DE2806181A1

DE2806181A1 - Neuer polysaccharidkomplex, verfahren zu seiner herstellung und arzneimittel

Info

Publication number: DE2806181A1
Application number: DE19782806181
Authority: DE
Inventors: Gianfranco Fedeli
Original assignee: Mediolanum Farmaceutici SpA
Current assignee: Mediolanum Farmaceutici SpA
Priority date: 1977-02-14
Filing date: 1978-02-14
Publication date: 1978-08-17
Also published as: FR2380301A1; IE46326B1; DK64078A; DK161973B; CA1106282A; IT1075117B; IE780222L; LU79021A1; NL188413B; NL7801682A; NL188413C; BE873842Q; SE443292B; JPS6159291B2; GB1564592A; SE7801631L; DE2806181C2; US4489066A; FR2380301B1; JPS53118510A

Description

PROF. DR. DR. J. REITSTÖTTER

j DR.-ING. WOLFRAM BUNTE

J DR. WERNER KINZEBACH

BAUERSTRASSE 22. D-SOOO MÜNCHEN 4O ■ FERNRUF (OS9) 37 65 S3 ■ TELEX 52IS2O8 ISAR D POSTANSCHRIFT: POSTFACH 7QO, D-8OOO MÜNCHEN Λ3

München, den 14. Februar 1978 j M/19 018 j

MEDIOLANUM FARMACEUTICI S.r.l. Via San Giuseppe Cottolengo, Mailand, Italien

Neuer Polysaccharidkomplex, Verfahren zu seiner j

Herstellung und Arzneimittel

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M/19 018

Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen Polysaccharidkomplex, sein Herstellungsverfahren und ein Arzneimittel, das diesen Komplex enthält und zur Heilung und Verhinderung von Arteriopathien brauchbar ist.

In den vergangenen Jahren wurden zahlreiche Medikamente vorgeschlagen, welche helfen sollen, verschiedene Lipidkomponenten im Serum auf normale Konzentrationen zurückzuführen, insbesondere im Hinblick auf die Ernsthaftigkeit von Hyper- und Dislipidämie in der Äthiopathogenese zahlreicher Erkrankungen, einschließlich solcher von sozialer Bedeutung. Diese Medikamente kann man entsprechend ihrer Wirkungsweise wie folgt schematisch einteilen:

1) Medikamente, welche die intestinale Absorption von Cholesterin inhibieren,

2) solche, die auf die Sekretion von Gallensäuren einwirken,

3) Medikamente, welche die Synthese von Cholesterin und die Mobilität der Fettsäuren des adipösen "Gewebes inhibieren,

4) diejenigen, welche die Fibrinolyse und Thrombolyse aktivieren,

und

5) solche Medikamente, welche die verstärkte Entfernung von Lipoproteinen begünstigen.

Unter den letztgenannten Arzneimitteln haben Heparin und analoge Substanzen, welche als Heparinoide bekannt sind, besondere Bedeutung bei der Behandlung von Hyper- und Dislipidämien gewonnen.

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Unter den zahlreichen pharmakologischen Wirkungsweisen von Heparin ist eine von besonderer Bedeutung, nämlich die sogenannte Klärungsaktivität, welche im wesentlich darin besteht, daß sie das Auftreten von Lipoproteinlipase im Blutstrom induziert, eines physiologischen Enzyms, welches die Esterbindungen von Triglvceriden spaltet und diese

I in Monoglyceride und freie Fettsäuren überführt. Diese Wirkung ; besteht neben der antikoagulierenden Wirkung des Heparins. Diese antikoagulierende Wirkung ist nachteilig und begrenzt die Anwendbarkeit von Heparin bei dieser Art von Therapie.

