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Verfahren zur Gewinnung von Heparin
Die vorliegende Erfindung bezieht
sich auf ein neues Verfahren zur Gewinnung von Heparin aus einem Heparin-Protein-Gemisch,
insbesondere aus solchen Heparin-Protein-(;emischen, die durch Extraktion von tierischen
Geweben erhalten werden.
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Das Verfahren zur Gewinnung von Heparin aus tierischen Geweben,z.B.
aus Rinder- oder Schweinelunge, -leber und -muskeln, T?eruht auf den von Charles
und schott durchgeführten Arbeiten (J.
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Biol. Chem. Bd. 102, S. 425 [I933]) und auf den von ihnen in Roy.
Soc. Can. Trans.; Bd. 28, Abschnitt 5, S. 55 bis 58 (I934) gemachten Angaben.
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Das übliche Verfahren wird durch eine im allgemeinen in Gegenwart
voll zusätzlichem Wasser und bei erhöhter Temperatur durchgeführten Autolyse der
verwendeten tierischen Gewebe gekennzeichnet, der alkalischen Extraktion des autolysierten
Gemisches, die gewöhnlich mit Ammoniumsulfat und Natriumhydroxyd zum Abschluß gebracht
wird, Erwärmung des erhaltenen Gemisches auf annähernd go° und anschließender Filtration
zur Abtrennung der geronnenen Masse. Das erhaltene Filtrat ergibt beim Ansäuern
einen aus einem Protein-Heparin-Komplex bestehenden Niederschlag, der nach dem obenerwähnten
Verfahren der Einwirkung eines proteolytischen Enzyms, z. B. Trypsin, unterworfen
wird, wodurch ein enzymatischer Aufschluß des in dem Komplex enthaltenen dena-
turierten
Proteinstoffs ei reicht wird. Durch anschließende Behandlung des Aufschfußgem isches
mit einem Alkohol oder Aceton wird das gewünschte Heparin in roher Form ausgefällt.
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Das oben beschriebene Verfahren erfordert notwendigerweise eine lange
enzymatische Aufschlußdauer, in den meisten Fällen etwa 72 Stunden um den P rotein-Heparin-Komplex
wirksam zu zerstören.
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Weiterhin enthält das Heparin nach dem enzymatischen Aufschluß und
nach Ausfällung mit Aceton oder einem Alkohol noch die hydrolytischen Protein-Endprodukte,
wobei ein Heparin-Endprodukt von verhältnismäßig geringer Wirksamkeit anfällt.
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Es ist bereits bekannt (USA. Patentschrift (USA.-Patentschri ft 2
623 001), Heparin unter milden Bedingungen (ohne Autolyse, alkalische Extraktion
oder Erwärmung) derart zu extrahieren. daß eine Denaturierung des Proteins vermieden
und das Heparin aus dem erhaltenen wasserlöslichen Heparin-Komplex gewonnen wird,
indem man ein lösliches Salz bis zur Sättigung der komplexen Lösung unter Aufrechterhaltung
des zwischen 6.5 und IO liegenden p,-Wertes zusetzt, um das Protein auszufällen
und das Heparin aus der Lösung zu gewinnen. Es wird jedoch in der genannten Patentschrift
festgestellt, daß dieses Verfahren bei denaturiertem Protein nicht durchführbar
ist, und daß in dem von Charles u. a. (J. Biol. Chem. Bd. Io2, S. 425 [I9331) beschriebenen
Verfahren das an Heparin gebundene Protein nur durch Aufschluß mit Trypsin frei
gemacht werden kann.
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Es ist auch bekannt, aus tierischem Gewebe durch Auswaschen mit physiologischer
Kochsalzlösung und anschließende mehrtägige Behandlung mit schwach alkalischer physiologischer
Kochsalzlösung eine blutgerinnungsfördernde Substanz zu gewinnen. Ferner ist es
bekannt, zur Herstellung von reinem Heparin heparinhaltige Lösungen bei niedrigem
pE-Wert einer enzymatischen Spaltung und anschließend einer Trypsinverdauung zu
unterwerfen.
