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. Verfahren zur Gewinnung von proteolytischen Abwehrfermenten Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von r'1bwelirfermenten
aus Harn, insbesondere Schwangerenharn. Harn von Basedowkranken, Karzinomkranken,
Tuberkulosekranken u. djl., Serum oder Organextrakten, wie z. B. aus Gehirn, Milz,
Tumorgewebe usw.
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Es ist bekannt, aus Harn oder Organextrakten durch Fällung mit organischen
Lösungsmitteln, wie Alkohol oder Aceton, und durch Aufnahme der Fällung in physiologischer
Kochsalzlösung Abwehrfermente zu gewinnen bzw. zu reinigen. Auch ist es bekannt,
Abwehrfermente enthaltende Lösungen mit Ammoniumsulfat zu sättigen, wodurch die
Abwehrfermente zusammen mit den Verunreinigungen ausgefällt werden. Bei. diesem
bekannten Verfahren wird zusammen mit den Abwehrfermenten eine Menge von hochmolekularen,
fermentativ unwirksamen Stoffen, insbesondere Ballasteiweißstoffen, mit niedergeschlagen,
die, da sie sich in chemischer Hinsicht ähnlich wie die Abwehrfermente verhalten,
von den Abwehrfermenten nicht in hinreichender Weise abgetrennt werden können. Lrfiiiclungsgemäß
«-erden zur Vermeidung der dem bekannten Verfahren innewohnenden Nachteile die Abwehrfermente
aus den fermenthaltigen Ausgangsmaterialien zweckmäßig, nachdem sie zuvor gegen
Lackmus neutralisiert wurden, mit organischen Lösungsmitteln, wie z. B. Aceton oder
Äthylalkohol, niedergeschlagen. Der Fermentniederschlag wird dann in Wasser aufgenommen
und diese Lösung mit Aminonsulfat etwa hälftig gesättigt. Dies kann in der Weise
erfolgen, daß man die berechnete Menge festes Ammonsulfat der Lösung zugibt. Man
kann aber auch zu der vorhandenen Lösung etwa das gleiche Volumen gesättigter Anmonsulfatlösung
zufügen. Dabei bleiben die Abwehrfermente in Lösung, während die Verunreinigungen
ausfallen und so abgetrennt werden können. Hierin unterscheidet sich das erfindungsgemäße
Verfahren von der bekannten Arbeitsweise einer Sättigung der die Abwehrfermente
enthaltenden Lösung mit Ammonsulfat, bei der die Abwehrfermente zusammen mit den
Verunreinigungen ausgefällt werden. Die Entfernung des Ammonsulfats
aus
der Lösung erfolgt in üblicher Weise. z. B. durch Dialyse, "vorauf aus .der salzfreien
Lösung durch Zugabe von Aceton oder Äthylalkohol die Fermente ausgefällt werden
können.
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In den erhaltenen Niederschlägen liegen die Abwehrfermente in kot1-r_entrierter
und spezifischer Forin vor. Im allgemeinen fallen sie amorph aus, doch konnten in
manchen Fällen auch Kristalle beobachtet werden.
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Zwecks weiterer Reinigung kann es vorteilhaft sein, in den Gang des
erfindungsgemäßen Z-erfalirens eine weitere Reinigung durch Sättigung niit I`odisalz
etwa entsprechend dem Verfahren des Patents 737 869 hzw. des Zusatzpatents j.13
147 einzuschalten. Die zunächst durch Ausfällung mit Aceton ocicr Äthvlalkoliol
erhaltenen Nic@lc:rschlä;;e werden hierbei in lihysiologischcr Kochsalzlösung aufgenommen;
durch S<itti'"itn,dieser Lösung finit Kochsalz werden die Verunreinigungen abgeschieden,
und durch Dialyse wird das ILoclisalz wieder eutferiit, worauf die etwa hälftige
Sätti-tui- finit Annnonstilfat vorgenommen wird. Man kann aber auch die Kochsalzsättigtuig
der Reinigung durch IIalbsä ttigung mit Aninionsulfat ii:tclifolgcn lassen oder,
wenn nian besonders reine Produkte erhalten will, kann nian die Sättigung mit Kochsalz
sowohl vor als auch nach der Nalbsättigung finit Animoinsulfat durchführen.
