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Verfahren zur Herstellung eines cholesterinspiegel-
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senkenden Polypeptids aus reticulo-endothelreichen Organen von Säugetieren
und dessen Verwendung Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines
cholesterinspiegelsenkenden Polypeptids aus reticuloendothelreichen Organen von
Säugetieren.
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Cholesterinsenkende Polypeptide sind beispielsweise aus der DE-PS
16 17 566.9 bekannt, wobei bei diesem bekannten Verfahren reticulo-endothelreiche
Organe von Säugetieren bei einer Temperatur von nicht mehr als 45 0C einer vollständigen
enzymatischen Proteolyse unterworfen werden, anschließend das Reaktionsgemisch von
den unlöslichen Bestandteilen getrennt und daraufhin das Polypeptid durch eine Polypeptid-Abtrennungsmethode
abgetrennt wird.
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Diese bekannten physiologisch wirkenden Polypeptide besitzen die Wirkung,
daß sie alle Lipide im Blut unspezifisch senken.
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Die LipoProteine im Blut werden in Präbeta, Beta und Alpha-Lipoproteine,
je nach ihrem Verhalten in Ultrazentrifuge und Chromatographie aufgeteilt. Die neuere
Forschung hat als Risikofaktor für Arterienverkalkung aus den Cholesterinen das
Beta-Cholesterin festgestellt, es ist daher erstrebenswert, vor allem den Beta-Cholesterinspiegel
zu senken.
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Außer diesem Polypeptid der DE-PS 16 17 566, welches unspezifisch
die Cholesterinwerte, nicht gezielt auf die Beta-Lipoproteine, senkt, ist es weiterhin
bekannt, zur Senkung des Cholesterinspiegels Chlorphenoxyisobuttersäure, welches
unter dem generic name Chlofibrat im Handel ist, einzusetzen.
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Neuderdings häufen sich jedoch die Indizien dafür, daß Chlofibrat
schädliche Nebenwirkungen hat. Diese Verbindung und sämtliche Medikamente, die diese
Substanz oder deren Derivate enthalten, wurden daraufhin in der Abgabe beschränkt.
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Weiterhin wird Cholestyramin, die Chloridförm eines durch quaternäre
Amoniumgruppen basischen Ionenaustauschers, welcher auch unter dem HandelsnAmen
Quantalaneshältlich ist, eingesetzt. Dieses Quantala R stört jedoch erheblich den
Darmhaushalt und führt bei hohen Dosen zu verringerter Fettresorption und zu Steatorrhoe.
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Der Erfindung liegt also die Aufgabe zugrunde, einen neuartigen Beta-Cholesterin-Senker
zu liefern, ohne die schädliche Nebenwirkungen, die einige Präparate nach dem Stand
der Technik aufweisen, zu zeigen.
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überraschenderweise hat sich gezeigt, daß dadurch, daß reticuloendothelreiche
Organe von Säugetieren in an sich bekannter Weise bei einer Temperatur von nicht
wesentlich höher als 450C einer vollständigen enzymatischen Proteolyse
unterworfen
werden, und anschließend mechanisches Abtrennen der Feststoffe und Einengen und
Liophylisieren der Proteolyse-Lösung erfolgt, ein derartiges Glykopestid hergestellt
werden kann Das derart hergestellte Polypeptid zeigt in signifikanter Weise eine
Absenkung des Beta-Cholesteringehaltes.
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Dadurch, daß lediglich der mechanische Abtrennschritt durchgeführt
wird, beispielsweise Abtrennen der Gewebereste mittels Zentrifugation, Filtration
oder ähnlichem, kann ein Peptid-Gemisch erhalten werden, welches gegenüber dem Stand
der Technik offensichtlich Substanzen aufweist, die diese spezifische Wirkung hervorrufen.
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Überraschenderweise hat es sich gezeigt, daß die 17-Reto Steroidausscheidung
durch Verabreichung des erfindungsgemäß hergestelltem Polypeptids in signifikanter
Weise gesteigert werden kann. Insbesondere wurde gefunden, daß durch orale Verabreichung
von täglich etwa 40 mg der erfindungsgemäß hergestellten Peptidmischung die 17-Keto
Steroidausscheidung erheblich gesteigert werden kann.
