DE1617566B1

DE1617566B1 - Verfahren zur Herstellung eines physiologisch aktiven Polypeptids

Info

Publication number: DE1617566B1
Application number: DE1967K0061478
Authority: DE
Inventors: Walter Dr Med Kuhlmey
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1966-02-22
Filing date: 1967-02-21
Publication date: 1971-06-09
Also published as: GB1142571A

Description

1 2

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Her- . bei der Anwendung des erfindungsgemäß hergestellten

stellung eines physiologisch aktiven Polypeptide. * Polypeptide zur Cholesterinspiegelsenkung besteht

Es sind nur wenige Polypeptide bekannt, die bio- dabei darin, daß es sich bei dem Polypeptid um eine

logisch wirksam sind, beispielsweise solche der Hirn- wenig toxische, eine große therapeutische Breite beanhangdrüse. Der Erfindung liegt die Aufgabe zu- 5 sitzende Substanz handelt, während die bekannten,

gründe, ein Verfahren zur Herstellung eines physio- zur Senkung des Cholesterinspiegels verwendeten

logisch aktiven Polypeptide zu schaffen, welches zur Medikamente häufig zu unerwünschten Nebenwirkun-

Cholesterinspiegelsenkung sowie zur Steigerung der gen im Organismus führen können.

17-Keto-Steroid-Ausscheidung geeignet ist. Weiterhin hat es sich überraschenderweise gezeigt,

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe bei einem io daß die 17-Keto-Steroid-Ausscheidung durch Ver-

Verfahren der eingangs genannten Gattung dadurch abreichung des erfindungsgemäß hergestellten Polygelöst, daß reticulo-endothelialreiche Organe von ■ peptids in signifikanter Weise gesteigert werden kann.

Säugetieren bei einer. Temperatur von nicht mehr als Es wurde gefunden, daß durch orale Verabreichung

45° C einer vollständigen enzymatischen Proteolyse von täglich 100 mg des erfindungsgemäß hergestellten

unterworfen werden, dann das Reaktionsgemisch von 15 Polypeptide die 17-Keto-Steroid-Ausscheidung erheb-

den unlöslichen Bestandteilen getrennt und daraufhin lieh gesteigert werden kann, während sie durch Testo-

das Polypeptid durch eine Polypeptidabtrennungs- steronverabreichung verringert wird. Damit steht ein

methode abgetrennt wird. Mittel zur Verfugung, mit dem die 17-Keto-Steroid-

AIs reticulo-endothelialreiche Organe kommen da- Ausscheidung älterer Menschen in physiologisch

bei Milz, Lymphdrüsen oder Knochenmark in Frage. 20 unbedenklicher Weise über eine lange Zeit gesteigert

Die Abtrennung des Polypeptids kann durch eine der werden kann.

üblichen Polypeptidabtrennungsmethoden, beispiels- Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Mt weise durch Salzfällung oder durch Phenolextraktion, erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die enzyma- ™ erfolgen. Das so gewonnene Konzentrat kann gege- tische Proteolyse durch Pepsin, Trypsin oder Papain, benenfalls noch in üblicher Weise gereinigt werden, 25 Ee hat sich überraschenderweise gezeigt, daß die beispielsweise durch isoelektrische Ausfällung von Proteolyse auch bei Verwendung von Trypsin oder Verunreinigungen, präparative Elektrophorese oder Papain nicht limitiert zu werden braucht. Die Pro-Säulenchromatographie. ·teolyse geht auch bei Verwendung dieser Substanzen

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren her- nicht bis zur Aminoeäure, sondern bleibt bei dem

gestellte physiologisch aktive Polypeptid besteht aus 30 erfindungsgemäßenPolypeptid stehen.Das erfindungs-

17 Aminosäuren und ist für parenterale, orale und gemäße Polypeptid ist oral anwendbar,

örtliche Anwendung geeignet. Das Polypeptid kann Es wurde gefunden, daß dier Proteolyse auch durch

außerdem noch eine braune prosthetische Gruppe. tierische Proteinasen, beispielsweise Kathepsine,

enthalten. Chymotrypsine oder Lab; pflanzliche Proteinasen,

Wenn man das nach dem erfindungsgemäßen Ver- 35 beispielsweise Bromelin oder Pomiferin; oder Bak-

fahren hergestellte Polypeptid hydrolieiert, werden terienproteinasen, z. B. Qostridiumarten oder bazillus

folgende Aminosäuren frei, wobei in Klammern subtilis, durchgeführt werden kann.

