DE1065133B - Verfahren zur Reinigung von aus Speichel bzw. Speicheldruesen gewonnenem Rohparotin - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft die Reinigung des rohen Aktivstoffes Parotin aus Speichel und Speicheldrüsen und insbesondere ein Verfahren zur Gewinnung dieser Stoffe in reiner kristalliner Form.

Der hier benutzte rohe Aktivstoff, also das Rohparotin, ist ein Rohprotein, das aus der Ohrspeicheldrüse, insbesondere des Rindes, auf Grund der von T. Ogata stammenden »Salivary gland endocrine theory« isoliert wird.

Dieses Rohparotin kann in folgender Weise erhalten werden:

Die von Fett, Bindegewebe u. dgl. befreiten und in einem Fleischwolf zermahlenen frischen Rinder-Ohrspeicheldrüsen werden mit der 6fachen Menge Wasser versetzt, das Gemisch mit Sn-NaOH auf p_H 8,0 bis 8,2 eingestellt, mit einer kleinen Menge Toluol versetzt und unter Rühren 3 Stunden extrahiert und diese Extraktion wiederholt. Der (flüssige) Extrakt ist trübe und dunkelrotgefärbt. Die beiden Extrakte werden vereinigt, ihr p_H mit 5n-HCl auf 5,4 eingestellt, über Nacht in einem ao Kälteraum stehengelassen und dann zentrifugiert. Der zentrifugierte Niederschlag wird mit der 3- bis 4fachen Menge Wasser zu einer Paste verrührt, die mit Sn-NaOH auf ein p_H von 8,0 bis 8,2 gebracht wurde, worauf sie bei — 15°C 3 bis 4 ecm dick gefroren wurde. Das gefrorene Material läßt man dann auf einer mit einem Baumwolltuch bespannten Porzellanfilterplatte bei 18°C auftauen. Die nitrierte oder zentrifugierte Schmelzlösung ist rot, aber nicht klar. Die gefärbte Lösung wird mit 5n-HCl auf p_H 5,4 eingestellt und über Nacht auf Eis stehengelassen. Der gebildete Niederschlag wird zentrifugiert, dreimal mit der 20fachen Menge kalten Acetons gewaschen, das 0,05 °/₀ HCl enthielt, und abgesaugt. Nach der Entfärbung wird weiterhin mit Aceton in geeigneter Menge nachgewaschen. Der Niedeischlag wird sodann unter Rühren mit wäßrigem Ammoniak neutralisiert, zweimal mit etwa der 15fachen Menge absoluten Acetons gewaschen und über konzentrierter H₂SO₄ im Vakuum getrocknet. Auf diese Weise werden 0,8 °/₀ des Ausgangsmaterials an »Rohparotin« erhalten.

Das Parotin fördert in bemerkenswerter Weise die Verkalkung der Zähne und verringert den Calciumspiegel im Serum. Kleiner hat in seinem Buch »Human Biochemistry«, 3. Auflage (1951), ausgeführt, daß im Speichel Globulin enthalten ist, aber er spricht dort nur in unbestimmter Form von einer Globulingruppe. Das Parotin ist jedoch ein neu aufgefundenes Protein, das zur Globulingruppe gehört und auch in der Behandlung von Arthritiden und anderen ähnlichen Erkrankungen der Gelenke und des Knochengewebes wirksam ist. Diese Substanz ist mit keiner der von Kleiner beschriebenen Substanzen identisch.