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Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist ein verbessertes Verfahren
zur Gewinnung von Heparin aus einem Heparin-Protein-Gemisch, das durch Autolyse
und alkalische Extraktion von heparinhaltigem Gewebe erhalten wird. Ein weiteres
Ziel der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung von Heparin, bei
dem der gewöhnlich zur Entfernung des Proteins angewendete enzymatische Aufschluß
umgangen wird. Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur
Gewinnung von Heparin, bei dem die zur Freimachung des Heparins aus tierischen Geweben
erforderliche Zeit verringert wird. Die Erfindung betrifft auch noch ein Verfahren,
nach dem man ein reineres Heparin mit größerer Antikoagulations-Wirksamkeit, ausgedrückt
in U.S.P.-Heparin-Einheiten je Milligramm, als bisher durch den enzymatischen Aufschluß
erhält.
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Es wurde gefunden, daß man Heparin aus einer Prntein-Hepann-Mischung
frei machen kann, wenn man der wäßrigen alkalischen Lösung der Protein-Heparin-Mischung
ein geeignetes Salz zusetzt, die so erhaltene wäßrig-alkalische Salzlösung zur Ausfällung
des Proteins ansäuert, den erhaltenen Niederschlag abtrennt und das gewünschte Heparin
aus dem Filtrat gewinnt.
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Wie bereits erwähnt, ist bereits bekannt Protein aus einer wäßrigen
Lösung eines Heparin-Protein-Komplexes auszufällen, indem man die Lösung mit einem
Salz sättigt; ein derartiges Verfahren läßt sich aber nicht durchführen, wenn das
Protein bei spielsweise durch Autolyse, alkalische Extraktion oder Wärmeeinwirkung
denaturiert worden ist.
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Weiterhin wird bei einem solchen Verfahren das Protein von dem Salz
ausgefällt, während dies bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung durch die
Säure geschieht und das Salz offenbar nur die Zusammenballung des Proteins und des
Heparins in der Ausfällung verhindert. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung
ist jedoch sowohl bei denaturierten wie bei unveränderten Proteinen anwendbar, so
daß eine genaue Überwachung der zuerst erfolgenden Gewebeextraktion zur Vermeidung
einer Denaturierung nicht erforderlich ist.
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Obgleich der Vorgang der Ausfällung noch nicht genau untersucht ist,
wird angenommen, daß das negative Ion des angewandten Salzes sich mit dem unerwünschten
Proteinanteil vereinigt, so daß bei der anschließenden Ansäuerung des Gemisches
das Protein frei von Heparin ausfällt. Man kann so nach dem Verfahren der vorliegenden
Erfindung den bei der bisherigen Arbeitsweise erforderlichen enzymatischen Aufschluß
umgehen. Nach dem neuen Verfahren ist ferner eine weitere Reinigung des Heparins
möglich, wenn dieses aus dem einen oder dem anderen Grunde mit Proteinen, insbesondere
denaturierten Proteinen, verunreinigt ist. Weiterhin kann man nach der Erfindung
äußerst reines Heparin durch eine verhältnismäßig einfache Behandlung des Filtrats
gewinnen, wie nachfolgend noch eingehender beschrieben werden wird.
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Nach einer Ausführungsart der vorliegenden Erfindung wird der in
üblicher Weise, beispielsweise nach dem oben zur Erläuterung beschriebenen Verfahren,
ausgefällte Protein-Heparin-Komplex in Wasser gelöst, das einen pH-Wert von mindestens
7. vorteilhafterweise sogar einen alkalischen pH-Wert von 8 bis einschließlich IO
hat. In dieser Mischung wird ein Salz gelöst, die erhaltene Salzlösung angesäuert
und zur Entfernung des ausgefällten Proteins zentrifugiert oder filtriert, worauf
man teilweise gereinigtes Heparin durch Zusatz von Alkohol, Aceton od. dgl. aus
dem Filtrat gewinnen kann. Die am besten geeigneten Salze sind wasserlösliche, dissoziierte
Salze, die mit anderen Bestandteilen des Systems keine Fällungen geben, die die
Salze oder das Heparin aus der Lösung entfernen würden. Beispiele für vorteilhaft
verwendbare Salze sind unter anderem die Alkali- (einschließlichAmmonium-) -citrate,
-halogenide, -acetate. -sulfate oder -thiocyanate oder die Erdalkalihalogenide,
-acetate oder -citrate.