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Die in der letzten Stufe des erlindun-sgemäßen Verfahrens durch Ausfällung
finit organischen Lösungsmitteln erhaltenen hochkonzentrierten Ferinentpräparate
werden zwecks Applikation vorteilhaft dadurch in 1.ösun" gebracht, daß mau sie in
physiologisclier Kochsalzlösung aufnimmt, aus der dann nach üblichen Verfahren,
z. B. durch Dialyse, das Kochsalz wieder entfernt wird.
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lin folgenden soll .(las erfindungsgemäße Verfahren an Hand einiger
Ausführungsbeispiele näher erläutert werden: Beispiel i 2o l Sammelurin von Multiple-Sklerosekranken
werden finit n-Natronlauge gegen Lackmus neutralisiert und mit 201 Aceton gefällt.
Man läßt 48 Stunden stehen und hebert dann die überstehende Flüssigkeit ab. Sie
ist unwirksam und wird verworfen. Das Sediment schleudert man und kann auf diese
Weise weitere 3q.0 ccm Lösung neben 61g Zentrifugat gewinnen. Das Zentrifugat schwemmt
man mit 3 1 dest. Wasser an und versetzt diese Aufschwemmung finit 'dem gleichen
Volumen einer gesättigten Ammonsulfatlösung. Dabei werden Verunreinigungen niedergeschlagen,
während die Abwehrfermente in Lösung bleiben. Man läßt i2 Stunden stehen und filtriert
dann die Fällung ab, die verworfen wird. Die Lösung wird 48 Stunden gegen fließendes
Wasser dialysiert. Das Volumen derselben, das dabei von 61 auf etwa 91 gestiegen
ist, wird anschließend durch 1?inengen im Vakuum auf 21 gebracht. Dann gibt man
21 Aceton zu und erhält so die Abwehrfermente in trockener, hoch gereinigter Form.
Beispiel -, iol Schwangerenharn werden mit n-Natronlauge gegen Lackmus neutralisiert
und finit io 1 Aceton ausgefällt. Die Fällung wird durch Zentrifugieren gewonnen.
Sie wird in 21 physiologischer Kochsalzlösung aufgenoinnicn. Gleichzeitig gibt man
auf fiinf Volumenteile der Fällung ein Volumenteil 2°@oiger Ascorbinsäurelösung
zu. Diese Lösung wird nun unter Rühren allmählich mit Kochsalz bis zur Sättigung
versetzt. Es bildet sich ein reichlicher Niederschlag, den man i2 Stunden sich absetzen
läßf. Der Niederschlag besteht aus Verunreinigungen, die Aliwelii'fei-irnnte befinden
sich in der Lösung. Man filtriert die Fällung ab und dialysiert die Lösung zur 1?ntfernung
des Kochsalzes 48 Stunden gegeit fließendes Wasser. Das Volumen der Abw'elirferrnentlösun-
steigt dabei auf 3'/.,1. Nunmehr gibt 'Wir[ 31,I_ 1 gesättigte Aninionsulfatlösung
hinzu, worauf erneut ein Niederschlag entsteht. der ebenfalls aus inaktiven Begleitstoffen
der Abwehrfermente besteht. Nach einigcni Stehen filtriert nian die Lösung und dialysiert
dieselbe wiederuni 48 Stunden gegen fließendes Wasser. Man kann dann aus der elektrolytfreien
Lösung in üblicherWcise, z. B. durch Ausfällen finit Aceton oder Alkohol lizw. durch
Eindampfen im Vakuum, die Aliwelirfermente in hoch gereinigter, trockeiiei-Forin
gewinnen. Beispiel 3 i ioo ccin Diphtlieriepferdeseruin (q.oofach) werden mit iiooccm
Aceton versetzt. Den ausfallenden kräftigen Niederschlag läßt man 2:1 Stunden absitzen
und huscht ihn dann ab. Er wird finit 3 1 dest. Wasser angeschwemmt. Darauf gibt
man unter Umrühren allmählich Ammonsulfat zu bis zur vollen Sättigung. Die Abwehrfermente
geben dabei mit Ballasteiweiß in den Niederschlag. Man trennt die Fällung durch
Filtration von der Lösung. Letztere ist inaktiv und wird verworfen. Die Fällung
wird in 4700 ccm dest. Wasser aufgenommen und 48 Stunden gegen fließendes Wasser
dialysiert. Die Dialyseninnenflüssigkeit hat dabei i8oo ccm Wasser aufgenommen und
besitzt minmehr ein Volumen von 650o ccm. Sie wird nun unter ständigem Rühren bis
zur Sättigung mit Kochsalz versetzt.