Das gereinigte Parotin ist ein Produkt von hohem therapeutischem Wert, das in der physiologischen Wir-Verfahren zur Reinigung

von aus Speidiel bzw, Speicheldrüsen

gewonnenem Rohparotin

Anmelder:
Teikoku Hormone Mfg. Co., Tokio

Vertreter: Dipl.-Ing. H. Leinweber, Patentanwalt,
München 2, Rosental 7 :

Beanspruchte Priorität:
Japan vom 18. August und 19. August 1943

Tomosaburo Ogata, Akira Ogata, Yosoji Ito, jTokio,
und Akira Mizutani, Nagoya (Japan),
sind als Erfinder genannt worden i

kung viel stärker ist als die nach bekannten Verfahren aus Speichel oder Speicheldrüsen erhaltenen eiweißartigen Extrakte, keine Giftwirkung aufweist, in Wasser leicht löslich ist und sich zur Injektion eignet

Das nach bereits bekannten Verfahren aus, Speichel oder Speicheldrüsen erhältliche rohe Parotin ist, ziemlich unrein und wirkt physiologisch verhältnismäßig schwach.

Um aus solchen Extrakten von Speichel oder Speicheldrüsen ein reineres Produkt zu erhalten, sind verschiedene Reinigungsverfahren eingehend untersucht] worden, um einen Aktivstoff in kristalliner Form zu erhalten.

Erfindungsgemäß kann nun ein Präparat hergestellt werden, dessen physiologische Wirksamkeit ,zehnmal stärker als die von bisher erhaltenen Präparaten ist. Gefunden wurde ferner, daß dieses Präparat; klinisch interessant und wirksam bei der Behandlung von Arthritis deformans und Chondrodystrophia foetalis usw. ist, so daß es sehr gute Aussichten hinsichtlich der therapeutischen Verwendung bietet.

Erfindungsgemäß wird der aus Speichel oder Speicheldrüsen in obiger Weise erhältliche rohe Aktivstoff mit einem wäßrigen schwach alkalischen Medium von einem p_H 8,0 extrahiert und der Extrakt der fraktionierten Fällung mit verschieden starken Ammoniumsulfatlösungen oder Natriumsulfat- und anschließend Ammoniumsulfatlösungen unterworfen, um den Aktivstoff von der inaktiven Substanz zu trennen. Es kann so wiederholt vorgegangen werden, bis der Aktivstoff in kristalliner Form abgeschieden wird, worauf i derselbe

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gegebenenfalls wiederholt in schwach alkalischem wäß- getrocknet. Das so erhaltene Produkt stellte gereinigtes

rigem Medium gelöst, die Lösung noch dialysiert und Parotin dar. Die Ausbeute betrug etwa 0,7 g, das sind

das Dialysat gefriergetrocknet werden kann. 3 bis 4°/₀ des Rohparotins.

Bezüglich der physikochemischen und chemischen

Eigenschaften sowie der biochemischen Wirkung des 5 Beispiel 2
gereinigten Produktes wird-auf die in· »Endocrinologia - Zu dem rohen Aktivstoff wird das SOfache Volumen Japonica«, Bd. I, Nr. 1, S. 1 bis 50 (1954), erschienene Wasser oder physiologische Kochsahlösung gegeben, Arbeit von Yosoji Ito »Biochemical studies in salivary das p_H mit n-NaOH-Lösung (unter Benutzung von gland hormone«, insbesondere S. 14 bis 26 und 41 bis 47, Kresolrot oder Phenolrot als Indikator) auf 8,0 einverwiesen. ίο gestellt und das Gemisch zwecks Auflösung über Nacht

Das erfindungsgemäß hergestellte kristalline Präparat , stehengelassen. Zu dieser Lösung wird unter Umrühren wirkt physiologisch sehr stark, ist ungiftig, nf> Wasser '& tropfenweise die gesättigte Ammoniumsulfatlösung geleicht löslich, daher zur Injektion geeignet und für,* geben, bis die Konzentration (unter Aufrechterhaltung therapeutische Zwecke sehr wertvoll. *** eines p_H von 8,0) 7% erreicht.

In den folgenden Beispielen werden Ausführungs- 15 Wenn die Lösung eine gewisse Zeit lang gestanden

formen der Erfindung beschrieben. hat, wird der inaktive Niederschlag abgetrennt und

.3 .·„·. ■■ j dadurch eine klare Lösung des Aktivstoffes erhalten.

