DE2333884C3 - Verfahren zum Herstellen von hochgereinigtem Humanalbumin - Google Patents

Description

dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe c) entweder zu der Albuminlösung, die einen Äthanolgehalt von 25% aufweist und auf Temperaturen unter Null, vorzugsweise auf —5 bis —10° C gekühlt ist, Trichloressigsäure bis zu einer Konzentration von 3 bis 1Ox 10~^J Mol/l zufügt oder daß man die Albuminlösung durch Versetzen mit Polyphosphorsäure ausfällt und den gebildeten Niederschlag abtrennt und ihn bis zu einer Proteinkonzentration von weniger als 10 g/l wieder auflöst oder daß man die Albuminlösung nur einengt, worauf man gegebenenfalls nach einer Klärung in der gekühlten Lösung einen Alkoholgehalt von etwa 75% und eine Trichloressigsäurekonzentration von 5 bis 8 χ 10~² Mol/l einstellt, den sich dabei bildenden Niederschlag entfernt, die Albumine durch Neutralisieren der gekühlten Lösung ausfällt und gegebenenfalls in Stufe d) die nach c) erhaltenen Albumine bis zu einer Konzentration von max. 50 g/l in Wasser löst, die Lösung bis zu einer Konzentration entsprechend 2—12 g/l Natriumcaprylat mit Caprylationen versetzt und diese nach Einstellen auf den pH-Bereich von 4,5 bis 5,5 auf Temperaturen von 52—64⁰C für die Dauer von mehr als einer halben Stunde erhitzt.

2. Verwendung des nach Anspruch 1 erhaltenen Albumins zum Herstellen von Transfusionsflüssigkeiten.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen von hochgereinigtem Humanalbumin aus gefrorener Placenta, Placentablut oder hämolysiertem Blut.

Es sind bereits Verfahren zur Herstellung von Human- oder Tieralbumin bekannt, die von Plasmalösungen unterschiedlicher Herkunft ausgehen. Keines dieser Verfahren hat es jedoch ermöglicht, ins Gewicht fallende Mengen von hochgereinigtem, nicht-denaturiertem Humanalbumin in wirtschaftlicher Weise herzustellen, vor allem in den Fällen, in denen das verwendete Ausgangsmaterial, wie gefrorene Placenta, Placentablut oder hämolysiertes Blut, von Anfang an zahlreiche Verunreinigungen enthält, die nicht in technisch befriedigender Weise entfernt werden konnten.

Insbesondere gelingt es nach bekannten Verfahren,

z. B. durch fraktionierte Ausfällung der Proteine mit Äthanol gemäß Taylor et al., Journal of American Chemical Society Bd. 78 (1956), Seite 1356, nicht, alle Hämoglobinspuren zu eliminieren. Daneben werden auch die Gruppensubstanzen und alkalische Phosphatasen durch bekannte Verfahren nicht erfaßt.

Die Erfindung o/fenbart nun ein Verfahren zum Herstellen von hoch gereinigtem Humanalbumin in technisch einfacher und wirtschaftlicher Weise, wobei

ίο große Mengen aus leicht zugänglichen Quellen, wie gefrorener Placenta oder hämolysiertem Blut, hergestellt werden können.

Dieses Humanalbumin kann zur Herstellung von als Transfusionsflüssigkeiten verwendbaren Proteinlösungen dienen, beispielsweise für die Behandlung von Schockzuständen oder für die Fälle, in denen eine lebensbedrohende Blutverminderung im Kreislauf erfolgt ist. Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene gereinigte Albumin wird von dem Empfänger-Organismus ganz besonders gut vertragen und löst keine Reaktionen aus, wie sie bei den bislang verwendeten Albuminpräparaten, die aus den erwähnten Ausgangsmaterialien hergestellt worden sind, auftreten.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Herstellen von hochgereinigtem Humanalbumin aus gefrorener Placenta, Placentablut oder hämolysiertem Blut durch

a) Abtrennen der Globuline aus dem Blut,

b) Entfernen des Hämoglobinanteils durch Fällung oder Adsorption aus der nach a) verbleibenden Flüssigkeit

c) Eliminierung der Enzyme bzw. Konzentrieren des gelösten Albumins

d) gegebenenfalls Entfernen von Restprotein außer J5 Albumin mittels Thermokoagulation in Gegenwart von Caprylationen und, falls erforderlich,

e) Reinigen der erhaltenen Albuminlösung durch Fällung, Dialyse und/oder Adsorption,