Mikromol Aminosäure pro 10 mg angegeben sind: Das Aussalzen" des physiologisch aktiven PoIy-

Lysin (5,18) Histidin (3,28), Arginin (4,35), Asparagin- peptids kann durch Alkalimetall-, Erdalkalimetall-,

säure (4,15), Threonin (5,15), Serin (3,29), Glutamin- 40 Ammonium- oder Aluminiumsalze erfolgen. Auch

säure (6,10), Prolin (6,54), Glycin (6,69), Alanin andere übliche Trennungsgänge, beispielsweise durch (5,85), Cystein (0,92), VaHn (5,56), Methionin (0,70), '. wasserlösliche organische Lösungemittel oder durch

Ieoleucin (2,87), Leucin (6,02), Tyroein (2,46), Phenyl- Lösen in einer teilweiee wasserlöslichen Substanz, ^

alanin (4,27). beispielsweise Phenol, können angewandt werden. Die fj

Das Molekulargewicht des Polypeptids beträgt 45 durch Aussalzen gewonnenen Konzentrate eignen sich

weniger als 5000. Das physiologisch wirksame Poly- vornehmlich zur oralen Anwendung,

peptid verhält sich wie ein reines Polypeptid sowohl Wenn das physiologisch aktive Polypeptid zur

bei Chromatographie als auch bei Papierelektro- parenteralen Anwendung kommen soll, ist ein weite-

phorese. Der isoelektrische Punkt liegt bei pH 5,5. r . rer Reinigungsvorgang wünschenswert. Eine Reini-

Der Rf-Wert dee Polypeptids liegt in Partridge- 50 giing kann in einfacher Weise durch isoelektrische

Lösung zwischen 0,5 und 0,6. Die spezielle Stoff- Ausfällung, durch Säulenchromatographie mit An-

wechselwirkung des erfindungsgemäßen Polypeptids ionen- oder Kationenaustauscherharzen, Dextrangel-

besteht in einer Senkung des Cholesterinspiegels im Anionen- oder- K-ationenaustauscher-Hj-Cellulose, SiIi-

Blut sowie in einer Steigerung der 17-Keto-Steroid- , kagel, Aluminiumoxyd oder andere Absorbentien,

Ausscheidung. ~ 55 oder durch Elektrophorese erfolgen. Die Reihenfolge

Das erfindungsgemäße Polypeptid ist durch seine der Reinigungsvorgänge ist beliebig und in das Ervorgenannten physikochemischen Daten und pharma- messen des Fächmannes gestellt,
kologischen Eigenschaften definiert. Zum besseren Verständnie der Erfindung sind im

Dae nach dem erfindungegemäßen Verfahren her- folgenden mehrere Aueführungebeispiele angegeben,

gestellte Polypeptid eignet sich vorzüglich dazu, den 60 τι · · 1 1

Choleeterinepiegel im menechlichen Blut zu eenken, Beispiel 1 _;

der insbesondere bei älteren Menschen häufig über- 5 kg frisch zerkleinerte Rindermilz wurden bei

höht ist und hierdurch zur Arteriosklerose führen 40° C 24 Stunden mit 5 g Pepsin 1:1000 der Proteo-

kann. Es wurde gefunden, daß durch orale Anwen- lyse unterworfen, wobei 5 1 destilliertes Wasser zu-

dung von täglich 100 mg des erfindungsgemäß her- 65 gefügt wurden und der pH-Wert der Lösung mit

gestellten Polypeptids der Cholesterinspiegel bei einer Salzsäure auf 1,7 bis 1,9 eingestellt wurde. Daraufhin

großen Anzahl von Personen im Mittel um etwa 10 wurde das Reaktionsgemisch durch ein Papierfilter

bis 15% gesenkt werden konnte. Der große Vorteil gefiltert. Zu der klargefilterten Lösung wurden

32 Gewichtsprozent Natriumchlorid gegeben. Der auf diese Weise erhaltene Niederschlag wurde abgetrennt und getrocknet und war für orale Anwendung geeignet, vorzugsweise in Form von Tabletten oder Dragees.