''P¹⁶ Aus der inaktiven Fällung, die noch gewisse Mengen

Zu 20 g des Rohparotins wurde 1 1 einer 0,9°/₀igen aktiver Stoffe enthält, können weitere Mengen Aktivstoff NaCl-Lösung gegeben, die 2% Butanol enthielt, worauf 20 in entsprechender Weise gewonnen werden, indem man das Ph der Lösung mit 5n-NaOH auf 8,0 eingestellt diese Fällung in einer schwach alkalischen Lösung auf löst wurde, um das Parotin darin aufzulösen. Die Lösung und zu dieser Lösung oder dem Dialysat der Lösung wurde über Nacht bei 0 bis — 5⁰C stehengelassen, damit unter Aufrechterhaltung des p_H 8,0 Ammoniumsulfatsich das Parotin vollständig auflösen konnte. Zu dieser lösung gibt, bis die Konzentration des Ammonium-Lösung wurde tropfenweise unter Rühren eine gesättigte 25 sulfats 7% erreicht hat. Wenn die ausgefällte inaktive (N H₄)₂S O₄-Lösung gegeben, bis die Konzentration an Substanz abgetrennt wird, erhält man die Lösung mit (NH₄)₂SO₄ 7% betrug, worauf die Lösung über Nacht der aktiven Substanz. Diese Lösung kann nun mit dem in einem Kälteraum stehengelassen wurde, ehe sie filtriert Hauptteil, der wie oben beschrieben erhalten wurde, wurde. Das Filtrat war klar und gelbgefärbt. vereint werden.

Die Lösung wurde mit n-HCl auf p_H 5,4 gebracht 3° Die Lösung der aktiven Substanz in 7°/_oiger Am-

und über Nacht in einem Kälteraum stehengelassen, ehe moniumsulfatlösung wird nun mit n-HCl-Lösung gegen

sie zentrifugiert wurde. Der gebildete Niederschlag wurde Bromkresolgrün als Indikator auf 4,8 bis 5,0 eingestellt,

in der 3- bis 4fachen Menge destillierten Wassers bei Man läßt diese Lösung dann über Nacht stehen, worauf

P₁₁ 8,0 gelöst und diese Lösung tropfenweise unter die ausgefallene aktive Substanz abgetrennt wird.

Rühren mit einer gesättigten (N H₄)₂ S O₄-Lösung vcr- 35 Zu dieser Fällung wird das gleiche oder 1¹^fache

setzt, bis die Konzentration an (NH₄)₂SO₄ 25°/₀ aus- Volumen Wasser gegeben und das p_H (mit Kresolrot

machte (p_H 6,8). Diese Lösung wurde wiederum über oder Phenolrot) auf 8,0 gebracht, wodurch die Fällung

Nacht in dem Kälteraum stehengelassen und dann in Lösung geht (etwa vorhandene unlösliche Substanz

zentrifugiert. Es wurden 2 g Fällung erhalten. wird verworfen). Nach Zusatz von gesättigter Am-

Zu dieser Fällung wurde das 4fache an destilliertem 40 moniumsulfatlösung bis zu einer Konzentration an Wasser gegeben. Nachdem die Fällung bei p_u 8,0 in Ammoniumsulfat von 25°/₀ (man kann auch die Kon-Lösung gegangen, wurde eine gesättigte (NH₄)₂SO₄- zentration des Ammoniumsulfats durch Zusatz gesät-Lösung tropfenweise zugesetzt, bis die Konzentration tigter Ammoniumsulfatlösungen zur ursprünglichen akan (NH₄J₂SO₄ 20°/₀ betrug (p_H 6,8 bis 7,0). Es entstand tiven 7°/_oigen Ammoniumsulfatlösung auf 25°/₀ steigern) ein kristalliner Niederschlag, der über Nacht im Kälte- 45 und Stehenlassen der Lösung wird der wieder ausraum stehengelassen und dann zentrifugiert wurde. Der gefallene Aktivstoff abgetrennt.

so erhaltene Niederschlag wog 1,2 g, was etwa 6% des Alsdann wird zu demselben wieder das gleiche oder