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Damit steht ein Mittel zur Verfügung, mit dem in physiologisch unbedenklicher
Weise der Beta-Cholesteringehalt huber eine lange Zeit vermindert werden kann, ohne
die schädlichen Nebenwirkungen, wie sie beispielsweise Chlofibrat oder Cholestyramin
eigen sind, hervorzurufen.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
erfolgt die enzymatische Proteolyse durch Pepsin, Trypsin oder Papain. Es hat sich
überraschenderweise
gezeigt, daß die Proteolyse auch bei der Verwendung
von trypsin und Papain nicht limitiert zu werden braucht. Die Proteolyse schreitet,
da diese Enzyme nur spezifisch zwischen einzelnen Aminosäuren spalten, lediglich
bis zu der erfindungsgemäßen Polypeptid-Mischung fort, weshalb keineswegs in irgendeiner
Form eine Beendigung der Proteolyse durch Xnderung des pH-Wertes der Prateolyse-Lösung,
Abkühlung derselben oder ähnliches notwendig ist.
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Die Proteolyse kann auch durch tierische Proteinasen, beispielsweise
Sathepsine, Chymotrypsine oder Lab, pflanzliche Proteine, beispielsweise Bromelin
oder Pomiferin oder Bakterienproteinasen, beispielsweise aus Clostridiumarten od
oder Bazillus subtilis, durchgeführt werden.
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Es hat sich gezeigt, daß derartige SPaltungssrodukte die erfindungsgemäße
spezifische Beta-cholesterinsenkende Wirkung haben.
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Dadurch, daß die nach der Proteolyse hergestellte Lösung nach Abtrennen
der festen Bestandteile nicht weiter fraktioniert wird, ist es möglich, das Proteingemisch
mit dieser überraschenden selektiven Wirkung zu erhalten.
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Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus den Ansprüchen
und aus der nachfolgenden Beschreibung, in der Ausführungsbeispiele erläutert sind.
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Beispiel 1 5 kg frisch zerkleinerte Rindermilz wurden bei 45 0C 72
Stunden unter Zugabe von 10g Pepsin 1 : 1000 der Proteolyse unterworfen, wobei 5
1 Wasser zugef?ihrt wurden
und der pH-Wert der Lösung mit Salzsäure
auf 1,7 - 1,9 eingestellt wurde. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch durch einen
Papierfilter gefiltert. Die klare Lösung wurde eingeengt und gefriergetrocknet.
Das erhaltene Pulver eignet sich zur Herstellung von Tabletten oder Dragees.
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Beispiel 2 5 kg frisch zerkleinerte Lymphdrüsen von Rindern wurden
bei 400C 72 Stunden mit 10g Pepsin 1 : 1000 in 5 1 Wasser aufgeschlämmt und 72 Stunden
proteolysiert. Der pH-Wert der Lösung wurde zur Proteolyse.mit Salzsäure auf 1,7
eingestellt-. Nach Ende der Reaktionsdauer wurde das Reaktionsgemisch zentrifugiert
und das Zentrifugat verworfen.
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Der Uberstand wurde bis zur Trockene eingeengt und liophilisiert.
Der Rückstand ist das-erfindungsgemäß verwendbare Polypeptid.
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Beispiel 3 Beispiel 2 wurde wiederholt, wobei die Lymphdrüsen von
Rindern durch frisch zerkleinerte Schweinemilz ersetzt wurden.
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Beispiel 4 Die in Beispiel 1 beschriebenen Versuchsbedingungen wurden
eingehalten, wobei anstatt Pepsin 1 : 1000 40g rohes Papain verwandt wurde und der
pH-Wert der Lösung mittels Natronlauge auf einen Wert von 7,0 eingestellt wurde.
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Beispiel 5 Die in Beispiel 1 geschilderten Versuchsbedingungen wurden
wiederholt, wobei anstatt roher Rindermilz Knochenmark von Rindern eingesetzt wurde.
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Die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Polypeptids wurde in einer Studie
der Universitätskliniken Göttingen unterscuht. Es zeigte sich dabei bei einer Untersuchung
von 18 Patienten, insbesondere bei Personen mit hohem Beta-Cholesterinanteil, eine
signifikante Abnahme des.