Auf dem Gebiet der antiarteriosklerotischen Therapie wurde ■ in Veröffentlichungen ( Comi and Coll., - Boll. Chinu Farm. ! 106/5/309/21 (1967); französische Patentschrift M 4 871, j einaereicht 24. November 1965) auch berichtet, daß bei j

I Kaninchen, welche durch cholesterinreiche Ernährung hyper- i cholesterinämisch gemacht wurden, die Verabreichung von ; Aorta-Gesamtauszügen eine starke Reduzierung der Atheromatose-j bildungen bewirkte. Andererseits wurde gezeigt (Dall'Occhi and ! Coll. Adv. Exi. Med. Biol. 1967 1,468/83), daß die Verabreichung von Aorta-Gesamtextrakten zu Immunreaktionen führt, welche \ schädliche Nebenwirkungen auf die Lungenarterien haben.

Erfindungsgemäß wurde nun gefunden, daß man einen speziellen Polysaccharid-Komplex mit anionischem Charakter aus der Aorta junger Säugetiere extrahieren kann, welcher überraschende anti-arteriosklerotische Eigenschaften hat und keinerlei schädliche Nebenwirkungen aufweist.

Dieser neue Komplex, der in der weiteren Beschreibung der Einfachheit halber FAPA genannt wird (arterieller Antiarteriosklerose Polysaccharid-Faktor), wird durch die folgenden chemischen Eigenschaften eindeutig charakterisiert:

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a) Bei der Hydrolyse werden Hexosamin, Uronsäuren und

j Sulphate in Molverhältnissen von etwa 1/1/1 mit

! variablen Mengen an Nukleosiden freigesetzt.

! Nach saurer Hydrolyse von FAPA ergibt eine Analyse

ί die folgende durchschnittliche Zusammensetzung der

j Polysaccharidkomponenten.

Hexosamin (Glucosamin): spezifische colorimetrische Reaktion des Amins in Hexosen mit p-Dimethylaminobenzaldehyd

üronsäure: spezifische colorimetrische Reaktion mit Carbazol

organisches SO.: In Übereinstimmung mit FU,. 8. Auflage, Band I, Seite 106, Abs. B

= 30 + 2,25 %

= 30,5 + 5 %

= 16,5 + 3

Na: Bestimmt durch Atomabsorption (nicht

routinemäßig) Asche

10 + 2 15 + 3

b) Elektrophoretisch trennt es sich in drei anionische Banden, .

welche mit Alcian Blau und Toluidine Blau unterscheidbar \ sind.

Die nachstehende Tabelle zeigt die relative elektrophoretische Mobilität der drei anionischen Banden.

Bande

Anodische Mobilität

mittlere densitometrische ■ Verhältnisse positiver | Toluidin-blau Banden \

1	U =	2	,2 +	0,5	β	10 ⁴Cm²V ¹sek.¹	1	14	+ 3 % ',
2	U =	2	,09 +	0,	5 ·	10"⁴Cm²V"¹sek.	1	9	+ 2 %
3	U =	1	,93 +	0,	05*	10"⁴On²V"¹ sek.	77	±8 %

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-Ί

ο) Er kann mit Alkali- und Erdalkalimetallen umgesetzt werden und bildet dabei Salze, welche in Wasser sehr gut löslich sind, wohingegen die Salze, die mit aliphatischen Aromoniumionen gebildet v/erden, unlöslich sind.

d) Das Natriumsalz ist zu 2 % in 50 %-igem Äthylalkohol löslich, während die freie Säure zu 2 % in 70 %-igem Äthylalkohol löslich ist.

e) Der Komplex reagiert mit Toluidin Blau, wobei sich eine minimale metachromatische Reaktion ergibt, (etwa 1/10 derjenigen von Heparin).

f) Spektrophotometrisch zeigt er ein Maximum bei 260 +_ 1 nm.

g) Er zeigt ein Drehvermögen bei polarisiertem Licht von -11° bis -22°

h) Das IR-Spektrum der Substanz in KBr, welches in Figur 1 dargestellt ist, ergibt die folgenden Funktionen:

- COOH

- NHR

- COCH₃

- OSO₃H

- CH₂OH

Aus der Gesamtheit der Analysenwerte '- kann festgestellt werden, das FAPA folgende Struktur hat:

NHR-

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COOH

OH

NHR₃

worm R, und

für -H oder -SO₃H stehen,

R₃ für -SO₃H oder -CO-CH₃ steht, und

m, η und ρ ganze Zahlen sind, welche in einem großen Bereich variieren können und Molekulargewichte von 10 000 bis 30 000 Dalton für die Polysaccharidketten bezeichnen.