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Die für das Verfahren günstigsten Salzkonzentrationen sollten mindestens
so hoch sein, daß eine Anionenkonzentration zwischen etwa I Mol je
Liter
Mischung und der Sättigung besteht, also z. B. mindestens I Mol Natriumchlorid,
Natriumthiocyanat, oder Natriumsulfat oder mindestens t/2 Mol Calciumchlorid. Das
für das Verfahren der vorliegenden Erfindung meistverwendete Salz ist Natriumchlorid,
und zwar in einer Anionenkonzentration von mindestens etwa 6o g, vorzugsweise etwa
IOO bis etwa I50 g/Liter. Falls bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die ursprünglichen
oder undenaturierten Proteine an das Heparin gebunden sind, kann man durch Verwendung
einer konzentrierten Salzlösung, insbesondere bei niedrigen Temperaturen, einen
Teil des Proteins ausfällen.
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Bei der nachfolgenden Ansäuerung wird jedoch das unerwünschte Protein
noch vollständiger entfernt, und man erzielt dementsprechend eine größere Ausbeute
an wertvollem Heparin.
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Die Temperatur der Proteinausfällung wird vorzugsweise zwischen etwa
20 und 600 gehalten. Man kann aber auch bei tieferen Temperaturen, bis herunter
zu etwa oO, öder bei höheren Temperaturen, bis zu etwa I00°, arbeiten. Erwärmung
während oder nach der Ansäuerung ist für die Koagulierung des Proteins nützlich.
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Man fällt das Protein aus, indem man beliebige starke Säuren, wie
Schwefelsäure, Salzsäure, Trichloressigsäure od. dgl., zusetzt. Jede beliebige Säure,
die den pH-Wert bis zur Koagulation des Proteins senken kann, ist brauchbar. Der
für diesen Zweck erforderliche pH-Wert liegt unter 3, mit Vorteil bei etwa 2,5.
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Nachdem das ausgefällte Protein durch Zentrifugieren oder sonstige
Filtration abgetrennt worden ist, behandelt man das Filtrat zur Gewinnung des Heparins.
Dies geschieht gewöhnlich durch Zusatz von Methyl- oder Äthylalkohol, Aceton oder
anderen mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln zur Ausfällung des Heparins.
Wenn das Salz, beispielsweise Natriumsulfat, in Äthylalkohol oder Aceton nicht sehr
löslich ist, empfiehlt es sich, zur Vermeidung von Verunreinigungen des ausgefällten
Heparins durch das Salz, das Filtrat zur Entfernung des unerwünschten Salzes vor
der Ausfällung des Heparins zu dialysieren. Man kann aber auch das mit dem Salz
verunreinigte ausgefällte Heparin nachträglich reinigen, indem man es wieder in
Wasser löst, diese Lösung zur Beseitigung des unerwünschten Salzes dialysiert und
das Heparin nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren zur Erreichung höherer Reinheit
mit Alkohol oder Aceton ausfällt.
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Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann man das ausgewählte Salz
auch dem ursprünglichen alkalischen Extrakt des Gewebes zusetzen; in diesem Fall
fällt das darin enthaltene Protein bei der ersten Ansäuerung aus. Das Protein kann
dann durch Filtrieren entfernt und das Heparin aus dem Filtrat durch den Zusatz
von Alkohol oder Aceton, wie oben beschrieben, ausgefällt werden.