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Betm-Cholesteringehaltes. Es wurden pro Person 40 mg/Tag des erfindungsgemäßen
Substanzgemisches gegeben, und die Werte vor der Gabe des wirksamen Peptid-Gemisches
und nach 21 Tagen Gabe des Peptidgemisches untersucht. Im folgenden werden drei
typische Patienten-Daten aufgeführt: Durchführung der Untersuchungen: 1981
A
N A L Y S E N B E F U N D E
| Normalbereich 1 I BESTANDTEIL (Dimesion) I Mittelwert VOR I
NACH 21 Tagen |
| I I I |
| I I I |
| 135 - 150 I NATRIUM ( mmol/l ) 1 142 I 139 |
| 3.5 - 5.0 I KALIUM ( mmol/l ) I 4.9 I 4.7 |
| 8.6 - 11 I CALCIUM ( mg/dl ) I 10.4 I 9.9 |
| 0.5 - 1.1 I KREATININ ( mg/dl ) I 0.9 I 1.1 |
| 5 - 25 I HARNSTOFF-N ( mg/dl ) I 9 I 10 |
| I I I |
| 2.5 - 4.5 I PHOS.ANDRG. ( mg/dl ) I 3.1 I 3.1 |
| 40 - 165 I EISEN ( mg/dl ) I 126 I 136 |
| 2.0 - 7.0 I HARNSAEURE ( mg/dl ) I 6.1 I 6.8 |
| 60 - 100 I GLUCOSE ( mg/dl ) 1 98 I 100 |
| BIS 1.2 I GES. BII.I. ( mg/dl ) I 0.7 I 0.8 |
| I I I |
| 6.2 - 8.6 1 GES.EIWEISS ( g/dl ) I 8 I 7.3 |
| 3.5 - 5.0 I ALBUMIN ( g/dl ) I 5 I 4.7 |
| BIS 18 1 GOT ( U/L ) 1 11 I 9 |
| BIS 22 I GPRT ( U/l ) I 15 1 10 |
| 60 - 170 1 AP ( U/1 ) I 102 I 105 |
| BIS 28 1 GAMMA-GT ( U/l ) 1 20 I 8.5 |
| I I I |
| 70 - 100 I QUICK ( % ) I 100 I 100 |
| 180 - 450 I FIBRINOGEN ( mg/dl ) I 250 I 250 |
| 15.5 - 17.5 I THROMBINZEIT ( sec ) I 17.2 I 16.9 |
| I I I |
| I CHOLESTERIN ( mg/dl ) I 258 I 229 |
| I TRIGLYCERIDE (mg/dl) I 246 I 142 |
| I I I |
| I BETA-CHOL. ( mg/dl ) I 182 I 166 |
| I PRAE-BETA-C. ( mg dl ) I 33 I 17 |
| I ALPHA-CHOL. ( mg/dl ) I 48 I 46 |
| I RATIO B/A-LP ( - ) I 1.5 I 1.5 |
| I I I |
A N A L Y S E B E F U N D E
| Normalbereich I BESTANDTEIL (Dimension) I Mittelwert MDR I
NACH 21 Tagen |
| I 1 I |
| I I 1 |
| 135 - 150 I NATRIUM ( mmol/l ) I 140 I 142 |
| 3.5 - 5.0 I KALIUM ( mmol/l ) 1 4.2 I 4.6 |
| 8.6 - 11 I CALCIUM ( mg/dl ) 1 10.1 I 10.9 |
| 0.5 - 1.1 I KREATININ ( ng/dl ) 1 1.2 1 1.1 |
| 5 -- 25 I HARNSTOFF-N ( ng/dl ) 1 12 I 12 |
| I I I |
| 2.5 - 4.5 I PHOS.ANDRG. ( mg/dl ) 1 2.9 I 2.6 |
| 40 -165 I EISEN ( myg/dl ) 1 138 1 156 |
| 2.0 - 7.0 r HARNSÄEURE ( mg/dl ) I 7.4 1 J 8.2 |
| 60 -100 I GLUCOSE ( mg/dl > I 93 1 92 |
| BIS 1.2 I GES.BILI. ( mg/dl ) I 0.8 I 0.9 |
| I I I |
| 6.2 - 8.6 I GES.EIBEISS ( g/dl ) 1 7.2 I 7.5 |
| 3.5 - 5.0 I ALBUMIN ( gZdl > 1 4.9 1 5 |