Rohparotins entsprach. das lVjfache Volumen Wasser gegeben und das p_u

• Zu diesem Niederschlag wurde das 4fache an destil- auf 8,0 eingestellt, um ihn aufzulösen (etwa vorhandene

liertem Wasser gegeben und das p_H der Lösung mit 50 unlösliche Substanz wird verworfen). Zu dieser Lösung

n-NaOH auf 8,0 eingestellt, um den Niederschlag auf- oder zu deren Dialysat wird bei p_n 8,0 gesättigte Am-

zulösen. Dann wurde tropfenweise unter Rühren eine moniumsulfatlösung gegeben, um die Konzentration

gesättigte (NH₄)₂SO₄-Lösung hinzugegeben, bis die daran auf 20°/₀ zu bringen, worauf die Lösung stehen-

^:Konzentration an (N Hj)₂SO₄ 15°/₀ betrug. Die Lösung gelassen wird, bis der Aktivstoff ausfällt und anschließend

wurde über Nacht in dem Eisraum stehengelassen und 55 abgetrennt werden kann.

•dann zentrifugiert. Zu dem Niederschlag wurde die Diese Behandlungsfolge der Fällung wird weitere 3fache Menge Wasser gegeben und das p_H dann mit zweimal wiederholt, wobei lediglich die Konzentration n-NaÖ H auf 8,0 eingestellt, so daß sich der Niederschlag des Ammoniumsulfats von 20 auf 15°/₀ und dann ■auflöste. Die Lösung wurde in fließendem Wasser mit schließlich auf 12,5 °/₀ abgeändert wird.
Hilfe einer Cellophanmembran dialysiert, um das 60 Die mit der 15°/_oigen Ammoniumsulfatlösung erhal-(NH₄J₂SO₄ zu entfernen. Durch Zusatz von n-HCl bis tene Fällung ist in der Hauptsache kristallin, die mit zum p_H 5,4 erfolgte Ausfällung, die nach Stehenlassen der 12,5 "/„igen Ammoniumsulfatlösung erhaltene Ausüber Nacht im Kälteraum zentrifugiert wurde. Zu dem beute besteht praktisch aus reinen Kristallen des Aktiv-Niederschlag wurde die doppelte Menge destillierten stoffes.

Wassers gegeben und das p_H dann mit n-NaOH auf 8,0 65 Die auf diese Weise erhaltene aktive Fällung wird,

eingestellt, wodurch, sich . der Niederschlag auflöste. wenn notwendig, mehrere Male mit Wasser bei p_H 4,8

Diese Lösung wurde wiederum unter Verwendung einer bis 5,0 gewaschen, in einer kleinen Menge schwach

Cellophanmembran in destilliertem Wasser dialysiert, alkalischer Lösung aufgelöst und dialysiert, worauf die

'und zwar 2 bis 3 Tage lang, bis das p_H 6,6 bis 6,8 betrug. klare dialysierte Lösung in der Kälte getrocknet bzw. Die dialysierte Lösung wurde in einer Kühlvorrichtung 70 der durch Einstellung der dialysierten Lösung auf p_H 4,8

Claims (1)

1. bis 5,0 erhaltene Niederschlag mit Aceton entwässert Dieser Niederschlag wird wieder in einer schwach

   oder aber dieser Niederschlag wiederum in wenig schwach alkalischen Lösung aufgelöst und dialysiert. Zu der

   alkalischer Lösung aufgelöst, dialysiert und die dialy- dialysierten Lösung wird tropfenweise die gesättigte

   sierte Lösung in der Kälte getrocknet wird. Ammoniumsulfatlösung bei p_H 7,0 gegeben, bis die

   In dem beschriebenen Verfahren kann, wenn es not- 5 Konzentration 7°/₀ beträgt. Nach Abscheidung des

   wendig erscheint, eine kleine Menge eines Antiseptikums, inaktiven Niederschlags wird bei p_H 6,8 weitere Am-

   z. B. Toluol oder Butanol, benutzt werden. moniumsulfatlösung zugesetzt, bis die Konzentration

