigt ein Kaliumcyanidzusatz die neue Verbindung biologisch nicht. Die neue Verbindung ist das erste \vobldefmierte kobalthaltige Protein, das hergestellt wurde. Eine pharmazeutische Zubereitung, die für die Behandlung von perniciöser Anämie geeignet ist, wird hergestellt, indem man 0,375 mg des neuen Cobalaminproteins mit etwa 1 g Schweinepylorus- oder -magen oder Duodenumschleimhaut oder der entsprechenden Menge wäßriger Extrakte, trockener Pulver und ähnlicher gereinigter Zubereitungen aus solchen Schleimhäuten zu Tabletten vermischt.

Die Menge der Schleimhautzubereitung kann sogar auf über 1 g erhöht werden, wobei der Überschuß im allgemeinen für den Patienten unschädlich iist.

Claims (4)

PATENTANSPRÜCHE:

1. Verfahren zur Herstellung von biologisch aktiven, Vitamine der B₁₂-<Gruppe enthaltenden Zubereitungen nach Patent 957 160, dadurch gekennzeichnet, daß man von dem bei dem Verfahren nach dem Hauptpatent anfallenden Niederschlag eine wäßrige Lösung herstellt, diese einer fraktionierten Fällung mit einem Alkanol mit nicht mehr als 2 C-Atomen unterwirft, den bei einer Alkoholkonzentration von etwa 40 bis etwa 60 Volumprozent anfallenden Niederschlag abtrennt, eine wäßrige Lösung dieser Fällung einem fraktionierten Aussalzen mit Ammoniumsulfat unterwirft, die gefällten Fraktionen bei einem Sättigungsgrad der Lösung von etwa 0,7 bis 1 abtrennt, die Niederschläge in wäßrigem Medium mittels Elektrophorese in mehr oder weniger stark gefärbte Fraktionen zerlegt und das Cobalaminprotein aus der am stärksten rotgefärbten Fraktion nach bekannten Verfahren isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekentih . zeichnet, daß die verschiedenen Verfahrensschritte bei einer Temperatur durchgeführt werden, die 3° nicht überschreitet und vorzugsweise bei —5° Hegt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei der fraktionierten Fällung Äthanol verwendet wird und die gebildete Fällung bei einer Äthanolkonzentration zwischen 43,7 und 56 Volumprozenit weiterverarbeitet wird.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, Jaß bei der Elektrophorese Cellulosepulver als Hilfsmittel verwendet wird.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

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