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Das erfindungsgemäße Verfahren kann ferner zur weiteren Reinigung
von unreinem Heparin dienen. Zum Beispiel mischt man unreines Heparin mit irgendeinem
durch Säure gut ausfiällbaren Protein, z. B. mit Kasein, und säuert die Mischung
an, worauf die erhaltene, aus dem Heparin-Protein-Komplex bestehende Fällung nach
dem vorstehend beschriebenen Verfahren weiterbehandelt wird, um ein reineres Heparinprodukt
zu ergeben.
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Die folgenden Beispiele, in denen alle Teile, wenn nicht anders angegeben,
Gewichtsteile sind, dienen zur Erläuterung des Verfahrens und der Produkte nach
vorliegender Erfindung.
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Beispiel I Ein Gemisch von 100 Gewichtsteilen gemahlener Rindslunge
mit dem gleichen Gewicht Wasser blieb bei 370 20 Stunden lang stehen und wurde danach
mit IO Teilen Ammoniumsulfat und 3 Teilen Natriumhydroxyd in 45 Gewichtsteilen Wasser
versetzt. Die Mischung wurde nun gerührt, I Stunde lang auf 450 gehalten und zuletzt
kurz auf 800 erwärmt, worauf man die festen Bestandteile durch Filtration entfernte.
Das erhaltene heparinhaltige alkalische Filtrat wurde mit so viel Schwefelsäure
angesäuert, bis der pH-Wert 2,5 betrug, und danach 15 Minuten lang auf 650 erwärmt.
Der dabei erhaltene, aus einem Heparin - Protein - Komplex bestehende Niederschlag
wurde durch Zentrifugieren abgetrennt, mit Alkohol gewaschen, in 20 Gewichtsteilen
Wasser von PH IO gelöst und mit je IO Gewichtsteilen Natirumchlorid auf je Ioo Gewichtsteile
der alkalischen Lösung versetzt. Das entstehende Gemisch aus alkalischer Lösung
und Salz wurde mit Schwefelsäure bis auf ein PH von 2,5 angesäuert und der erhaltene
Proteinniederschlag durch Zentrifugieren abgetrennt. Nach Einstellung des pH-Wertes
der oberen Flüssigkeitsschicht auf 5,5 wurden 2 Raumteile Äthylalkohol zugesetzt,
die Heparinfällung durch Zentrifugieren abgetrennt, mit Aceton gewaschen und getrocknet.
Die Ausbeute betrug 0,026 Gewichtsteile Heparin mit einem Gehalt von 93 U.S.P.-Einheiten
je Milligramm.
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Beispiel 2 Zu 200 Gewichtsteilen einer alkalischen Lösung des Heparins
und Proteins, die nach dem im Beispiel I beschriebenen Verfahren aus 2000 Gewichtsteilen
Rindslunge hergestellt worden war, wurden 45 Gewichtsteile gepulvertes Ammoniumsulfat
bei PH 7,5 zugegeben. Nach vollständiger Auflösung des Ammoniumsulfats wurde der
pH-Wert -durch einen Zusatz von Qhlorwasserstoffsäure auf einen Wert von 2,5 gebracht,
und der erhaltene Niederschlag wurde durch Zentrifugieren entfernt. Die das Heparin
enthaltende Flüssigkeit wurde mit Natriumhydroxyd auf pn 5,5 eingestellt und mit
2 Raumteilen Äthanol versetzt. Die entstehende Fällung läßt man absetzen, die klare
überstehende Flüssigkeit wurde dekantiert und verworfen. Der Niederschlag wurde
nun erst einmal mit 670/oigem Äthanol, dann mehrmals mit Aceton gewaschen und unter
vermindertem Druck bei600 getrocknet; dabei wurden 41 Gewichtsteile rohes Heparin
mit einer Wirksamkeit von 0,62 U.S.P.-Einheiten je Milligramm gewonnen. Das rohe
Heparin wurde durch Entfernung des Arnmoniumsulfats (das bei
Zusatz
des Äthanols zusammen mit dem Heparin ausgefällt worden war) gereinigt, indem man
es in Wasser löste und die Lösung dialysierte, wodurch die Sulfatkonzentration auf
weniger als 1 0/o zurfickging. Dann wurde das Heparin durch Zusatz von 2 Raumteilen
Äthanol zu dem wäßrigen Gemisch ausgefällt. Der Heparinniederschlag wurde weiterhin
mit 670/obigem Äthanol und dann nochmals mit Aceton gewaschen und schließlich getrocknet.