   Im folgenden sind die Ausbeuten an Aktivstoffen 1S°/_O beträgt. Jetzt fällt der Aktivstoff in Form von

   angegeben, die nach dem beschriebenen Verfahren Kristallen aus.

   erhalten werden (die Prozente beziehen sich auf das i₀ Diese Fraktion kann, wie im Beispiel 1 beschrieben,

   Gewicht des als Ausgangsmaterial benutzten Rohstoffes): durch fraktionierte Fällung mit 12,0- bis 12,5°/„igen

   a) 25»/_oige Ammoniumsulfatfällung 20°/₀ fT^^^S^T weitergereinigt werden. Aus-

   b) 20%ige Ammoniumsulfatfälluni 10·/. ^{beute: 240 m}S (°'⁸°/« ^des Rohparotins).

   c) 15%ige Ammoniumsulfatfällung

   (Kristalle) ;····:;·;·· ^{etwa 5}^ '⁵ Patentansprüche:

   d) 12,5⁰J₀IgC Ammoniumsulfatfallung

   (Kristalle) etwa 1 °/₀ , ., . , „ . . _ . , , ,

   ^v ' 1. Verfahren zur Reinigung von aus Speichel oder

   Diese Zahlen wurden in Versuchen erhalten, die Speicheldrüsen bei schwach alkalischem p_H durch

   während des Winters durchgeführt wurden. ao Extraktion und Fällen im schwach sauren Bereich

   Nach der Reinheitsbestimmung durch Elektrophorese gewonnenem Rohparotin unter Anwendung von

   (unter Benutzung der Tiselius-Apparatur) besitzt die Ammonsulfat oder Natriumsulfat als in der Eiweiß-

   durch Fällung mit logger Ammoniumsulfatlösung chemie an sich bekannter Fällungssalze, dadurch

   erhaltene Fraktion eine Reinheit von 80 bis 85°/₀, die gekennzeichnet, daß man das bei p_H 8,0 in wäßrigem

   mit 12,5°/_oiger Ammoniumsulfatlösung erhaltene Frak- 35 Medium gelöste Rohparotin zunächst durch Zugabe

   tion eine solche von 90 bis 95°/,. einer gesättigten Ammonsulfatlösung bis zu einer

   Wenn einem Kaninchen etwa 1 mg des kristallinen Ammonsulfatkonzentration in der Lösung von 7°/₀

   Präparates je 2 kg Körpergewicht eingespritzt wird, von einem Teil der Verunreinigung befreit, aus dem

   wird der Calciumspiegel des Blutserums um 15⁰/₀ ge- Filtrat den Wirkstoff durch Ansäuern auf p_H 4,8

   senkt. Daraus geht hervor, daß die kristalline Fraktion _3o bis 5,4 abscheidet, diesen erneut bei p_H 8 in Wasser

   zehnmal wirksamer als der rohe Aktivstoff ist. Wenn löst und bei einer 25°/_oigen Konzentration an Am-

   sie dem Menschen eingespritzt wird, treten keine monsulfat ausfällt, diesen Vorgang bei einer 20- und

   unangenehmen Nebenreaktionen auf. i5°l^gen und gegebenenfalls 12,5°/₀igen Ammon-

   Das Kristallparotin ist ein Protein, das fast keine Sulfatkonzentration wiederholt, den Niederschlag Asche enthält; isoelektrischer Punkt p_H 5,7 (Antimon- ₃₅ wiederum bei p_H 8 in Wasser löst, die Lösung gegen elektrode); etj? = — 85,7° (10 cm, 0,618 g/100 ecm in Wasser dialysiert, das Dialysat auf p_H 4,8 bis 5,4 H₂O). Sein Absorptionsspektrum (bei p_H 7,0 in wäßriger bringt, den erhaltenen Niederschlag gegebenenfalls Lösung) zeigt eine ins Unendliche verlaufende Absorp- erneut bei p_H 8,0 löst und wieder gegen Wasser bis tionskurve bei einer unter 235 ηιμ liegenden Wellen- zum p_H 6,6 bis 6,8 dialysiert und das Dialysat gefrierlängen; das erste Maximum tritt bei 277 ± 0,5 πιμ und ₄₀ trocknet bzw. die aus den Dialysaten sauer ausdas zweite Maximum bei 405 πιμ auf. gefüllten Produkte mit Aceton entwässert.