ίο ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe c) entweder zu der Albuminlösung, die einen Athanolgehalt von 25% aufweist und auf Temperaturen unter Null, vorzugsweise auf — 5 bis — 1O⁰C gekühlt ist, Trichloressigsäure bis zu einer Konzentration von 3 bis 10 χ 10~² Mol/l zufügt oder daß man die Albuminlösung durch Versetzen mit Polyphosphorsäure ausfällt und den gebildeten Niederschlag abtrennt und ihn bis zu einer Proteinkonzentration von weniger als 10 g/l wieder auflöst oder daß man die Albuminlösung nur einengt, worauf man gegebenenfalls nach einer Klärung in der gekühlten Lösung einen Alkoholgehalt von etwa 75% und eine Trichloressigsäurekonzentration von 5 bis 8 xlO~² Mol/l einstellt, den sich dabei bildenden Niederschlag entfernt, die Albumine durch Neutralisieren der gekühlten Lösung ausfällt und gegebenenfalls in Stufe d) die nach c) erhaltenen Albumine bis zu einer Konzentration von max. 50 g/l in Wasser löst, die Lösung bis zu einer Konzentration entsprechend 2—12 g/l Natriumcaprylat mit Caprylationen versetzt und diese nach Einstellen auf den pH-Bereich von 4,5 bis 5,5 auf Temperaturen von 52—64 C für die Dauer von mehr als einer halben Stunde erhitzt.

Die Eliminierung des Hämoglobins kann insbesondere in Gegenwart einer Äthanol-Konzentration von unter 60% durch Zusatz eines Halogenkohlenwasserstoffes, wie Chloroform, erfolgen. Sie kann indessen auch durch Zugabe eines Halogenkohlenwasserstoffes ohne Alkohol oder nach irgendeinem anderen an sich

bekannten Verfahren erfolgen.

Die Entfernung bzw. Eliminierung der Enzyme, wie der Phosphatasen, die insbesondere nach der Stufe der Hämogiobin-Eliminierung durchgeführt wird, wird zweckmäßig in Gegenwart einer Äthanol-Konzentration von unter 25% mittels Zusatz von Trichloressigsäure vorgenommen. Die Konzentration der Säure soll zwischen 3 und 10 χ 10~² Mol/l liegen, wobei die Säure zur Proteinlösung bei einer Temperatur von unter 0° C, vorzugsweise bei —5° bis — 1O⁰C, bis zur vollständigen Ausfällung der Proteine zugegeben wird.

Abgesehen von der Eliminierung der Enzyme ermöglicht diese Stufe zugleich, die Albuminmenge in Lösung beträchtlich zu konzentrieren, weil das Albumin ausfällt

In gewissen Fällen ist es auch möglich, die Fällung mit Trichloressigsäur-2 durch eine Fällung mit emer Polyphosphorsäure zu ersetzen.

Die Eliminierung der Blutgruppensubstanzen wird mit einer Äthanolkonzentration in der Größenordnung von 75%, bei einer Protein-Konzentration von weniger als 10 g pro Liter oder bis zu 10 g pro Liter unter Zusatz von Trichloressigsäure zur Lösung bei einer Temperatur von unter 0°C, z. B. —5° bis — 10⁰C, vorgenommen. Die Menge der Trichloressigsäure soll 5 bis 8 χ 10~² Mol/l betragen. Die erhaltene Ausfällung wird verworfen. In diesem Stadium sind die Gruppensubstanzen eliminiert.

Dies ermöglicht gleichzeitig die Eliminierung der alkalischen Phosphatasen, so daß evtl. die vorangehende Eliminierung der Phosphatasen fortgelassen werden kann. Sie wird dann zweckmäßig durch eine einfache Konzentrierung der Proteine ersetzt.

An diese Reinigung wird beim erfindungsgemäßen Verfahren eine weitere Stufe angeschlossen, die darin r> besteht, die letzten, evtl. noch vorhandenen Spuren von heterogenen Proteinen und ebenso die denaturierte Albuminfraktion durch eine Thermokoagulation in Gegenwart von Caprylationen entsprechend 2 bis 12 g/l Natriumcaprylat zu eliminieren.