Das so erhaltene Heparin wurde aus dem rohen Produkt in 940/oiger Ausbeute gewonnen
und hatte eine Wirksamkeit von I04 U.S.P.-Heparin-Einheiten je Milligramm.
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Beispiel 3 I5 g ungereinigtes Heparin mit einer Wirksamkeit von 20
internationalen Einheiten je Milligramm wurden nach der Methode von Kuizenga und
Spaulding (Journ. Biol. Chem., 148, 64I-7 [I943]) hergestellt und in 500cm3 destilliertem
Wasser gelöst. Das Gemisch wurde mit Natriumhydroxyd auf einen pE-Wert von g bis
9,5 gebracht und, um die Auflösung zu beschleunigen, auf 500 erwärmt. Dann wurden
30 g gereinigtes Casein in dem Gemisch gelöst. Unter kräftigem Rühren wurde der
pE-Wert durch Zugabe von konzentrierter Salzsäure auf 2,5 gebracht. Dann wurde die
Temperatur auf 600 gesteigert und das Gemisch unmittelbar darauf durch einen Buchner-Trichter
mit Diatomeenerde als Filtrierhilfsmittel (bekannt unter dem Handelsnamen Celite
Nr. 5I2) filtriert.
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Der Niederschlag wurde auf dem Filter einmal mit IOO cm3 heißer, wäßriger
Salzsäure von pl3 2,5 gewaschen. Darauf wurde der Niederschlag in 500 cm3 I2°/oiger
Natriumchloridlösung aufgeschlämmt und der PH Wert der Aufschlämmung durch Zusatz
von Natriumhydroxyd auf IO gebracht. Nach einstündigem Rühren bei 500 wurde der
poWert mit konzentrierter Salzsäure wieder auf 2,5 herabgesetzt. Die Suspension
wurde auf 600 erhitzt und erneut über Diatomeenerde als Filtriermittel filtriert.
Der Niederschlag wurde auf dem Filter zweimal mit je IOO cm3 angesäuerter, I2°/oiger
Natriumchloridlösung von600 gewaschen. Die Filtrate und Waschwässer wurden dann
vereinigt und mit Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von 6,5 gebracht. Dann wurde
diese Lösung bei 250 24 Stunden lang gegen langsam fließendes destilliertes Wasser
dialysiert. Zur Dialyse wurden Dialysierhülsen aus regenerierter Cellulose verwendet.
Nach der Dialyse war die Probe auf Chlorid nur schwach positiv. Zur Erzielung einer
Konzentration von 1 0/o wurde der Lösung die entsprechende Menge Natriumchlorid
zugegeben. Nachdem noch das doppelte Lösungsvolumen an Äthanol zugegeben worden
war, blieb das Gemisch über Nacht bei 250 stehen. Der gebildete Niederschlag wurde
abfiltriert, zuerst mit Alkohol, dann mit Aceton gewaschen und anschließend 24 Stunden
lang bei 600 im Vakuum getrocknet. Das erhaltene Produkt war rein weiß und besaß
eine Wirksamkeit von go 1. E. je Milligramm. An antikoagulierender Wirksamkeit wurden
700/0 zurückgewonnen.
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PATENTANSPROCHE: I. Verfahren zur Gewinnung von Heparin, dadurch
gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung eines Protein-Heparin-Gemisches mit
einem p-Wert von mindestens 7 herstellt, der Lösung so viel lösliches Salz zusetzt,
daß eine Anionenkonzentration von wenigstens I Mol je Liter besteht, die salzhaltige
Lösung zur Ausfällung des Proteins ansäuert und das Heparin aus der verbleibenden
Lösung gewinnt.