Diese Eigenschaften und insbesondere die Molverhältnisse der Bestandteile, welche nach der Hydrolyse erhalten werden, zeigen, daß FAPA chemisch als ein Molekülkomplex bezeichnet werden kann, der aus Hexosaminglycanmonosulfaten besteht (Chondroitinsulfate B und C und Heparitinsulfate der Arterienwand ) .

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Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von FAPA ist dadurch gekennzeichnet, daß man

1) die Aorten junger Säugetiere, die soeben geschlachtet !

wurden, entfernt und sofort mahlt,

2) diese Gewebe in Wasser oder geeigneten Kochsalzlösungen ι homogenisiert und suspendiert, j

3) unter optimalen pH-Werten, Temperatur- und Zeitbedingungen ] mit proteolytischen Enzymen, wie Trypsin, Chymotrypsin, j Pankreatin, Papain, Ficin oder Bromelin behandelt, j

4) die so behandelte Flüssigkeit durch Filtrieren entfernt und sammelt,

5) aus der so erhaltenen Flüssigkeit FAPA durch mit Wasser mischbare Lösungsmittel ausfällt und/oder mit aliphatischen Ammoniumionen unlösliche Salze bildet, und

6) reinigt, indem man mit Alkali- oder Erdalkalimetallbasen in ein Salz überführt, mit Permanganat entfärbt, bei

70 ⁰C mit Alkali behandelt, um die Endglieder der verbleibenden Peptidketten zu entfernen, und das gewünschte j Salz {Natrium-, Kalium-, Calciumsalze, etc.) mit Hilfe ! von Lösungsmitteln abtrennt, filtriert, sterilisiert und j lyophilisiert.

Hinsichtlich seiner pharmakologischen Eigenschaften wurde j FAPA im Vergleich mit bestimmten antiarteriosklerotischen j Präparaten der vorgenannten Arten, insbesondere im Vergleich mit Heparin, dem klärenden Arzneimittel bei Antonomasie,

und mit Aorta-Gesamtextrakt, untersucht.

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Die folgenden grundlegenden Eigenschaften wurden bei Experimenten in vivo bestimmt:

1. Wirkung auf experimentell herbeigeführte Arterlosklerose

Diese Untersuchung wurde an Kaninchen durchgeführt, welche in Gruppen von 5 Tieren eingeteilt und mit

einer cholesterinreichen heterogenen Diät ernährt wurden.

Es wurde das Blut der Tiere untersucht, um die veresterten Fettsäuren (EFA), das Gesamtcholesterin, die beta-Lipoi proteine und die Koagulationszeit zu bestimmen. Ferner

J wurde der Cholesteringehalt des Aortagewebes und das i

Auftreten von Atheromen untersucht.

Tabelle I faßt die Ergebnisse zusammen, welche nach 40-tägiger Behandlung unter Verwendung von FAPA, Heparin und Aorta-Gesamtextrakt erzielt wurden.