Insbesondere führt man die Thermokoagulation, nachdem man erforderlichenfalls den Proteingehalt auf einen Wert von höchstens 50 g/l und das pH auf einen Wert zwischen 4,5 und 5,5 eingestellt hat, bei einer Temperatur von 52°C bis 64°C, am besten zwischen 56⁰C und 6O⁰C, durch. Man verwendet Natriumcaprylat in einer Konzentration von 2 bis 12 g/l je nach der Protein-Konzentration. Die Dauer der Thermokoagulation beträgt mehr als V₂ Stunde. Die Thermokoagulation in Gegenwart von Caprylationen ist an sich aus der w US-PS 27 05 230 bekannt. Im vorliegenden Fall erlaubt sie die Eliminierung von Resthämoglobin bis zu 99,6%.

Nach einer verbesserten Ausführungsform der Erfindung ist es auch möglich, eine Klärung vorzusehen, und zwar insbesondere vor der Entfernung der Gruppensubstanzen.

Diese Klärung erfolgt durch Zugabe eines Siliciumdioxydgels, wie »Aerosil«, und anschließendes Zentrifugieren, wobei die gesammelte Fällung verworfen wird. Die Aerosil-Konzentration kann größenordnungsmäßig insbesondere 0,2% betragen.

Das Albumin ist von den Gruppensubstanzen und den alkalischen Placenta-Phosphatasen befreit und verursacht beim perfundierten Hund keinen hypotensiven Effekt. Durch seinen niedrigen Hämoglobin-Gehalt ist μ es den meisten aus Plasma stammenden Albuminen gleichwertig, ja sogar überlegen.

Dieses Albumin kann für therapeutische Zwecke beim Menschen ohne jede Nachteile verwendet werden, und es entspricht allen Kriterien, die man zur Kontrolle des Albumins anzuwenden pflegt

Die Durchführung der Erfindung wird anhand eines Beispiels veranschaulicht

Beispiel

Aus einem Ausgangsmaterial von etwa 7 Tonnen Placenta bereitet man sich zunächst in an sich bekannter Weise die nach Fällung der Globuline mit Äthanol verbleibende überstehende Flüssigkeit

(1) Eliminierung des Hämoglobins

Man gibt zum alkoholischen Überstand, dessen Äthanolgehalt 25% und dessen Protein-Gehalt ungefähr 58 g pro kg Placenta beträgt. Chloroform in solcher Menge, daß das Gesamtvolumen etwa 17 000 Liter beträgt und das Ganze einen Chloroformgehalt von 0,6% aufweist Das pH wird auf einen Wert zwischen 6,0 und 6,1 eingestellt.

Aus der überstehenden Flüssigkeit, die unter diesen Bedingungen auf einer Temperatur von etwa 24⁰C gehalten wird, scheidet sich ein Niederschlag aus, der abgetrennt und verworfen wird.

Durch diesen Umstand wird das Volumen des Überstandes auf ungefähr 16 000 Liter verringert. Zu diesem Zeitpunkt liegt die Protein-Ausbeute größenordnungsmäßig bei 8 g/kg, und der größte Teil des Hämoglooins ist eliminiert worden.

(2) Eliminierung der Enzyme

Zu den 16 000 Litern der überstehenden Flüssigkeit, die — wie oben angegeben — erhalten wurden und die ungefähr 25% Äthanol enthalten, gibt man nach Senken der Temperatur auf — 8⁰C Trichloressigsäure zu, bis eine Konzentration von 4,2 χ 10~² Mol/Liter eingestellt ist.

Die Menge der Proteine liegt in der Größenordnung von 4g/Liter.

Man erhält auf diese Weise eine Fällung in einer Menge von ungefähr 1000 kg, während der Überstand in einer Volur.ienmenge von etwa 15 000 Liter verworfen wird. Zu diesem Zweck bedient man sich vorzugsweise hermetisch verschlossener Zentrifugen mit kontinuierlichem Ausstoß der ausgefällten Masse.

Auf diese Weise sind die alkalischen Phosphatasen und andere Enzyme, wie die Transaminasen, eliminiert oder denaturiert worden.