| BIS 18 1 - COT ( U/1 ) I 14 I 8 |
| BIS 22 I CPT ( Ull ) I 21. I 18. |
| 60 - 170 I AP ( Utl ) 1 73 I 67 |
| BIS 28 I GAHHA-GT ( U/l ) I 22. I 15. |
| I I I |
| 70 - 100 I QUICK ( X ) 1 10Ö I 100 |
| 180 - 450 I FIBRINOGEN ( mg/dl ) 1 210 I 260 |
| 15.5- 17.5 I THRDMBINZEIT( sec ) 1 17.9 I 15.9 |
| I I I |
| L ?- I CHOLESTERIN ( mg/dl > I 206 r 211 |
| I TRIGLYCERIDE( mg/dl ) I 237 I 255 |
| 1 I I |
| s 1 5 ° I BETA-CHOL, ( ms!dl > I 144 I 140 |
| I PRAE-BETR-C.( mg/dl ) 1 25 I 35 |
| 1 'ZC) I ÄLPHACHOL. ( mg/dl ) 1 37 I 37 |
| 7 t, 1 RATIO B/A-LP( - ) 1 1.6 1 1.5 |
| XL Ib 1 1 |
A N A L Y S E B E F U N D E
| Normalbereich I BESTNDTEIL (Dimesion) I Mittelwert VOR I NACH
2.1 Tagen |
| I I 1 |
| 1 1 1 |
| 135 - 150 I NATRIUM ( mmol/l ) I 142 I 142 |
| 3.5-5.0 I KALIUM ( mmol/l ) I 4 I 4.8 |
| 8.6 - 11 I CALCIUM ( mg/dl ) I 10.2 I 10.1 |
| 0.5 - 1.1 I KREATININ (mg /dl ) I 1.0 I 1 |
| 5 - 25 I HARNSTOFF-N (mg/dl) I 13 I 11 |
| I I I |
| 2.5 - 4.5 I PHOS.ANORG. ( mg/dl ) I 3.6 I 3 |
| 40 - 165 1 EISEN ( myg/dl ) I 83 1 103 |
| 2.0 - 7.0 1 HARNSAEURE ( mg/dl ) 1 5.3 1 5.6 |
| 60 - 100 I GLUCOSE (mg/dl) I 98 I 98 |
| BIS 1.2 I GES.BILI. ( mg/dl ) I 0.6 I 0.5 |
| I I I |
| 6.2 - 8.6 I GES.EIWEISS (g /dl) I 7.5 I 7.6 |
| 3.5 - 5.0 1 ALBUMIN ( g/dl ) I 5.2 1 5.1 |
| BIS 18 I GDT ( U/l) I 15 I 10. |
| BIS 22 I GPT ( U/l ) I 14 I 15 |
| 60 - 170 I AP ( U/l ) I 70 I 63 |
| BIS 28 I GAMMA-GT (U/l) I 17 I 12 |
| I I I |
| 70 - 100 1 QUICK ( % } I 100 I 100 |
| 180 - 450 1 FIBRINOGEN ( mg/dl ) 1 230 I 240 |
| 15.5 - 17.5 I THROMBINZEIT ( sec ) I 15.2 I 15.6 |
| I I I |
| I CHOLESTRIN ( mg/dl ) I 233 I 225 |
| I TRIGLYCERIDE ( mg/dl ) I 74 I 157 |
| I I I |
| I BETA-CHOL. ( mg/dl ) I 143 I 131 |
| I PRAE-BETA-C.( rg/dl ) 1 8 1 20 |
| I ALPHA-CHOL. ( mg/dl ) 1 83 1 74 |
| I RATIO B/A-LP( - ) I 0.7 I 0.7 |
| I I I |
Aus diesen Untersuchungen zeigt sich deutlich, daß die ß-Cholesterinsenkung
bei anomal hohen Werten, wie im Falle des Patienten Amargeet M, besonders drastisch
ist, während sie bei Patienten mit niedrigen Cholesterinwerten, Wie Heinrich W.,
nur wenig beobachtet wird.
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Die in der vorstehenden Beschreibung sowie in den Ansprüchen offenbarten
Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination
für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen wesentlich
sein.