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TABELLE

EFA Cholesterin B-Lipoproteine Koagulations- Aorta-Chol-

mg/100 ml mg/100 ml mg/100 ml Serum zeit esterin mg/100g Atherome

Serum Serum log. Min. Trockensubstanz

vo
ο
oo

OO O CO OO (O Oi

Kontrolle FAPA 1 mg/kg FAPA 10 mg/kg Heparin 1 mg/kg Heparin 10 mg/kg

456 ± 180 _+ 162 _+ 171 + 138 +

ADrtagesamt-

extrakt, 1 mg/kg 430 _+

Aorta-Gesamtextrakt, 10 mg/kg 218 Jj₁

215 _+ 90 * 76 _+

78 £

76 +,

190 +_ 97 +

78 Jt₁ 40 _+ 2,5

35 J₁ 38 + 30 J₁

79 +,

36 +

0,78 +_ 0,06
0,81 +_ 0,04
0,9 +_ 0,04
1,9 + 0,4
2,3 + 0,8

2,85 +_ 0,12 1,98 +_ 0,08

1.7 +_ 0,04 2 +_ 0,05

1.8 + 0,03

0,75 + 0,1 2,9 + 0,2

0,78 + 0,1 1,6 + 0,04

4 + = starkes Auftreten von Atheromen hinsichtlich Anzahl und Ausdehnung

2 ++ = etwa 50 % im Vergleich zur Kontrolle

1 + = Auftreten etwa gleich dem bei normalen Kaninchen.

2. Biologische Aktivität

Hinsichtlich der biologischen Aktivität wurde die antikoagulierende Wirkung (gemäß USP) und die Klärungsaktivität bei Ratten (Morton Grosman Verfahren J. Lab. and Clin. Med. March 1954, Seite 445) bestimmt. Bei der Bestimmung des letztgenannten Parameters wurden einige Veränderungen vorgenommen, um die Wirkung in internationalen Lipase-Einheiten (ULI) gemäß der UIB Definition (International Biochemical Union) ausdrücken zu können, wobei eine internationale Einheit (ULI) gleich der Aktivität ist welche das Substrat in einer Geschwindigkeit von 1. Micromol pro Minute umwandelt.

Die Ergebnisse der bioligischen Untersuchungen von FAPA sind in Tabelle II im Vergleich mit Heparin und Aorta-Gesamtextrakt zusammengefaßt.

Tabelle II

HeOarin Aortaextrakt FAPA

antikoagulierende

Wirkung (USP/mg) 135 - 148 etwa 0,5 5-15

Klärungsaktivität
(ULI/1 Plasma) bei
einer Dosis von 0,5 mg/kg 480 + 100 15+_7 270+_ 80

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3. Produkt-Verträglichkeit

a) Toxizität:

FAPA wird von Ratten, Kaninchen und Meerschweinchen, sowohl bei parenteraler als auch bei oraler Verabreichung von täglichen Dosen von 200 mg/kg gut vertragen.

b) Immunologische Versuche:

Bei Meerschweinchen, welche mit FAPA behandelt wurden, ergaben immunologische Versuche auf Antikörper und Anaphylaxie weder eine Antikörper- noch eine anaphylaktische Reaktion.

c) Vasokinetische Untersuchungen; Es ergaben sich keine Auswirkungen weder des Histamin- noch des Adrenalintyps, sogar bei Dosen von 50 mg/kg.

Alle vorgenannten Versuche zeigen, daß FAPA als antiarter iosklerotisches Medikament verwendet werden kann, da seine Aktivität in der Größenordnung der des Heparins liegt, jedoch ohne das Risiko von Hämorrhagien, welche für die letztgenannte Substanz typisch sind.

Andererseits ist die biologische Aktivität von FAPA etwa zehnmal größer als die von Aorta-Gesamtextrakt, jedoch ohne immunologische Nebenwirkungen, was einen· wesentlichen Vorteil in Bezug auf die Posologie und die Gefahr der Sensibilisierung während der Therapie bedeutet. Nachstehend sind einige praktische Beispiele für die Herstellung des erfindungsgemäßen Polysaccharid-Komplexes aufgeführt, die jedoch nicht einschränkend sein sollen„

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Beispiel

50 kg Kalbsarot werden fein gemahlen und in 66 1 Wasser homogenisiert. Nachdem man die Masse langsam auf 50 ⁰C er- ! hitzt hat, gibt man 0,6 kg Papain zu, das zuvor in 9 1 j Wasser, welches 10 g Natrium-meta-bisulfit enthielt, suspendiert wurde.