Die ausgefällte Masse wird sofort wieder in verdünnter Sodalösung in Lösung gebracht bis zum neutralen pH, und das Volumen wird mit Wasser auf 1300 Liter aufgefüllt.

(3) Klärung

Die wieder gelöste Fällung wird mit Siliciumdioxydpulver (»Aerosil«) versetzt, bis ein Aerosil-Gehalt von ungefähr 0,2% eingestellt ist. Es bildet sich so ein Niederschlag von annähernd 50 kg, der abzentrifugiert wird. Die überstehende, geklärte Lösung entspricht dann einer Protein-Ausbeute von ungefähr 6,5 g/kg.

(4) Eliminierung der Gruppensubstanzen

Es ist darauf hinzuweisen, daß Gruppensubstanzen in der Hauptsache aus Polysacchariden der Wände der roten Blutkörperchen bestehen, die während der Hämolyse in Lösung gegangen sind und eliminiert werden müssen.

Die geklärte Lösung wird zu diesem Zweck in einem

Gemisch aus Äthanol und Trichloressigsäure derart verdünnt, daß der Alkohol-Anteil etwa 75% und der Trichloressigsäure-Anteil ungefähr 8 χ 10-² Mol/Liter beträgt Der Protein-Gehalt liegt in der Größenordnung von 10 g/Liter. Die Temperatur wird auf ungefähr — 7° C gehalten, und es bildet sich ein Niederschlag in einer Menge von ungefähr 10 kg, der verworfen wird, und auf diese Weise sind die Gruppensubstanzen eliminiert worden. Diese Stufe vervollständigt gleichzeitig die Eliminierung evtL noch vorhandener rertlicher Enzyme.

Der Überstand, der ungefähr 8 g Proteine pro Liter enthält, wird filtriert Das pH wird auf einen Wert zwischen 6,5 und 7 eingestellt und die Temperatur ständig auf einem Wert zwischen —5° und — 10⁰C gehalten. Zu diesem Zeitpunkt bildet sich eine Albumin-Fällung, die abzentrifugiert wird.

Man erhält ungefähr 140 kg der Fällung, und die überstehende Flüssigkeit wird verworfen.

(5) Reinigung des Albumins

Die Fällung wird erneut in Wasser gelöst, bis eine Volumenmenge von ungefähr 280 Liter gebildet ist; die Protein-Ausbeute beträgt zu diesem Zeitpunkt 5 g/kg.

Nach einer Dialyse gegen destilliertes Wasser zwecks Eliminierung des Alkohols stellt man den Protein-Anteil auf 20 g/Liter ein, versetzt die Lösung mit einer Natriumcaprylatlösung bis zu einer Konzentration von 2,41 χ 10~² Mol/Liter (4 g/Liter), und man stellt z. B. mit einem Acetatpuffer das pH auf einen Wert zwischen 5,0 und 5,05.

Diese Lösung wird ungefähr 1 Stunde auf 60° C gehalten.

Die verbliebenen Proteine — außer dem Albumin — sind so koaguliert worden, und sie werden verworfen als Fällung mit den letzten Hämoglobin-Spuren und ebenso der denaturierten Albuminfraktion. Es bleibt allein das praktisch reine Albumin in Lösung.

Die überstehende Flüssigkeit, auf ungefähr 1750 Liter aufgefüllt, wird dann filtriert. Die verdünnte Albumin-Lösung wird danach konzentriert durch Versetzen mit Alkohol bis zu 40%, das pH auf 4,8 bis 4,9 und die Temperatur auf etwa -8° C eingestellt. Es bildet sich dann ein Niederschlag, der zunächst gesammelt und dann wieder in Lösung gebracht wird, und diese neue Lösung wird danach dialysiert und dann mit Aluminiumoxyd-Gel behandelt. Es erfolgt dann ein Konzentrieren im Vakuum, danach eine sterilisierende Filtration, die letztlich ungefähr 95 Liter einer konzentrierten Lösung von praktisch reinem Albumin von 200 g/l liefert. In dieser Endstufe beträgt die Protein-Ausbeute größenordnungsmäßig 2,7 g/kg. Die Farbe der Lösung gleicht derjenigen der meisten hochwertigen Lösungen, die aus Plasma gewonnen wurden.