   Das Protein ist verhältnismäßig unbeständig, wird 2. Abänderung des Verfahrens zur Reinigung von

   durch Wärme oder Säure leicht zersetzt und zerfällt Rohparotin gemäß Anspruch 1, dadurch gekenn-

   auch, wenn es längere Zeit mit Feuchtigkeit in Be- zeichnet, daß man das in wäßrigem Medium bei

   running kommt. 45 p_H 8,0 gelöste Rohparotin an Stelle von Ammon-

   Beispiel 3 sulfat bei einer 7°/_oigen Natriumsulfatkonzentration

   vorreinigt, das Filtrat auf eine Natriumsulfat-

   Zu 30 g des rohen Aktivstoffes wird volumenmäßig konzentration von 17,7 °/₀ bringt, den Niederschlag

   das 50fache an Wasser oder physiologischer Kochsalz- in schwach alkalischem Medium löst, dialysiert, bei

   lösung gegeben; nach der Auflösung bei Einstellung des 50 p_H 7,0 die Lösung durch Zugabe von Natriumsulfat

   p_H der Lösung auf 8,0 mittels n-NaOH-Lösung (Indi- auf eine Konzentration von Natriumsulfat in der

   kator: Kresolrot oder Phenolrot) wird eine 20°/₀ige Lösung von 7% bringt, nach Abtrennen des Nieder-

   Natriumsulfatlösung unter Umrühren tropfenweise zu- schlags zu dem Filtrat wieder bei p_H 7 Natriumsulfat

   gegeben, bis die Konzentration 7% erreicht hat. Nach bis zu einer Konzentration von 15°/₀ hinzufügt, den

   einigem Stehenlassen wird der erzeugte inaktive Nieder- 55 gebildeten Niederschlag in schwach alkalischem

   schlag abfütriert. Medium löst, dialysiert, das Dialysat bei p_H 7 mit

   Anschließend wird weiteres Natriumsulfat zu dem Ammonsulfat auf eine Konzentration von 7°/₀

   Filtrat, in dem die aktive Substanz aufgelöst ist, bei Ammonsulfat bringt, den Niederschlag abtrennt, das

   p_H 6,6 gegeben, bis die Konzentration 17,7 °/₀ beträgt. Filtrat auf eine Ammonsulfatkonzentration von 15°/₀

   Nach einigem Stehenlassen wird der ausgefällte Aktiv- 60 bringt, den Niederschlag bei p_H 8 in Wasser löst,

   stoff abgetrennt. dialysiert und nach Anspruch 1 weiterverarbeitet.

   Diese Fällung wird in einer schwach alkalischen 3. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch

   Lösung aufgelöst und dialysiert, worauf das p_H der gekennzeichnet, daß zur Alkalisierung NaOH ver-

   dialysierten Lösung auf 7,0 eingestellt und Natriumsulfat wendet wird.

   zugegeben wird, bis dessen Konzentration 7% erreicht. 65 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn-

   Nach Abtrennung einer gewissen Menge inaktiven zeichnet, daß zur Sauerstellung HCl oder CH₉COOH

   Niederschlags wird wiederum Natriumsulfat bei p_H 7,0 verwendet wird,
   zugegeben, um die Na₂SO₄-Konzentration auf 15°/₀ zu

   bringen; der entstehende aktive Niederschlag wird In Betracht gezogene Druckschriften:

   abgetrennt. 70 Deutsche Patentschriften Nr. 706 578, 719 026.

   ©909 627/385 9.59