Man erhitzt die gesamte Masse auf 65 ⁰C und läßt sie unter diesen Bedingungen 3 Stunden stehen, wobei man durch entsprechende Alkalizugabe dafür sorgt, daß der pH nicht unter 6 absinkt. Nach dieser Zeit erhitzt man die Masse 15 Minuten lang auf 95 ⁰C, läßt 30 Minuten stehen und filtriert dann über ein mit Filtererde beschichtetes Tuch.

Man gibt 0,6 kg Cetyltrimethylammoniumchlorid, gelöst in 35 Wasser zu dem Filtrat und nachdem man über Nacht stehen gelassen hat, wird die überstehende Flüssigkeit abgesaugt. Der Niederschlag wird durch Filtrieren gesammelt und in 25 1 Wasser, das 3 kg Natriumchlorid enthält gelöst, indem man auf 70 ⁰C erhitzt. Diese Lösung wird durch Filtrieren geklärt. Das Filtrat wird mit einem gleichen Volumen Aceton behandelt. Man wäscht den Niederschlag, nämlich das rohe Natriumsalz von FAPA_y mehrmals mit 70 %-igem Aceton und trocknet dann. Auf diese Weise erhält man 85 g des rohen Natriumsalzes von FAPA.

Man wäscht diesen Niederschlag dann in 1500 ml Wasser, stellt den pH auf 8 ein und behandelt dann mit 1,5 g Kaliumpermanganat und erhitzt allmählich auf 90 C. Der gebildete Niederschlag wird durch Abfiltrieren entfernt. Man stellt den pH des Filtrats mit Natriumhydroxyd auf 11 ein und läßt es 10 Stunden bei 70 ⁰C stehen.

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Danach kühlt man die Flüssigkeit, stellt den pH mit Chlorwasserstoff säure auf 7 ein und filtriert über eine 0,8 micron j Membran. Die erhaltene Flüssigkeit behandelt man dann mit ! 2 Volumina Äthylalkohol. Nachdem man 2 Stunden stehen gelassen ! hat, wird der Niederschlag durch Filtrieren gesammelt und ι mit 500 ml 75 %-igem Alkohol gewaschen. ! Dann löst man den Niederschlag in 800 ml Wasser und engt ein, j bis der Alkohol entfernt ist. Man filtriert das Konzentrat über eine 0,2 micron Membran und lyophilisiert das klare

Filtrat. i

Auf diese Weise erhält man 42 g des Natriumsalzes von FAPA; welches folgende Eigenschaften aufweist:

Uronsäure 35 %

Hexosamin 30,5 %

-SO₃Na 18,1 %

-Nucleoside 5,2 %

anorganische Salze 8 % (hauptsächlich Chloride)

Klärungs-Aktivität 210 +_ 20 ULI/1

antikoagulierende Aktivität 6 UI/mg

Beispiel

Man verarbeitet 50 kg Schweine-Aorta wie in Beispiel 1 beschrieben und erhält 36 g des Natriumsalzes von FAPA, dessen chemisch-physikalische Eigenschaften denen gemäß Beispiel 1 fast analog sind und welches eine Klärungsinduktions-j-Aktivität von 180 + 30 ULI/1 hat.

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Beispiel 3

Man lysiert 50 kg Kalbsaorta mit Ficin anstelle von Papain und arbeitet ansonsten wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Ausbeute beträgt 35 g des Natriumsalzes von FAPA mit chemisch-physikalischen Eigenschaften, die denen gemäß Beispiel 1 fast analog sind; die Klärungs-Aktivität beträgt 280 + 40 ULI/1.

Beispiel

Man homogenisiert 50 kg Kalbsaorta in 150 1 Wasser und lysiert mit 2 kg Pankreatin bei pH 8 und 40 ⁰C während 24 Stunden, in Gegenwart von Toluol als Bakteriostatikum.