Die anhand dieses Beispiels beschriebene Erfindung kann selbstverständlich in verschiedener Hinsicht mehrfach variiert werden. So können z. B. gewisse Vorstufen fortgelassen oder noch durch ähnliche, an sich bekannte Stufen ersetzt werden. Darüber hinaus kann die Reihenfolge, in der die vorangehend beschriebenen Stufen durchgeführt werden, modifiziert werden.

Vergleichsbeispiele

Es wurden Versuche gemäß Beispiel durchgeführt, wobei jedoch Abweichungen bei der Albuminreinigung zu Vergleichszwecken erfolgteti. Alle Versuche wurden mehrfach wiederholt Die Werte sind Mittelwerte der Messungen.
Es wurden von Lösungen ausgegangen, die eine Proteinkonzentration von 20Gew.-% hatten. Die Mengen an alkalischen Phosphatasen wurden in King-Armstrong-Einheiten je 100 cm³ ausgedrückt (Kind und King, M. Clin. Path. 1954, Bd. 7, Seite 322), die Gruppensubstanzen A und B wurden gemäß der

ίο Veröffentlichung des U.S. Department of Health, Education and Weif are »Minimum Requirements for Diphteria Toxoid« 4. revidierte Auflage vom 1. März 1947, Neudruck 11. Oktober 1956, Anfang B in ng/cm³ angegeben. Die Empfindlichkeit der Methode betrug 0,5 ng/cm³.

Es wurde das Beispiel wiederholt aber die Behandlung mit Natriumcaprylatlösung fortgelassen.

Nach der ersten Behandlung der Lösung nach der Abtrennung von Hämoglobin wurden folgende Werte gefunden:

alkalische Phosphatasen:
Gruppensubstanz A:
Gruppensubstanz B:

125-1000 ng/cm³

64-250 ng/cm³

Im Endprodukt wurden folgende Werte gefunden:

alkalische Phosphatasen: 0

Gruppensubstanz A: 0

Gruppensubstanz B: 0

Es ergibt sich, daß die alkalischen Phosphatasen bereits bei der ersten Behandlung mit Trichloressigsäure in 25% Äthanol entfernt werden, während die Gruppensubstanzen bei der zweiten Behandlung mit Trichloressigsäure in 75% Äthanol anfallen. Mit Kieselgel wurden diese Substanzen nur teilweise eliminiert Auch beim Fortlassen der Kieselgelbehandlung erfolgt die vollstängie Entfer-' nung mit Trichloressigsäure.

Das Beispiel wurde wiederholt, aber die letzte

Behandlung mit Trichloressigsäure in 75% Äthanol fortgelassen.

Am Endprodukt wurden folgende Werte gefunden:

alkalische Phosphatasen:
Gruppensubstanz A:
Gruppensubstanz B:

16—64 ng/cm³
16—64 ng/cm³

Somit wird durch die Kieselgelabsorption der Titer der Gruppensubstanzen zwar vermindert, diese werden aber nicht vollständig eliminiert

Das Beispiel wurde wiederholt, aber die erste Behandlung mit Trichloressigsäure in 25% Äthanol fortgelassen und an deren Stelle auf 30° C unter vermindertem Druck erwärmt und dadurch konzentriert. Außerdem wurde die Thermokoagulation mit Natriumcaprylat fortgelassen.
Das Endprodukt zeigte, daß die Gruppensubstanzen A und B einen Titer unter 0,5 ng/cm³ hatten und daß das Produkt frei von alkalischer Phosphatase war.

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Herstellen von hochgereinigtem Humanalbumin aus ge?rorener Placenta, Placentablut oder hämolysiertem Blut durch

a) Abtrennen der Globuline aus dem Blut,

b) Entfernen des Hämoglobinanteils durch Fällung oder Adsorption aus der nach a) verbleibenden Flüssigkeit

c) Eliminierung der Enzyme bzw. Konzentrieren des gelösten Albumins

d) gegebenenfalls Entfernen von Restprotein außer Albumin mittels Thermokoagulation in Gegenwart von Caprylationen und, falls erforderlich,

e) Reinigen der erhaltenen Albuminlösung durch Fällung, Dialyse und/oder Adsorption,