DE712564C

DE712564C - Verfahren zur Reinigung von Heparinloesungen

Info

Publication number: DE712564C
Application number: DEC55663D
Authority: DE
Inventors: Dr Alois Detzel; Dr Alexander Lang
Original assignee: Chemische Fabrik Promonta GmbH
Current assignee: Chemische Fabrik Promonta GmbH
Priority date: 1940-02-29
Filing date: 1940-02-29
Publication date: 1941-10-21

Description

Verfahren zur Reinigung von Heparinlösungen Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Heparin, insbesondere Robheparin, enthaltenden Lösungen, Bekanntlich wird Heparin aus tierischen Organen, wie beispielsweise Säugetierleber oder -lunge, in der Weise gewonnen, daß man das firstche oder getrocknete Organ gegebenenfalls nach vorausgegangener Autolyse mit Alkalilösungen auszieh. Die Serhaltenen Lösungen werden neutralisiert und eingeengt, worauf das Heparin zusammen mit Protein und anderen Verunreinigungen durch Zugabe von Alkohol oder Aoeton ausgefällt werden kann. Der nach den vorstehend angegebenen Methoden erhaltene Niederschalg wird zu wiederholten Malen mit Wasser aufgenommen und mit Alkohol oder Aceton gefällt, um Protein bzw. Proteinspaltprodukte zu entfernen. Da die das Heparin begleitenden Verunreinigungen sich in ihren F.ällungseigenschaften dem Heparin außenordentlich ähnlich verhalten, hat man vorgeschlagen, solche rohen Heparizubereitugen einer Trypsinverdauung zu unterwerfen. Damit sind jedoch die einer Gewinnung von reinem Heparin entgegenstehenden Schwierigkeiten durchaus noch nicht besitigt. Auch nach der Trypsinverdauug enthalten die Dehparinlösungen noch Begleitstoffe, die sich selbst durch zaflreiche Umfällungen nicht restlos abtrennen lassen.
Zudem besitzen Lösungen, insbesondere von aus Lunge gewonnenem Rohhepann auch nach der Trypsinverdauung noch eine so hohe Visonsität, daß es praktisch unüberwindliche schwierigkeiten bereitet, dei für eine befreiedigende weitere Reingiung notwnedige Klärung dieser Lösungen zu bewirken. Die betreffenden Lösungen lassen sich meistens weder flitrieren noch zentrifugieren.
Zur Beseitgung dieser Schwierigkeitin und zur Erzielung esoders reiner Heparinlösungen werden erfindungsgemäß 'heparin'haltige Lösungen, bevor sie mit Trypsin verdaut werden, in der Weise gereinigt, daß man sie der Einwirkung von Enzymen unterwirft, die, wie z. B. Pepsin und Papayotin. bei einem unter 7 gelegenen PH-Wert Eiweiß zu spalten vermögen. Die anzuwendenden Spaltungstemperaturen sind die in der Literatur beschriebenen und üblichen. Bei Verwendung von Pepsin soll im allgemeinen über eine Temperatur von 38- nicht hinausgegangen wegen während man bei Verwendung von Pa in einem Temperaturbereich von 20 arbeiten kann, Bei Anwendung von niedri, gen Temperaturen muß die Reaktionszeit entsprechend länger gewählt werden.
Bei Amvendung des erfindungsgemäßen Verfahrens erhält man dünnflüssige Lösungen, die sich mit Leichtigkeit durch Zentrifugieren oder ähnliche Klärungsmaßnahmen von schwerlöslichen Verunreinigungen befreien lassen. Die Lösungen erfordern außerdem eine wesentlich geringere Anzahl von Umfällungen, um zu reinen Präparaten zu kommen.
Der technische Fortschritt des neuen Verfahrens gegenüber den bekannten Reinigungsverfahren, bei denen lediglich eine Trypsinverdauung vorgenommen wird, ist ganz erheblich. Aus rohem Heparin, von dem 1 mg 4 ccm Ziegenblut I bis 3 Stunden flüssig hält, erhält man nach den üblichen Reinigungsmaßnahmen mit anschließender Trypsinverdauung Präparate, von denen etwa o,8 mg erforderlich sind, um 4 com Ziegenblut I bis 3 Stunden ungerinnbar zu halten. Wird dagegen der Trypsinverdauung eine Spaltung mit Pepsin oder Papayotin vorgeschaltet, so werden nacll der anschließenden Trypsinverdauung Präparate erhalten, von denen nur 0,2 mg erforderlich sind, um die gleiche Gerinnungsverzögerung zu erreichen, wie man sie vorher mit 1 mg des Ausgangsmaterials erzielt hatte.
Im folgenden soll das Verfahren an Hand von Ausführungsbeispielen näher erläutert weraen, ohne daß die Erfindung auf die in den Beispielen envähnten Hilfreagenzien, Mengenerhältnisse, Arbeitstemperaturen usw. beschränkt wäre.
Beispiel I I kg nach bekanntem Verfahren gewonnenes Rohheparin, von dem I mg 4 ccm Ziegenblut 1 bis 3 Studen flüssig hält, löst man in 201 Wasser, stellt mit verdünnter Salzsäure auf ein PH von I,8 ein, gibt 1 0/oo Pepsin 1:10 000 zu und hält die Flüssigkeit 24 Stunden auf 38 . Dann bringt man das PH mit Natronlauge auf einen Wert von etwa 8.5 bis 9,7, gibt 3% Trypsin sowie eines der bekannten Konservierungsmittel zu und verdaut 36 bis 48 Stunden bei 38-. Danach neutralisiert man mit Salzsäure, kocht auf und klärt den Verdauungsansatz nach dem Erkalten durch Filtration oder Schleudern. Aus dieser Lösung kann man in bekannter Weise das Heparin durch Zusatz von Aceton oder Alkohol fällen. Das so erhaltene Produkt ergibt bei einmaliger Reinigung über die Chininverbindung sowie das Bariumsalz ohne weiteres vollkommen reines Heparin.
Beispiel 2 1 kg Roh heparin, von dem I mg 4cm Ziegenblut I bis 3 Stunden flüssig hält, löst man in 201 Wasser, stellt mit verdünnter Salzsäure auf PH 3,0 ein, gibt I °/'o Papayotin 1 : 200 zu und hält die Flüssigkeit 24 Stunden auf 65. Dann bringt man das pH mit Natronlauge auf einen Wert von etwa 8.5 bis 8,7, gibt 3% Trypsin sowie eines der bekannten Konservierungsmittel zu und verdaut 36 bis 48 Stunden bei 38'. Danach neutralisiert man mit Salzsäure, kocht auf und klärt den Verdauungsansatz nach dem Erkalten durch Filtration oder Schleudern. Aus dieser Lösung kann man in bekannter Weise das Heparin durch Zusatz von Aceton oder ALkohol fällen. Das so erhaltene Produkt ergibt bei einmaliger Reinigung über die Chininverbindung sowie das Bariumsalz ohne weiteres vollkommen reines Heparin.

Claims

PATENTANSPRÜCHE: Verfahren zur Reinigung von heparinlösungen, bei dem die heparinlöungen einer Trypsinverdauung unterworfen werden, dadurch gekennzeichnet, daß vor der Trypsinverdauung die Heparinlösungen der Einwirkung von Enzymen, die Eiweiß bei einem p, unterhalb 7 spalten, wie z. B. Pepsin oder Papayotin, unter den üblichen Bedingungen unterworfen werden.