Dabei fallen Verunreinigungen
aus, während die Abwehrfermente in Lösung bleiben. Man läßt 24 Stunden absitzen
und filtriert. Die Fällung wird verworfen und das Filtrat 48 Stunden gegen fließendes
Wasser dialysiert zur Entfernung des Kochsalzes. Dann engt man die Dialyseninnenflüssigkeit
auf 3 1 ein und versetzt sie mit 3 1 gesättigter Ammonsulfatlösting. Dabei tritt
wiederum eine Fällung ein, die ebenfalls,aus Verunreinigungen bestellt, -während
die Abwehrfennentein Lösungbleiben. Nach 24stündigem Stehen filtriert man den unwirksamen
Niederschlag ab und dialysiert das Filtrat zur Entfernung des Ammonsulfates 48 Stunden
gegen fließendes Wasser. Die Lösung enthält nunmehr die Abwehrfermente in hoch gereinigter
Form. Durch Eindampfen im Vakuum erhält nian aus dieser Lösung 2,87 g aktive Trockensubstanz.
Beispiel 4 2 kg schlachtirische Plazenten von Rindern @"-ci-deli kurz gewaschen
und anschließend geniaahlen. Das vorzerkleinerte Material wird nunmehr finit Sand
möglichst fein verrieben. Dieser Organbrei wird mit dem iofacheri Volumen physiologischer
I`oclisalzlösuiig io Stunden bei Zimmertemperatur geschüttelt. Dann werden durch
Zentrifugieren die unl;elösten Bestandteile abgetrennt. Die Lösung wird nunmehr
mit dem bleichen Volumen .\ceton versetzt. Die dabei entstehende Fällung läßt man
einige Stunden absitzen und trennt sie dann durch Abnutschen von der Lösung. Man
erhält so 3oo ccm feuchten Niederschlages, den man unter Zugabe von 5o ccin 2°/Qiger
Ascorbinsäurelösung in 41 lest. Wasser aufnimmt. Die Lösung sättigt inan unter Umrühren
langsam mit Kochsalz. Die auf diese Weise entstandene Fällung läßt inan 24 Stunden
absitzen und filtriert sie dann ab. Sie ist inaktiv und wird vertvorfen. Die Lösung
wird zur Entfernung des Kochsalzes 48 Stunden gegenfließendes Wasserdialysiert.
Dann versetzt man sie mit dem gleichen Volumen gesättigter Ammonsulfatlösung, wodurch
eine erneute Fällung von Verunreinigungen erfolgt, läßt z2 Stunden stehen und filtriert.
Die Fällung, die inaktiv ist, wird verworfen und die Lösung 48 Stunden gegen fließendes
Wasserdialysiert. Die Lösung, die mittlerweile auf ein Volumen von 71 angewachsen
ist, engt man nunmehr im Vakuum auf 21 ein und fällt die Abwehrfermente durch Zugabe
des gleichen Volumens 96°/aigen Äthylalkohols aus. Die Fällung wird abfiltriert
und in 3o ccm physiologischer Kochsalzlösung gelöst. Nach erfolgter Lösung dialysiert
man einige Stunden gegen Best. Wasser und erhält so eine hoch konzentrierte elektrolytfreie
gereinigte Abwehrfermentlösung.