Nach dem Abfiltrieren wird die klare Flüssigkeit mit 3 Volumina Aceton behandelt. Den erhaltenen Niederschlag hydrolysiert man 15 Stunden mit Alkali bei pH 11 und 70 ⁰C. Nach dem Abfiltrieren behandelt man die Flüssigkeit mit 400 g Cetylpyridiniumchlorid, wobei man dann das entsprechende unlösliche Ammoniumsalz von FAPA erhält. Den Niederschlag löst man dann in 1500 ml Wasser, das 90 g Calciumchlorid enthält. Nach dem Abfiltrieren wird die Flüssigkeit bei pH 8 mit 1 g Kaliumpermanganat behandelt, auf 90 ⁰C erhitzt und abfiltriert. Das Filtrat wird 15 Stunden lang gegen einen Wasserstrom dialysiert, um überschüssige Salze zu entfernen, dann durch eine 0,45 j micron Membran abfiltriert und lyophilisiert.

Auf diese Weise erhält man 35,5 g des Calciumsalzes von FAPA,

j dessen chemisch-physikalische Eigenschaften denen des Produkts j gemäß Beispiel 1 fast analog sind, wobei die Klärungsinduktions·¹· aktivität 315 + 30 ULI/1 beträgt.

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Claims

Patentansprüche

.' Arterieller Polysaccharid-Komplex mit anionischem -

Charakter, gekennzeichnet durch Hexosamin-glycanmonosulfate (FAPA) erhältlich aus der Aorta junger Säuge-

tiere, welcher die folgenden Eigenschaften aufweist: !

a) Bei saurer Hydrolyse werden Hexosamin und Uronsäuren i in einem Molverhältnis von etwa 1/1 zusammen mit variablen Mengen an Nucleosiden freigesetzt;

b) elektrophoretisch trennt er sich in drei anionische Banden auf, welche mit Alcian Blau und Toluidin Blau

! sichtbar gemacht werden können;

c) er reagiert mit Alkali- und Erdalkalimetallbasen,

ι wobei sich wasserlösliche Salze bilden, während mit aliphatischen Ammoniuminionen wasserunlösliche Salze ] entstehen;

d) das Natriumsalz ist zu 2 % in 50 %-igem Äthylalkohol löslich, wohingegen die freie Säure zu 2 % in

70 %-igem Äthylalkohol löslich ist;

e) er reagiert mit Toluidin Blau, wobei sich eine minimale metachromatische Reaktion ergibt;

f) spektrophotometrisch zeigt sich ein Maximum bei 260 +

ι —

j nm; '· j

h) das Drehverraöcren bei polarisiertem Licht beträgt -10° bis; j -22°.

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ORiGiMAL !WSFECTED

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2. Verfahren zur Herstellung eines arteriellen Polysaccharidkomplexes nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man:

1) die Aorta junger Säugetiere isoliert und unmittelbar nach dem Schlachten fein vermahlt;

2) die vermahlene Substanz homogenisiert und in Wasser oder Kochsalzlösung suspendiert;
3) auf die Suspension proteolytische Enzyme, wie Trypsin, Chymytrypsin; Pankreatin, Papain, Ficin oder Bromelin unter den entsprechenden optimalen pH-Werten und Temperatur- und Zeitbedingungen einwirken läßt;
4) die so behandelte Flüssigkeit durch Filtrieren abtrennt und sammelt;
5) den FAPA aus dieser Flüssigkeit durch mit Wasser mischbare Lösungsmittel und/oder durch Bildung unlöslicher Ammoniumsalze ausfällt, und
6) den FAPA reinigt.

Therapeutisches Mittel, enthaltend als Wirkstoff einen arteriellen Polysaccharidkomplex gemäß Anspruch 1 in einem üblichen pharmazeutischen Träger, gegebenenfalls in Verbindung mit weiteren Arzneimittelzusätzen.

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