Beispiel 2

5 kg Lymphdrüsen von Rindern wurden bei 40° C 72 Stunden mit 10 g Pepsin 1:1000 der Proteolyse unterworfen, wobei 5 1 destilliertes Wasser zugefügt wurden und der pH-Wert der Lösung mit Salzäure auf 1,7 eingestellt wurde. Daraufhin wurde das Reaktionsgemisch zentrifugiert. Zu der klaren Lösung wurden dann 20 bis 25 Gewichtsprozent Phenol gegeben. Die Phenolphase wurde von der Wasserphase im Scheidetrichter getrennt und das Phenol aus der Phenolphase durch Äther extrahiert. Das zurückbleibende Konzentrat, das das physiologisch aktive Polypeptid enthält, war an sich bereits in dieser Form für parenterale Verwendung geeignet. Zur weiteren Reinigung wurde jedoch das gesamte Konzentrat, das aus der Phenolphase durch Entfernen des Phenols gewonnen wurde, mit Wasser auf ein Trockengewicht von 10% verdünnt. Durch Zugabe von 7,472 g NaH₂PO₄ und 0,784 g Na₂HPO₄-2 H₂O wurde der pH-Wert dieser Mischung eingestellt, worauf der erhaltene Niederschlag durch Filtration oder Zentrifugieren entfernt wurde. Nach isotonischer Einstellung war das gereinigte Konzentrat zur parenteralen Anwendung geeignet.

Beispiel 3

5 kg frisch zerkleinerte Schweinemilz wurden bei 45° C und einem pH-Wert von 8,0 6 Stunden lang durch 125 g Trypsin (Ig = 40 000 Fuld-Gross-Einheiten) abgebaut, wobei 5 1 destilliertes Wasser zugefügt wurden und die Einstellung des pH-Wertes durch Natronlauge erfolgte. Die weitere Konzentrierung erfolgte wie im Beispiel 1.

Beispiel 4

5 kg frisch zerkleinerte Rindermilz wurden bei 45° C 10 Stunden mit 40 g rohem Papain behandelt, wobei 51 destilliertes Wasser zugefügt wurden und der pH-Wert der Lösung mit Natronlauge auf einen Wert von 7,0 eingestellt wurde. Die weitere Konzentrierung und Reinigung der Mischung erfolgte wie im Beispiel 2.

Beispiel 5

5 kg Knochenmark von Rindern wurden bei 40° C 72 Stunden lang mit 10 g Pepsin der Proteolyse unterworfen, wobei 51 destilliertes Wasser zugefügt wurden und der pH-Wert der Lösung mit Salzsäure auf 1,7 eingestellt wurde. Nach der Konzentrierung durch Phenolextraktion wie im Beispiel 2 wurde das Konzentrat durch Säulenchromatographie gereinigt.

Die Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids wurde wie folgt geprüft:

I. die Glykose roter Blutkörperchen von 1 Milliliter Blut wurde während einer Stunde vor und nach Verabreichung des Polypeptids anaerob geprüft. Nach der Zugabe des Polypeptids war die Glykose vermindert. Dieses Ergebnis wurde auch 24 Stunden nach Verabreichung des Polypeptids gefunden.

Π. Die Glykose zweier Gruppen von Mäuse- oder Ratten-Acites-Tumorzellen wurde 6 bis 7 Tage nach Transplantation verglichen, die eine Gruppe nach Injektion einer isotonischen Salzlösung, die andere Gruppe nach Injektion einer Lösung des erfindungsgemäßen Polypeptids. Nach Behandlung mit dem Polypeptid war die Glykose vermindert.

Der Nachweis der Erythrozytenglykose kann beispielsweise nach einem Verfahren erfolgen, wie es in dem Artikel von W. Kuhlmey in »Das medizinische Laboratorium«, 19, Heft 1 (1966), angegeben ist.

Weitere therapeutische Eigenschaften des erfindungsgemäßen Polypeptids können sich aus der oben beschriebenen metabolischen Aktivität ergeben.

Das erfindungsgemäße, physiologisch aktive Polypeptid kann vorteilhaft mit einem oder mehreren pharmazeutischen Träger bzw. Trägern verwendet werden.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines physiologisch aktiven Polypeptids, dadurch gekennzeichnet, daß reticulo-endothelialreiche Organe von Säugetieren bei einer Temperatur von nicht mehr als 45° C einer vollständigen enzymatischen Proteolyse unterworfen werden, dann das Reaktionsgemisch von den unlöslichen Bestandteilen getrennt und daraufhin das Polypeptid durch eine Polypeptidabtrennungsmethode abgetrennt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteolyse mit Pepsin, Trypsin oder Papain erfolgt.